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β-雌二醇诱导型启动子的构建及其在酿酒酵母神经酸合成中的应用

2020-12-08阅读(368)

β-雌二醇诱导型启动子的构建及其在酿酒酵母神经酸合成中的应用

论文摘要

酿酒酵母是异源基因表达的重要工业宿主菌株,具有表达系统完整,培养简单,基因操作方便等优点。β-雌二醇诱导型启动子系统对于酿酒酵母完全是外源调控元件,非目标转录效应少,可以方便地控制基因的表达,为酿酒酵母相关研究提供极大的实验灵活性。神经酸是大脑神经组织和神经细胞的核心组成部分,对治疗精神病、过氧化物酶体疾病、糖尿病、艾滋病等病症有效。然而,有限的来源限制了神经酸的大规模生产和应用。因此,有必要探索利用生物转化与转基因生物合成方法,提高酿酒酵母合成神经酸的能力,以满足市场需求。本文研究以营养缺陷型酿酒酵母YS58作为出发菌株,设计并合成不受葡萄糖抑制的普适分子生物学工具β-雌二醇诱导型启动子作为代谢调控的元件,并应用于神经酸合成基因的调控探究。1、成功构建了 β-雌二醇诱导型启动子系统。在酿酒酵母YS58中以pRS416和YEplac112为出发质粒,成功构建β-雌二醇诱导型启动子重组质粒载体系统（pRS416-PReGall-GFP-TCYC、YEplac 1 1 2-PTEF1-Aritificial transativator-T cyc）。2、优化了 β-雌二醇诱导型启动子的诱导条件。检测条件为:在酶标仪中475 nm激发光和509 nm的发射光检测GFP的表达量,诱导浓度为0-0.1μM,热诱导条件为每隔8小时在37℃下进行15分钟热诱导。在此条件下,β-雌二醇诱导型启动子在酿酒酵母中可以获得更优秀的调控能力。3、探究了利用β-雌二醇诱导型启动子在酿酒酵母YS58体系中生产神经酸。利用β-雌二醇诱导型启动子构建重组质粒pRS416-PReGall-KCS-TCYC、pRS416-PReGall-FAE1-TCYC和pRS416-PReGall-ELOVL1-TCYC,在酿酒酵母中构建并加强神经酸合成途径。结果显示,表达ELOVL1基因表达的菌株,神经酸含量能达到0.57%;其次是KCS基因表达的菌株神经酸含量为0.48%;而FAE1基因表达的菌株神经酸含量最高能达到0.39%。4、探究了敲除Elo2基因对酿酒酵母神经酸合成的影响。首先构建了Elo2△-β-Estradiol酿酒酵母菌株,以此为基础构建了Elo2△-β-Estradiol-ELOVLl、Elo2△-β-Estradiol-KCS 和 Elo2△-β-Estradiol-FAEl三种酿酒酵母菌株。对以上三种菌株进行发酵培养,Elo2△-β-Estradiol-ELOVL1菌株神经酸含量最高,达到0.68%;其次是Elo2△-β-Estradiol-KCS菌株神经酸含量达到0.60%;而Elo2△-β-Estradiol-FAE1神经酸含量为0.51%。与未敲除Elo2基因的菌株相比,敲除Elo2基因的三种酿酒酵母菌株神经酸含量分别提升了 19.3%,25.0%和30.7%。

论文目录

  • 学位论文数据集
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  •   1.1 酿酒酵母表达载体概述
  •   1.2 酿酒酵母启动子概述
  •     1.2.1 酿酒酵母启动子
  •     1.2.2 β-雌二醇诱导型启动子概述
  •     1.2.3 β-雌二醇诱导型启动子的原理
  •   1.3 神经酸合成及应用
  •     1.3.1 神经酸概述
  •     1.3.2 神经酸的合成方法
  •     1.3.3 神经酸的代谢工程
  •   1.4 基因编辑技术
  •     1.4.1 基因编辑技术简介
  •     1.4.2 CRISPR-Cas9简介
  •   1.5 课题研究目的与思路
  •     1.5.1 本课题的研究思路
  •     1.5.2 本课题的研究内容及意义
  • 第二章 β-雌二醇诱导型启动子系统的构建
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验材料
  •     2.2.1 实验菌株、质粒、引物
  •     2.2.2 实验相关试剂、仪器
  •     2.2.3 实验相关培养基
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 基因扩增
  •     2.3.2 酶切和连接
  •     2.3.3 重组质粒转化与与阳性克隆筛选
  •     2.3.4 测序验证
  •     2.3.5 质粒提取
  •     2.3.6 酵母转化
  •     2.3.7 摇瓶培养
  •     2.3.8 荧光检测
  •   2.4 实验结果与分析
  • TEF1-Aritificial transativator-TCYC重组质粒的构建'>    2.4.1 YEplac112-PTEF1-Aritificial transativator-TCYC重组质粒的构建
  • ReGall-GFP-TCYC重组质粒的构建'>    2.4.2 pRS416-PReGall-GFP-TCYC重组质粒的构建
  •     2.4.3 β-雌二醇诱导型启动子的荧光检测
  •     2.4.4 GFP激发波长的确定
  •     2.4.5 β-雌二醇对酿酒酵母生长的影响
  •     2.4.6 β-雌二醇诱导量的确定
  •     2.4.7 热诱导对β-雌二醇诱导型启动子的影响
  •     2.4.8 不同培养基发酵荧光强度
  •   2.5 本章小结
  • 第三章 β-雌二醇诱导型启动子对神经酸合成的影响
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验材料
  •     3.2.1 实验菌株、质粒、引物
  •     3.2.2 实验相关试剂、仪器
  •     3.2.3 实验相关培养基
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 重组菌株的构建
  •       3.3.1.1 质粒构建
  •       3.3.1.2 酵母转化
  •     3.3.2 重组菌株的摇瓶发酵
  •     3.3.3 产物的提取与检测
  •   3.4 实验结果与分析
  • ReGall-KCS-TCYC重组质粒的构建'>    3.4.1 pRS416-PReGall-KCS-TCYC重组质粒的构建
  • ReGall-FAE1-TCYC重组质粒构建'>    3.4.2 pRS416-PReGall-FAE1-TCYC重组质粒构建
  • ReGall-ELOVL1-TCYC重组构建'>    3.4.3 pRS416-PReGall-ELOVL1-TCYC重组构建
  •     3.4.4 S.cerevisiae-β-Estradiol模拟神经酸发酵结果
  •     3.4.5 KCS、FAE1、ELOVL1搭载β-雌二醇诱导型启动子发酵结果
  •   3.5 本章小结
  • 第四章 基因敲除酿酒酵母Elo2基因对神经酸合成的影响
  •   4.1 引言
  •   4.2 实验材料
  •     4.2.1 实验菌株,质粒,引物
  •     4.2.2 实验试剂,仪器
  •     4.2.3 实验相关培养基
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 gRNA处理
  •     4.3.2 Donor PCR
  •     4.3.3 Donor乙醇沉淀法
  •     4.3.4 Godlen Gate
  •     4.3.5 Donor基因片段和Guide RNA-Cas9质粒共转进入YS58
  •     4.3.6 转化后修复培养
  •     4.3.7 酵母基因组DNA提取
  •   4.4 实验结果与分析
  •     4.4.1 CRISPR-Cas9敲除Elo2基因
  •     4.4.2 发酵结果分析
  •   4.5 本章小结
  • 第五章 结论与展望
  •   5.1 结论
  •   5.2 创新点
  •   5.3 问题与展望
  • 参考文献
  • 附录
  •   附录一 常用的培养基配方和实验试剂
  •   附录二 PCR、酶切,连接等体系
  •   附录三 常用实验相关仪器
  • 致谢
  • 研究成果及发表学术论文
  • 作者及导师简介
  • 附件

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 王韬

    导师: 刘军锋,王晓萍

    关键词: 酿酒酵母,诱导型启动子,雌二醇,神经酸

    来源: 北京化工大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 北京化工大学

    分类号: Q78

    DOI: 10.26939/d.cnki.gbhgu.2019.000818

    总页数: 110

    文件大小: 9603K

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