马清霞[1]2004年在《猪链球菌病PCR诊断技术及SS2毒力因子单克隆抗体的研制》文中研究指明马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型是我国猪链球菌病的两种主要病原。马链球菌兽疫亚种主要引起猪的化脓性关节炎和败血症，而猪链球菌2型不仅可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡，还可以感染相关人员并致死，是一种重要的人畜共患病病原。所以猪链球菌2型在世界很多国家均受到重视，对它的研究主要集中在与毒力相关蛋白的研究上。猪链球菌2型主要的致病因子有荚膜、溶血素、溶菌酶释放蛋白(muraminidase-released protein，MRP)和胞外蛋白因子(extracellular protein factor，EF)等．根据MRP和EF等毒力相关蛋白的存在与否，猪链球菌2型可分为以下几种表现型：MRP~+EF~+、MRP~-EF~-、MRP~+EF~*、MRP~*EF~-、MRP~-EF~+、MRP~+EF~-、MRP~-EF~*等。对我国江苏地区的流行病学调查显示，来自疫区的2型菌株均为对猪有强毒力的MRP~+EF~+表现型。所以检测MRP、EF的有无和进一步的研究MRP、EF的致病机理，对猪链球菌2型引起的链球菌病的诊断，防治和根除具有很重要的意义。本实验的主要目的就是检测MRP和EF，分别建立多重PCR和制备MRP和EF的单抗。最后结合我国猪链球菌病的实际情况，设计了两重PCR，同时检测马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型。 首先结合我国实际，马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型是猪链球菌病的主要病原。本实验在在鉴定猪链球菌2型的基础上，根据马链球菌兽疫亚种的一种重要的型特异性抗原一类M蛋白，设计一对特异性引物，建立了分群PCR。PCR结果显示它能快速的从混合培养物和混合感染的病料中鉴别出这两种病原，所以此方法可以用于猪链球菌病的实验室诊断和流行病学调查。 其次研制鉴定致病性猪链球菌2型的多重PCR试剂盒。猪链球菌2型中存在强毒力、弱毒力和无毒力等菌株，而且在我国，两种毒力因子MRP和EF与强毒力具有相关性。所以检测MRP和EF的有无，可以鉴定猪链球菌2型的强弱。本实验在2型分型PCR的基础上，分别设计MRP和EF的引物，通过优化PCR反应条件和体系，建立了一个多重PCR检测试剂盒，它能在鉴定2型的基础上，检测MRP、EF以及EF~*，鉴定毒力的强弱。与细菌分离方法相比，它检测时间短，方便易行，而且敏感高，特异性好，为猪链球菌2型的流行病学调查提供了一个很好的方法。 最后，在鉴定为强毒力的菌株中，研究其毒力因子的功能，为此，本实验首先制全文摘要备了MRP和EF的单杭.通过优化培养基和硫酸氮分级沉淀等方法纯化EF;利用阴离子交换层析和凝胶层析等方法纯化MRP，分别制备M即和EF杭原，免疫BALB/c小鼠，细胞融合后，筛选阳性杭体的细胞克隆，多次有限稀释得到杭MRP和EF的单克隆细胞株，免疫印迹鉴定后，分别制备腹水杭体.并对MRP的一株单杭初步应用，将腹水单杭初步纯化后，用FITC进行标记，建立直接荧光法，检测和区分MR卫+株和MRP一株.
王花茹[2]2006年在《猪链球菌PCR检测方法的建立及纤连蛋白结合蛋白的克隆和表达》文中进行了进一步梳理猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是重要的人兽共患病的病原，能引起猪和人类的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎以及突发性死亡，对养猪业造成巨大的经济损失。迄今为止，根据SS荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)抗原性的不同，可将其分为35个血清型(1～34，1／2)，主要致病血清型为SS1、SS2、SS1／2、SS7、SS9和SS14，其中以SS2流行最广、致病性最强。研究发现，并不是所有的SS2都有致病性，菌株致病性强弱与其是否表达毒力相关因子有很大关系。目前，已知的与SS致病性相关的毒力因子主要有荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白(muraminidase released protein，MRP)、胞外因子(extracellular factor，EF)、溶血素(suilysin，Sly)、和IgG结合蛋白、44000的蛋白等，在SS致病方面一般都是协同发挥作用。对于SS检测和分型，国内研究主要针对SS2，所以本试验第一部分中，根据Genbank中gdh、cps1、cps2、cps7、cps9和mrp、epf(epf~*)、sly设计引物建立两个多重PCR，希望实现对SS系统的检测。 此外，近年来发现SS一种新的毒力因子—纤连蛋白结合蛋白。作为一种值得重视的细菌非菌毛黏附素，它普遍存在于SS的除32和34型以外所有血清型中。有研究说它可以作为交叉保护性抗原，有望用于SS的检测和免疫等方面。本试验第二部分是以四川资阳人源分离株为模板进行的表达纯化等工作。 1 SS及其主要致病血清型多重PCR检测方法的建立 根据SS谷氨酸脱氢酶基因和血清型1型、2型、1／2型、7型、9型和14型荚膜多糖编码基因核酸序列，分别设计SS型通用引物和型特异性引物，建立、优化多重PCR检测方法，并检测分析种属背景明确的菌株73株(其中猪链球菌49株、其他对照菌株24株)及临床分离样本94株(包括四川资阳人源和猪源临床分离样本45株)。其中73株种属背景明确菌株多重PCR种检测结果符合率为87.5％，6种主要致病血清型检出率可达率为100％。24株对照菌株在种和血清型水平均检测为阴性。对45株四川猪链球菌病暴发现场分离菌株进行检测，其中41株为SS2。上述结果提示本试验建立的多重PCR方法，可确定被检测SS是否属于主要致病血清型，特异性和敏感性好，可用于猪链球菌病的快速诊断和流行病学调查。
刘春生[3]2010年在《河南猪链球菌的分离、鉴定及毒力相关基因的原核表达》文中研究说明猪链球菌病是危害养猪业的一个重要传染病,可引起猪的脑膜炎、关节炎、败血症、心内膜炎等,给养殖业造成很大的经济损失。猪链球菌是其最主要的病原之一,根据其荚膜多糖抗原的差异,可将其分为35个血清型,其中1、1/2、2、7、9、14型是其主要致病性血清型,给养殖业造成很大的经济损失。同时,它也是一种重要的人兽共患病,可引起人的败血症、脑膜炎和永久性耳聋等,甚至引起死亡,在公共卫生方面引起极大关注。本研究旨在建立快速特异的免疫学和分子生物学检测方法,同时对河南省病猪群中猪链球菌的感染状况及血清分布进行调查,为该病的快速诊断和防制提供参考。1、猪链球菌主要致病血清型PCR检测方法的建立根据猪链球菌种特异的gdh基因序列及1(14)、2(1/2)、7、9型型特异的cps1I、cps2H、cps7H、cps9G基因序列,分别设计了5对引物,预计扩增目的片段分别为689bp、441bp、542bp、232bp和330bp。通过优化反应体系,分别建立了快速检测猪链球菌种及其1(14)、2(1/2)、7型的四重PCR方法和猪链球菌9型的单一PCR方法。利用保存的猪链球菌不同血清型菌株和其他相关标准菌株为参照进行特异性和敏感性试验。用所建立的PCR方法对河南省不同地市的39份猪扁桃体样品进行检测,并选取部分样品通过PCR产物序列测定进行了验证。所建立的PCR法特异、敏感,其中四重PCR对猪链球菌2型的最低检出水平为2.52CFU。该PCR法准确性很好,可用于猪链球菌主要致病血清型的快速检测。2、河南省发病猪群猪链球菌的分离、PCR鉴定及其血清型分布利用所建立的PCR方法,对河南省14个地市33个猪场采集的83份发病猪扁桃体样品进行PCR检测,同时分离疑似猪链球菌,进行形态学、染色特性鉴定、并用猪链球菌种及其主要致病血清型PCR方法进行鉴定,再抽取部分PCR产物进行序列测定进行验证。扁桃体样品中共检测出猪链球菌阳性77份,检出率为92.8%,其中2型15份,占18.1%;7型4份,占4.8%;9型26份,占31.3%;没有检测出血清1型;同时检出2型和7型的有8份,9.6%;同时检出9型和7型的有2份,占2.4%;共分离到猪链球菌菌株77株,其中2型7株,占9.2%;7型3株,占4.0%;9型4株,占5.3%;未定型的63株,占81.8%;没有分离到血清1型。分离到的猪链球菌均为针尖状大小、灰白色或灰色、呈α、β、γ溶血的小菌落,革兰染色均为阳性球菌,一般成对或短链状,偶有长链。结果说明河南省病猪群中猪链球菌的携带率很高,主要为血清9型,其次是2型,7型较少;未发现1型。猪链球菌致病血清型常与HCV,PCV2等混合感染;分离到的猪链球菌菌株较纯,可作为背景明确可靠的实验材料用于今后的生产和科研。3、猪链球菌谷氨酸脱氢酶(GDH)基因的克隆与序列分析PCR扩增出猪链球菌1、2、7、9及其它未定型菌株共5个菌株的gdh基因,克隆于pMD-18T载体,转化宿主菌JM109中进行序列测定。并从GenBank中下载猪链球菌2、7、9型gdh基因序列共16个,对其进行比较分析。成功克隆了5株猪链球菌的gdh基因,序列分析显示其gdh基因与GenBank中已登录的猪链球菌gdh基因有密切的亲缘关系,21株不同血清型菌株gdh基因的核酸同源性96.4%～100%;其推导的氨基酸序列同源性在98.4%～100%,最高只有5个氨基酸的差异。15株血清2型菌中,该基因的核苷酸同源性在99.9%～100%,氨基酸同源性在99.6%～100%,其中有13株为100%,另2株仅有一个氨基酸的差异。对21个菌株的氨基酸序列比较发现,6个血清2型之外菌株的氨基酸序列都有3处氨基酸存在差异,分别发生在299aa处,Ser→Ala,305aa和330aa处,Lys→Glu。除此之外,个别序列在其它位点与2型仅存在1或2处氨基酸的差异。该蛋白抗原性预测显示其共含21-22个抗原表位,BLAST分析显示有13-14个表位是特异性的抗原表位。表明所克隆的基因在猪链球菌之中非常保守,可以进行表达以用作免疫学方面的相关研究。4、猪链球菌血清2型PDSWG-1株gdh基因及9型荚膜多糖cps9G基因的原核表达设计2对引物,分别采用PCR法以猪链球菌2型河南分离株PDSWG-1及猪链球菌9型河南分离株PY-2的基因组DNA为模板扩增出gdh和cps9G全基因。用限制性核酸内切酶BamHⅠ、XhoI进行双酶切后,定向克隆至pET32a(+)中,构建重组表达质粒pET32a-gdh和pET32a-cps9G,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行鉴定。通过优化表达条件,pET32a-gdh/BL21经0.8 mmol/L IPTG诱导3h后SDS-PAGE分析表明,重组菌株表达出了约68.8KDa的融合蛋白条带,与预期结果一致。pET32a-cps9G/BL21经1.2 mmol/L IPTG诱导4h后SDS-PAGE分析表明,重组菌株表达出了约50.7KDa的融合蛋白条带,与预期结果一致。Western blotting分析表明,这两个融合蛋白均具有特异的生物学活性。为建立快速、简便、特异的免疫学检测方法及制备单克隆抗体提供了较好的抗原,同时为研制猪链球菌亚单位疫苗和诊断试剂盒奠定了基础。
夏小静[4]2012年在《猪链球菌GDH基因克隆表达及其PPA-ELISA抗体检测方法的建立与应用》文中指出猪链球菌(Streptocuccus suis, S.suis)是当前严重危害养猪业的一种重要病原菌。根据荚膜多糖(capsular polysaccharide, CPS)抗原成分不同，将猪链球菌分为35个血清型(1~34型和1/2型)，其中，猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2, SS2)是最常见、毒力最强的血清型，是一种重要的人畜共患病病原菌。谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase, GDH）是新近报导的毒力相关因子，在细胞表面表达，其酶活性是NAD（P）H依赖型的，是连接碳代谢和氮代谢的一个关键酶，是细菌能量代谢过程中的一个十分重要的功能分子，对细菌致病性有着重要意义。GDH编码的氨基酸序列极其保守，为种特异性抗原成分。本研究选取SC22（SLY~+、MRP~+、EPF~+）株GDH基因克隆入pET-30a进行原核表达，经亲和层析纯化重组蛋白进行动物试验，验证表达重组GDH蛋白的免疫学活性，分别以酶标板和NC膜为抗原载体、rGDH为抗原建立PPA-ELISA及Dot-PPA-ELISA检测方法，以期为大规模地进行猪链球菌病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段。研究内容主要包括以下几部分：1、猪链球菌谷氨酸脱氢酶的原核表达及其抗原性初步研究为获得猪链球菌感染的诊断性抗原，以SS2四川分离株SC22基因组为模板，PCR扩增gdh的完整ORF，将其克隆入原核表达载体pET-30a构建重组原核表达质粒，转化E.coli BL21（DE3），筛选阳性转化子诱导表达。SDS-PAGE对分析显示，目的蛋白获得高效表达，Ni-Agarose柱纯化重组蛋白纯度高。将纯化的蛋白免疫家兔获得高效价的多克隆抗血清，全部被检菌株与抗GDH血清反应均有单一特异性反应条带，重组GDH能与5份实验感染猪血清产生反应条带。表明大肠杆菌表达的GDH融合蛋白至少保留了部分天然GDH蛋白的反应原性，可作为诊断抗原用于ELISA等诊断方法的建立。2、猪链球菌rGDH PPA-ELISA抗体检测方法的建立与应用以纯化的猪链球菌GDH基因重组原核表达产物作为包被抗原，酶标葡萄糖球菌A蛋白为二抗，建立了检测猪链球菌抗体的间接PPA-ELISA诊断方法。方阵试验确定的GDH蛋白抗原的最适包被浓度为12.5μg/mL，血清最佳稀释倍数为80倍，PPA(HRP-SPA)的最适工作浓度为1:4000，ELISA阳性反应的临界值为OD_450≥0.378，特异性试验表明，所建立的PPA-ELISA不与猪细小病毒病等常见猪病的阳性血清发生交叉反应，批内和批间重复试验的变异系数均小于10%。应用建立的检测方法检测家兔免疫后抗体变化并绘制抗体消长规律曲线图；用建立的PPA-ELISA方法与武汉科前动物生物制品有限责任公司猪链球菌ELISA抗体检测试剂盒同时检测120份临床血清，二者总符合率为98.3%；对320份血清进行猪链球菌抗体检测，阳性检出率为73.4%。试验证明，所建立的ELSIA检测法重复性好、特异性强、敏感性高，为大规模地进行猪链球菌病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段。3、猪链球菌rGDH Dot-PPA-ELISA抗体检测方法的建立与应用利用原核表达的猪链球菌谷氨酸脱氢酶蛋白(GDH)作为包被抗原建立了基于NC膜条的猪链球菌抗体的间接Dot-PPA-ELISA检测方法。确定抗原最适包被浓度为12.5μg/mL，PPA(HRP-SPA)的最适工作浓度为1:2000，以5%脱脂奶粉-PBST作为封闭液，37℃封闭1h效果最佳。应用建立的检测方法检测家兔SS抗体；用建立的ELISA方法与武汉科前动物生物制品有限责任公司猪链球菌ELISA抗体检测试剂盒同时检测120份临床血清，二者总符合率为98.3%；对320份血清进行猪链球菌抗体检测,阳性检出率为73.4%。结果表明该方法具有简便快速、特异性强、敏感性高的优点，适用于猪链球菌所有亚型的抗体检测，为猪链球菌病的流行病学调查和疫苗免疫抗体检测提供了一种敏感、特异、简便、快速的血清学检测方法。
禹波, 李候梅, 庞全海[5]2006年在《猪链球菌病研究进展》文中指出猪链球菌病(Streptococcus suis)是多种溶血性链球菌引起的急性发热性传染病,在暴发时疫情猛烈,传播迅速,病猪体温骤然升高到41℃以上,几乎看不到典型症状,几小时内死亡。该病一年四季均有发生,但以夏秋较为多见[1,2]。猪链球菌病是世界各地
蔡振鸿[6]2007年在《中国部分地区猪链球菌遗传背景及进化关系研究》文中指出设计了特异性引物对3个致病性猪链球菌2型(SS2)四川分离株4个主要毒力因子基因mrp、epf、sly和orf2分别进行了扩增，序列测定与分析结果表明3个SS2四川分离株均存在4个毒力因子基因mrp、epf、sly和orf2，其核苷酸序列与1998年江苏分离株9801及国外参考菌株的同源性均大于99.5％，提示3个四川分离菌株与1998年江苏流行的高毒力菌株可能具有共同的来源。应用多位点序列分型技术(MLST)结合猪链球菌现有毒力因子基因gdh、cps、mrp(mrp*)、epf(epf*)、sly、orf2、fbps、gapdh基因分布的PCR检测，对来源于发病猪、健康猪扁桃体和发猪链球菌病病人的41株猪链球菌1／2，2，7，9型国内流行菌株进行了基因分型。结果发现了2个在国际上未报道的ST型——STN1和STN2，41株菌分布于10个基因型(由8个ST型和9种毒力基因型组合而成)，其中流行最广的猪链球菌菌株为2型中的ST7／A1型(74.2％，23／31)，毒力基因型为gdh+／cps2+／mrp+／epf+／sly+／orf2+／fbps+／gapdh+；且ST7型菌株与发病猪分离的临床背景高度相关，ST7占发病猪分离菌株的84.6％(22／26)；健康猪分离的菌株基因型与发病猪分离的基因型差异明显；通过菌株MLST型别，绘制了我国流行的猪链球菌菌株的遗传进化图谱。为了了解重庆猪链球菌流行情况，掌握其流行病学规律，随机采集重庆市20个区县定点屠宰场的腭扁桃体1360份和116份发病猪实质器官，进行猪链球菌分离。应用溶血特性、PCR方法和凝集试验对分离菌株进行筛选及猪链球菌种、型鉴定。应用PCR方法对定型的猪链球菌进行毒力因子检测，并应用多位点序列分型技术(MLST)进行分型，同时与2005年和2006年重庆地区已分离的猪链球菌进行比较．结果共分离猪链球菌菌株230株，其中2型4株，7型3株，9型2株，并在国内首次分离出2株猪链球菌1／2型。毒力因子检测和MLST分型结果表明，重庆猪扁桃体分离的2型菌株特性与引起发病的菌株有较大差异。
邢娟[7]2010年在《猪链球菌分子分型新方法研究及健康猪群猪链球菌菌株耐药性检测》文中研究指明根据国外当前的多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)法,我国分离的猪链球菌S. suis 98HAH33和05ZYH33株属于序列7(sequence type 7,ST7)型。但S. suis 98HAH33和05ZYH33在7个猪链球菌MLST基因序列上的基因分子特征却与MLST ST7型其它猪链球菌分离株的基因分子特征不相吻合。鉴于上述原因,本研究尝试建立一种新的分型方法,力求同一型内的菌株在ST和基因分子特征方面获得一致。本研究首先从基因组上随机选择6个保守的酶基因和1个CPS基因,截取其500-750bp的保守片段。由于相关研究认为GenBank上发表的S. suis 98HAH33和S. suis 05ZYH33基因组序列存在较多的错误,所以,我们首先对本课题保存的S. suis 98HAH33和S. suis 05ZYH33菌株上的相关基因测序,以求得到准确的测序结果。同时,从GenBank上下载S. suis BM407,S. suis P1/7,S. suis SC84相关序列。之后,按C76和C77组合,将其按6或7片段连接起来,通过DNASTAR软件MegAlign建立遗传树。该分型法对所得的8个分型图均表明,S. suis 98HAH33、S. suis 05ZYH33均应归属于MLST ST1型,分型结果与S. suis 98HAH33、S. suis05ZYH33的基因分子特征完全吻合。同时,本研究从甘肃省部分地区采集到的152份健康猪扁桃体分离猪链球菌,共分离到67株猪链球菌菌株,分离率约44%。对67株猪链球菌菌株所作的耐药性检测表明,全部猪链球菌分离株具有多重耐药性,最严重者,对22种抗生素中的16种抗生素产生耐药性。用我国致病性2型猪链球菌特有的89k毒力岛序列特异性引物对67株猪链球菌进行PCR鉴定,仅发现一株猪链球菌分离株能够扩增出该特异性片段,提示在该地区健康猪群中少数猪可能隐性感染致病性2型猪链球菌病。
赵福义[8]2014年在《某猪场猪链球菌感染病例诊断及防治》文中指出猪链球菌病是由猪链球菌引起。猪链球菌革兰氏染色呈阳性，按其荚膜多糖不同可以分为35个血清型：1-34型和特殊型1/2型，其中猪链球菌2型（Streptococcus suis2, SS2）致病能力最强，影响范围最大。此外，仍有大量猪链球菌未分型。猪链球菌病是我国养猪业面临重大的传染病之一，引起猪链球菌病的主要病原即为猪链球菌2型。猪链球菌不仅可以侵入血液循环而造成肺炎、关节炎、淋巴结炎等，而且可以穿过血脑屏障和胎盘屏障导致脑膜炎及母猪流产。同时猪链球菌2型通过伤口及呼吸道等途径可以感染人，引发人的关节化脓性炎症、脑膜脑炎及心内膜炎等，严重的可致死亡，已被列为国家二类动物疫病。目前国内猪病发病情况非常复杂，病毒性传染病如猪瘟、伪狂犬病、蓝耳病、圆环病毒病、猪流行性腹泻等病毒性腹泻病，细菌性传染病如猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病、猪传胸、猪肺疫、猪气喘病、仔猪黄白痢和水肿病及猪副伤寒等，以及一些营养代谢病如白肌病、缺铁性贫血等，中毒性疾病如食盐中毒、霉菌毒素中毒及药物中毒等。发病情况表现为一方面病原体的流行和变异严重，另一方面由于饲养管理，生物安全等工作不规范问题，导致几种疾病的混合感染更为普遍。其中，猪链球菌分型多而且在临床上易发生与其他疾病混合感染，对我国养猪业影响重大，因此，对于猪场暴发猪链球菌病进行了诊断及防控研究具有积极意义。本课题以长春某千头猪场暴发疑似猪链球菌病为研究对象，通过流行病学调查，对28头病死猪进行临床诊断，实验室诊断，并以自制药敏片实验为依据提出猪场疫情防控方案。确诊这起猪场暴发疾病的病原是猪链球菌2型。分析得出：猪链球菌2型引起的猪链球菌病，85%的发病猪会出现高烧不退、呼吸困难、跛行，80%的发病猪会出现身上发绀、耳尖发紫，78%猪会发现颌下、腹股沟、肺门、胃门、肝门等淋巴结肿大数倍伴有淤血出血及灰白色坏死灶，脾脏淤血肿大有梗死灶，肾脏淤血肿大皮质髓质有出血斑点，心包积液、心内膜心外膜出血，肺脏充血淤血出血等同时存在各期大叶性肺炎病变，肝脏淤血肿大，胃底出血潮红病变，肠道充血出血等。此猪场发病率达15%，病死率40%。随后对发病猪场提出防控措施，通过改善饲养环境、综合治疗、对症治疗等措施，控制一周后新发病猪数量明显减少，病猪病情好转，猪场疫情基本得到控制。
高祥辉, 李春玲, 秦翠丽[9]2011年在《猪叁种细菌性病原单克隆抗体研究进展》文中进行了进一步梳理单克隆抗体具有高度特异性、均质性及来源稳定并可大量生产的优点,成为传染性疾病研究、诊断和治疗的一个有力手段。随着单克隆抗体技术应用的深入,其在猪细菌性传染病的研究中发挥了一定的作用。论文简要介绍了单克隆抗体的技术原理,对猪链球菌病、猪胸膜肺炎和猪支原体肺炎叁种常见猪细菌性传染病病原的单克隆抗体研究进展进行了概述,并对存在的问题和发展前景进行了讨论和展望。
刘亚彬[10]2007年在《猪链球菌2型IMPDH基因功能结构域的确定》文中认为猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2，SS_2)是我国猪链球菌病的重要病原，不仅可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡，还可感染相关人员并致死，是一种重要的人畜共患病病原。在SS2中，可区分为强毒株、弱毒株和无毒株，已发现的毒力因子主要包括溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外蛋白因子(EF)、溶血素(SLY)、New ORF2、荚膜多糖(CPS)、纤维蛋白原结合蛋白(FBP)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、分泌型核酸(SSnA)和叁磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)等。在orf2和mrp之间存在一个新的开放阅读框，本课题组通过活性染色已证实该阅读框具有次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)活性，通过Interpro和PHD软件分析IMPDH的结构域模型为[LIVMT]-[RK]-[LIVM]-G-[LIVM]-G-X-G-[SRK]-[LIVMAT]-C-X-T，其中半胱氨酸残基(C)为底物IMP的结合部位。且已证实IMPDH基因的融合表达蛋白可延长HEp-2细胞的S期。1．猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶基因的分片段缺失与表达该阅读框共有957bp个碱基，编码319个氨基酸，未发现一个半胱氨酸残基(C)。通过软件分析功能结构域存在于第9-798bp基因片段所编码的蛋白质中，对这789bp个碱基，每次缺失大约200bp以找其酶的催化部位和底物结合部位。按照正确的阅读顺序自行设计八对引物，引物两端分别添加限制性酶切位点EcoRⅠ、XhDⅠ或NcoⅠ及保护性碱基，且相应的片段通过EcoRⅠ酶切位点去串联。并克隆至pET-32α(+)载体中共构建五个重组质粒，转化至大肠杆菌BL21中，表达出分子量分别为45.3kDa，43.8kDa，42.6kDa，43.3kDa的四个缺失蛋白和一个分子量为52.2kDa的全长蛋白。2．猪链球菌2型IMPDH基因功能结构域的确定猪链球菌2型IMPDH基因的分片段缺失克隆和表达，共原核表达出五个融合蛋白。表达的五个重组蛋白都含有6个连续的组氨酸残基，利用能与Ni~(2+)结合的特性，进行纯化。五个重组蛋白经Ni-NTA His·Bind Resin进行非变性条件纯化后，获得相应的蛋白。免疫转印这4种缺失蛋白可被SS2的抗血清识别，具有免疫原性，且和IMPDH的一株单抗具有不同程度的免疫反应性。全长基因含有IMP dehydrogenase功能结构域，可催化IMP生成XMP，五个重组蛋白通过IMPDH活性染色，确定该酶的催化部位和底物结合部位存在于第627-790bp位碱基编码的蛋白需序列中。这五个蛋白分别作用于HEp-2细胞，流式细胞仪检测表明它们可不同程度地影响HEp-2的细胞周期。
参考文献：
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