洪文荣[1]2004年在《依尼奥小单孢菌原生质体融合育种及其分子生物学研究》文中指出西索米星,临床上重要的的氨基糖苷类抗生素,属4,6—双取代2—脱氧链霉胺类抗生素,由依尼奥小单孢菌产生。本研究采用细胞融合和分子生物学技术对依尼奥小单孢菌进行研究。筛选到了西索米星高产菌种S96,并从中克隆到了西索米星高抗性基因sisR。 从产抗生素的伊尼奥小单孢菌T125的原生质体融合试验研究中得到了菌株S96,根据培养特征比较,其菌丝形态,斜面培养,碳源利用和浸没培养等特征均不同于出发菌株。菌株S96几乎不产生色素,不利用可溶性淀粉,不产生孢子。其浸没培养的优良特征是出发菌所没有的。 对菌株S96的培养特性进行了研究,应用正交试验和数理统计对发酵培养进一步优化,精选出一组适合于S96发酵生产的培养基配方。根据溶氧曲线,优化发酵工艺,获得了一套较适合于菌株S96的代谢曲线特性,按照该曲线特性进行调控,可使西索米星的中试生产水平接近于摇瓶的生产水平,西索米星最高发酵单位可达1600μg/ml。 从产西索米星的依尼奥小单孢菌中克隆高抗性新基因sisR。以grmA基因(来自产庆大霉素的绛红色小单孢菌的抗性基因)为模板,设计PCR引物,从西索米星的产生菌依尼奥小单孢菌的染色体DNA中,经PCR扩增获得了序列长度不等的DNA片段。将这些DNA片段克隆至pUC19载体质粒并导入大肠杆菌,从中筛选到5个抗西索米星的转化子,其中一个命名为pLY102(插入片段命名为LY102,含sisR基因),显示对西索米星的高抗性(超过1000μg/ml)。经DNA测序并通过互联网Blast比对,确认对该抗性负责的DNA片段是一个未见报道的新基因。 将全长为849bp的LY102片段克隆到pUC19/18载体上构建质粒,抗性基因sisR依靠它自带的启动子和核糖体位点(GGAGG)在大肠杆菌DH5α中表达。基因sisR的表达不受载体上lacZ启动子的控制,其转录是自动发生的。序列中含有两个开放阅读框(orf),对抗性负责需两个orfs协同作用。将预测的sisR基因的氨基酸序列与16SrRNA甲基化酶的氨基酸序列比对表明:与grmB(来自玫瑰小单孢菌甲基化酶基因)、grmA(绛红色小单孢菌甲基化酶基因)和sgm(来自兹昂小单孢菌的甲基化酶基因)的氨基酸序列有很高的同源性,依次为92%、87%和85%。
李金良[2]2012年在《Sisomicin高产菌株选育与发酵优化研究》文中认为Sisomicin (西索米星)是一种新的氨基糖苷类广谱抗生素,对大多数革兰氏阳性和阴性菌有很强的抗菌作用。它的半合成化合物奈替米星有高效低毒的特性,是氨基糖苷类抗生素中较理想的一个品种,中国生产的西索米星原料药约占世界产量的80%,近几年国内外市场对西索米星和奈替米星的需求仍在不断上升。为进一步提高sisomicin的产量,巩固我国在sisomicin原料药生产的垄断地位,本研究对海洋Streptomyces sp. GB-2进行化学诱变、氮离子束注入诱变结合抗性筛选诱变育种研究,筛选得到高产菌株后进行发酵条件优化和液体深层发酵工艺研究,得出以下研究结果：1.采用纸片法和杯碟法进行效价测定,用叁剂量法进行生物检定统计,测得海洋Streptomyces sp. GB-2的生物效价为387.0289U/mL。通过对比纸片法和杯碟法实验结果得出,纸片法和杯碟法测定结果同样可靠,重现性良好。在海洋Streptomyces sp. GB-2发酵优化和诱变育种过程中可先用纸片法确定各优化方案中效价的相对大小,选出较优者用杯碟法进行精确测定。将两种方法结合在一起使用,既可以降低成本,又可以加大样品检测数量,大大提高了工作效率2.采用PB设计(Plackett-Burman Screening Design)对影响海洋Streptomyces sp.GB-2产sisomicin的9个因素进行了筛选。结果表明：影响该菌发酵生产sisomicin的主要因素为黄豆粉、葡萄糖、温度和转速。在此基础上,采用RSM响应面法(Response Surface Methodology)对其4个显着因子的最佳水平进行研究。通过对二次多项回归方程求解得知,相关系数R2为0.9833,在上述自变量分别为黄豆粉11.95g/L、葡萄糖2.96g/L、温度28℃、转速183r/min条件下,sisomicin的效价从387.03U/mL提高到了726.11U/mL,产量提高了87.61%。3.采用复合诱变结合抗性筛选、N+注入诱变等手段对海洋Streptomyces sp.GB-2进行诱变育种处理。单孢子悬浮液经预处理后,先通过单因素诱变确定诱变剂的种类和剂量,再将LiCl溶液和孢子悬浮液1：1混合,30℃保温处理30min,吸取1mL处理液与NTG溶液1：1混合,30℃保温处理30min后涂布在含有不同浓度、不同种类的抗生素平板上,进行初筛和复筛,挑选抑菌圈直径较大的菌株进行传代稳定性研究。挑取海洋Streptomyces sp. GB-2菌株和诱变高产菌株进行N+注入诱变,注射剂量为25kev,注射时间分别为0s、5s、10s、15s、20s、25s、30s,存活率随注射时间的变化呈现明显的“马鞍型”变化曲线。经过诱变育种,共筛选到高产菌株61株,其中海洋Streptomyces sp. FMB-34菌株最大突变幅度为48.82%.4.采用单因素试验确定碳氮源种类和葡萄糖等组分初始添加量,然后利用Fractional Factorial Screening Design快速确定了影响海洋Streptomyces sp. FMB-34发酵的3个关键因子分别为黄豆粉、小麦粉和蛋白胨。统计分析各因素的主效应、交互作用后用预测刻画器可得最佳发酵条件为：黄豆粉40.0g/L、小麦粉20.0g/L、蛋白胨5.0g/L,其余组分葡萄糖10.0g/L、CaCO36.0g/L、MgSO424.0g/L、 FeSO4·7H2O1.5×10-4g/L、CoCl2·6H2O1.5×10-4g/L,按照4%接种量、50/250mL装液量、33℃、180r/min的发酵条件进行摇床发酵5天,效价预测值可达3345±238.67U/mL。采用优化后的培养基对高产菌株进行复筛,测得海洋Streptomyces sp. FMB-43菌株sisomicin产量为4183±100.52U/mL。
肖剑萍[3]2014年在《暗霉素定向生物合成研究》文中认为妥布霉素是临床使用的重要抗生素,其产业化生产菌黑暗链霉菌Tt-49主产安普霉素、氨甲酰妥布霉素和妥布霉素等复合物。利用基因工程技术,先阻断安普霉素的生物合成,后进一步阻止氨甲酰基修饰,获得单组分妥布霉素工程菌。在此基础上,插入可能负责庆大霉素C3',C4'脱羟基作用的基因模块,探索其与安普霉素和妥布霉素生物合成基因组合的可能性。具体内容如下：1.aprH基因缺失突变株TH304的构建：构建重组质粒pTH407,经接合转移导入黑暗链霉菌Tt-49,得到单交换工程菌TH303。经松弛培养后,利用影印筛选和PCR鉴定,获得aprH基因缺失突变株TH304。经发酵检测,TH304生产力约2250μ/mL,为Tt-49的75%。TLC分析和MS分析确认,TH304不再合成安普霉素,主要积累氨甲酰妥布霉素。但与Tt-49相比,TH304生长周期较长,产孢能力差,不利于生产上的应用。2. aprJ基因缺失突变株TJ302的构建：构建重组质粒pTJ401,导入黑暗链霉菌Tt-49,获得aprJ基因缺失突变株TJ302。发酵结果显示,TJ302不再合成安普霉素,主要积累氨甲酰妥布霉素,总效价约2500 μ/mL,为Tt-49的85%。经考察发现,TJ302生长性状稳定,适合进一步改造。3. tobZ基因缺失突变株TJZ308的构建：将重组质粒pTZ501,导入黑暗链霉菌TJ302,获得tobZ基因缺失突变株TJZ308。发酵结果显示,TJZ308为单组分妥布霉素产生菌,且发酵单位与TJ302相近。发酵提取妥布霉素无需层析分离,就能达到药典规定的质量标准,解决了困扰企业几十年的关键技术难题,填补了国内外的研究空白。4.庆大霉素3',4'脱羟基酶基因与妥布霉素生物合成基因的组合研究：构建将红霉素启动子ermE*组装于genB3-P-B4基因模块上游的重组质粒pZP606,导入黑暗链霉菌TJZ308,组合至妥布霉素生物合成基因簇的tobZ位点,获得工程菌TZP310。发酵结果显示,TZP310发酵单位显着下降,仅300μ/mL左右。经MS分析确认,genB3-P-B4基因模块的插入,破坏了妥布霉素的正常合成,使代谢产物停滞于尼泊拉胺。5.庆大霉素3',4'脱羟基酶基因与安普霉素生物合成基因的组合研究：构建重组质粒pDP605,导入黑暗链霉菌ST314,组合至安普霉素生物合成基因簇的aprD3-D4位点,获得工程菌TDP306,其发酵单位与ST314相近。经MS分析确认,TDP306仍积累卡那霉素B, genB3-P-B4基因模块的插入,并未达到定向合成地贝卡星的预期效果。但确定了外源基因的插入位点,为进一步研究庆大霉素3',4'脱羟基酶基因在链霉菌中的表达,生物合成地贝卡星奠定了基础。
张熠[4]2014年在《小单孢工程菌构建及其功能基因研究》文中提出庆大霉素由绛红色小单孢菌产生,已在临床上得到广泛应用。但庆大霉素生物合成途径与功能基因的研究却刚刚开始。本研究在分子水平上探索庆大霉素生物合成与功能基因的关系,完成了GKN27、GKP116、G091和GKB3226等小单孢工程菌的构建。具体内容包括以下叁个方面：第一,利用生物信息学技术,预测庆大霉素生物合成基因簇的相关基因功能。选取四个功能基因(genN、genO、genP和genB3)进行研究。经同源比对,分析基因编码蛋白(GenN、 GenO、GenP和GenB3)的结构域和同源建模等,推测基因genN可能是修饰庆大霉素6’C-N的甲基化酶基因；基因genO的结构域含有甲基化序列,与庆大霉素生物合成途径中的甲基化修饰有关；基因genP可能是庆大霉素C3',C4'双脱氧反应中的磷酸转移酶基因;基因genB3与庆大霉素C6’的氨基转移有关。第二,功能基因的研究。根据同源重组原理,设计功能基因(genN、genO、genP)框内敲除的实验方法。利用基因工程技术,成功构建基因genN缺失小单孢工程菌M. purpwea GKN27。工程菌GKN27不产生庆大霉素C族复合物,而积累四种庆大霉素生物合成中间体,表明genN基因功能与生物信息学的理论推测不符,即genN可能不是编码庆大霉素6’C-N的甲基化酶基因；该研究已整理论文被工业微生物杂志录用。敲除基因genP,获得小单孢工程菌M. purpwea GKP116,研究表明,genP基因与庆大霉素生物合成过程密切相关。利用同样的方法,获得基因genO缺失的小单孢工程菌M purpwea G091,结果表明,基因genO与庆大霉素6'C-N的甲基化反应有关。第叁,庆大霉素X2小单孢工程菌的构建。庆大霉素X2是进一步开发抗原虫,抗病毒以及抗肿瘤药物的重要前体。选取工程菌M. purpurea GK1101为出发菌,以其染色体DNA为模板,利用PCR扩增庆大霉素合成基因簇中氨基转移酶基因genB3的上、下游序列作为同源交换臂。通过分子克隆技术构建重组质粒pFU803。重组质粒pFU803经接合转移,导入绛红色小单孢菌GK1011。经筛选得到目标小单孢工程菌M. purpurea GKB3226。根据其代谢产物的TLC和EIS-MS分析,确认其代谢产物主要为庆大霉素X2和少量的庆大霉素JI-20A。结果表明,genB3基因功能与庆大霉素Π-20A双脱羟基反应有关,敲除genB3阻断了庆大霉素Π-20A至西索米星的生物合成,获得小单孢工程菌M. purpurea GKB3226.填补了国内外研究空白,申请了国家发明专利。
参考文献：
[1]. 依尼奥小单孢菌原生质体融合育种及其分子生物学研究[D]. 洪文荣. 上海医药工业研究院. 2004
[2]. Sisomicin高产菌株选育与发酵优化研究[D]. 李金良. 南京农业大学. 2012
[3]. 暗霉素定向生物合成研究[D]. 肖剑萍. 福州大学. 2014
[4]. 小单孢工程菌构建及其功能基因研究[D]. 张熠. 福州大学. 2014