谷运红[1]2003年在《离子束诱变和介导转化在拟南芥中的应用》文中研究表明通过对拟南芥(Landersberg erecta生态型)愈伤组织诱导和植株再生培养体系的研究，发现B5+5mg/l2,4-D+0.5mg/lKT培养基和MS+5mg/lKT+0.1mg/lIAA培养基分别可以高效诱导愈伤组织和植株分化；同时建立了拟南芥幼苗的液体培养体系。 对冻害的防护问题进行研究并建立了离子注入愈伤组织和幼苗的实验体系。结果发现DMSO和玻璃化两种防护方法中，玻璃化预处理能更有效地防护活体组织在注入过程中受到的冻害，并且通过优化注入参数，找到了最适于拟南芥愈伤组织和幼苗的注入条件。 在对离子注入拟南芥种子引起的诱变效应的研究过程中发现，不同生态型拟南芥种子对注入剂量的敏感度不同，离子能量、离子类型对种子成苗率也有影响。通过研究拟南芥种子的成活率和剂量的关系寻找出合适的诱变剂量和转化剂量。结合随机扩增多态性DNA方法，研究了离子注入拟南芥种子在M1和M2代的DNA中引起的变异情况，以2.6、13、26×10~(15)N~+/cm~2叁个剂量注入拟南芥种子，发现当代DNA变异率随离子注入剂量的增加而增加，分别为13.9％、14.9％、28.7％，与同类其它诱变手段相比，离子束具有变异率高的特点。M1代的变异条带在M2代有一部分保留下来。 对离子束介导质粒DNA转化拟南芥种子的实验体系进行了研究，发现拟南芥的干种子直接注入未能得到瞬间表达。而种子萌动24-48h后接受注入和转化，瞬间表达率约10％。此方法对于提高类似于拟南芥这样带有较致密种皮的小粒种子的转化效率有一定实际意义。 在活体组织注入后可以存活的前提下，通过对离子束介导质粒DNA导入拟南芥愈伤组织的遗传体系的研究，得到了GUS基因转入拟南芥愈伤组织的转化植株，转化效率达2％。 通过对离子束辅助农杆菌转染拟南芥幼苗的遗传转化体系的研究，发现在本实验体系下，不经离子注入直接与农杆菌共置的幼苗，未得到转化株，而由离子束辅助介导的，转化率高达3％。
卞坡[2]2003年在《离子束介导外源全DNA转化拟南芥菜的若干问题研究》文中研究说明在离子束介导外源全DNA转化中，外源全DNA包含有供体的所有遗传信息，这些外源片段对受体的影响是多方面的，因此转化效果无法用统一的转化率来衡量，这就给最佳转化条件(主要是转化剂量)的选择带来了很大的困难。我们从另外一个角度出发，在离子注入剂量-拟南芥菜存活曲线的基础上，选择不同的离子剂量介导薄荷全DNA转化拟南芥菜，根据各个转化群体在遗传和生理上的不同变化，选择1.5×10~(17)ions／cm~2作为我们以后转化工作的转化剂量。 用GC-MS分析了离子束介导薄荷全DNA转化的拟南芥菜个体的挥发油成分，在250个转化当代植株中有两株被测出含有薄荷醇，在这两株的267个T2代植株中仍有1株被测出含有薄荷醇，该实验为离子束介导外源全DNA转化实现物种间多基因复杂性状的转移提供了明确的证据。实验结果表明，通过离子束介导外源全DNA转化可以把供体中控制某一复杂性状的多个基因转化到受体细胞，并协调表达。从遗传学的角度深入分析了离子束介导外源全DNA转化性状遗传呈现新特点的内在机制。 用离子束介导与拟南芥菜亲缘关系从近到远一系列的外源供体的全DNA转化拟南芥菜，在转化当代营养生长期，各转化群体的表型变异情况没有明显的差别。但在生殖生长阶段，低育性株率的变化随着亲缘关系的从近到远呈现出一种先升高再降低的变化趋势。对这种现象的分析表明，外源全DNA片段(主要是非编码序列)对转化受体除了插入诱变的作用外，还可能存在一种新的诱变机制。转化当代和后代产生了许多变异个体，变异性状的遗传与转化当代外源DNA供体的亲缘关系有一定的相关性。在离子束介导红甜菜转化后代中筛选到两个稳定变异株系TC243-1和TC243-2，经与拟南芥菜突变体库比较，确认为新的变异类型。 利用分子生物学研究方法对转化当代和后代个体进行分子检测，采用RAPD分析法验证了转化当代的表型变异主要来自外源DNA片段的转化，而非离子注入本身的诱变效应。T-6和其T2代植株的RAPD-PCR扩增结果中均存在缺失条带S_(168-1850,)表明该缺失条带对应的变异是可以遗传的，该变异发生在ABC郑州大学博士论文摘要介即sPorter基因exon 1 791一2691和exonl一395之间。T一5和其一个TZ代植株的RApD一PCR结果中均有一新增条带sl拓长。，该条带的DNA序列和拟南芥菜基因组序列库的比对结果表明，该条带不是拟南芥菜基因组本身的DNA序列，Southem杂交结果表明该条带来自转化供体甘蓝基因组，找到了外源全DNA转化受体的分子证据，进一步分析表明该外源片段在转化过程中发生了结构变化和修饰。用100条随机引物对TC243一株系的RAPD一PCR扩增结果表明该株系的变异不是来自外源花粉的污染，同时发现了特异条带5270_1600对应的变异在TZ一TS代能连续稳定遗传。
刘安娜[3]2011年在《锌脂蛋白基因参与砷酸还原酶基因对拟南芥砷抗性的调控研究》文中研究说明类金属砷,存在于各种矿石和矿物中,主要可以通过皮肤接触、饮食呼吸等途径进入人体,随着现代工业的不断发展,环境中的砷含量在不断的增加,砷污染已经成为威胁人类健康和生活质量的重要问题。植物修复(phytoremediation)的概念在上个世纪七十年代由Brooks等人提出,近年来已发展为砷污染治理的主要手段。植物修复技术是一种用植物来修复环境污染的方法,其目的在于发展一种基因,使其在植物任何种属中都能够使用的砷污染治理手段。以模式植物拟南芥为材料,利用转基因技术来研究砷酸还原酶基因(AtACR2)与启动子上反向基因-锌脂蛋白(ZNF-1)相互作用后对砷的抗性调控。本实验分别以野生型拟南芥哥伦比亚、T-DNA插入突变体atacr2-2、atacr2-1、T-DNA插入突变体znf-1拟南芥为背景材料,将带有锌脂蛋白基因的农杆菌用浸花法转化导入拟南芥中,让锌脂基因分别在野生型拟南芥、拟南芥突变体atacr2-2、atacr2-1.zn-1中过量表达。观察不同拟南芥植株的表型,确定了砷酸还原酶基因(AtACR2)与锌脂蛋白(ZNF-1)相互作用后在一定程度上可以增加拟南芥对砷酸盐的抗性,对砷酸还原酶基因在拟南芥中对砷酸盐胁迫的响应和调控中的研究具有重要作用,这一结果大大丰富了植物修复技术的应用。
骆善伟[4]2018年在《中能碳离子束辐射百脉根突变体库创制及花瓣衰老延迟突变体机理研究》文中指出中能重离子束诱变育种具有诱变率高和突变谱广的特点,广泛运用于植物诱变育种工作中。豆科植物的离子束诱变育种工作已经多有开展,并且取得了丰硕的成果,但其诱变机理研究还相对缺乏。本研究以豆科模式植物百脉根(生态型:MG-20)为研究材料,采用碳离子束辐射百脉根干种子,从M_2代群体进行突变体筛选,对突变率和突变谱进行量化分析,并使用ISSR技术对辐射后代进行遗传多态性表征。M_2群体筛选获得了花瓣衰老延迟突变体(Petal senescence delayed,PSD),借助全基因组重测序分析和转录组测序分析寻找PSD的突变基因和差异表达基因。对转录组数据进行深入挖掘,探索百脉根花瓣衰老的基因调控网络。使用兰州重离子研究装置(Heavy Ion Research Facility in Lanzhou,HIRFL)提供的能量为80MeV/u的碳离子束辐射百脉根干种子,辐射的剂量为0、100、200、300、400、500和600 Gy,统计M_1代的萌发率、存活率和根长。结果表明萌发率与剂量无相关关系,存活率与根长随剂量升高而下降。最终选择400 Gy作为半致死剂量,辐射1200粒M_1代种子,从2472份M_2个体中筛选获得127个表型发生变异的个体。突变群体的变异类型包括叶突变、茎突变、花突变和果实突变,总突变率为5.14%。然后采用简单重复序列间区(Inter simple sequence repeat,ISSR)分子标记技术分析M_2代植株的基因组DNA多态性。选取了7个有突变表型的M_2个体和8个没有突变表型的M_2个体进行ISSR分析,多态性条带为4条,其中7个有表型个体中共发现2条多态性条带,多态率为0.607%,8个无明显表型个体中有2条多态性,多态率为0.532%,两组间无显着差异,总多态率为0.567%。碳离子束辐射百脉根获得PSD突变体未见报道,该突变体花瓣衰老延迟显着,具有较大的研究价值和潜在的经济价值。结果表明PSD单朵花的花期比野生型(WT)长10天以上,PSD的果荚比WT略短,种子数比WT略少,但均不能到达显着差异水平。生长周期、植株形态、叶型和花型均与WT无显着差异。台盼蓝染色实验和半薄切片实验结果表明:授粉后PSD花瓣细胞存活时间长于WT;花瓣萎蔫后,PSD台盼蓝染色区域少于WT,细胞结构较WT完整。通过重测序与转录组关联分析,推测CUFF.19232为引起PSD花期延长的突变基因。CUFF.19232注释为木瓜蛋白酶类的半胱氨酸肽链内切酶(CysEPs),包含了一类C-末端KDEL类内质网保留信号因子(KDEL-CysEPs),与拟南芥AT5G50260(KDEL-CysEPs)相似率为82%,具有泛蛋白酶特点。该基因的具体的功能还需进一步研究。花瓣衰老是植物生长发育的重要过程之一,百脉根中花瓣的衰老调控机制仍不甚明了。本研究以百脉根野生型材料(WT)为主要研究对象,探索参与百脉根花瓣衰老的基因,并用PSD突变体作为验证。通过对WT和PSD中差异表达基因的分析,筛选出4个关键衰老相关基因和22个泛素化相关基因参与了百脉根花瓣衰老。74个转录因子家族参与百脉根花瓣衰老的信号传导,其中AP2-ERFBP家族成员最多。并筛选出参与百脉根花瓣衰老的7种植物激素相关基因,其中乙烯合成关键基因ACS1和ACO1表达上调,多个乙烯响应转录因子(RAP2-3,ERF010,ERF060和ERF112)表达上调。对这些基因的RT-PCR验证结果与转录组测序结果一致。体外喷洒乙烯生物合成中间体1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC)和抗乙烯剂硫代硫酸银(silver thiosulfate,STS)实验表明,ACC能够加速花瓣衰老,STS则能够有效延缓花瓣衰老,进一步说明乙烯是参与百脉根花瓣衰老的关键因素。通过上述研究,我们建立了中能碳离子束辐射百脉根M_2代突变体库,并且用分子标记方法考察了辐射诱变对后代DNA多态性的影响。花瓣衰老突变体经基因组和转录组关联分析,初步认为CUFF.19232是引起PSD花瓣衰老延迟的突变基因。另外,本研究对百脉根花瓣转录组进行了深入挖掘,探索了参与百脉根花瓣衰老的基因,证明了授粉是花瓣衰老的一个重要时间点,而且乙烯在百脉根花瓣衰老中有重要作用。
欧红梅[5]2006年在《拟南芥抗La突变体的筛选》文中指出稀土元素(Rare Eareth Elements)的农业应用日趋广泛,特别是随着稀土化肥的推广,加速了土壤与环境中稀土元素的富集和积累。由于稀土是重金属,稀土进入土壤和环境后对生态环境和人类健康的影响,已引起全社会的广泛关注。目前关于农用稀土在土壤中累积后对生态环境产生的影响研究已取得了一定成果,但稀土对植物的作用机理研究尚不系统。拟南芥是一种模式植物,生物学的不同领域都对这一遗传资源进行了大力开发和利用。拟南芥的许多突变体已被广泛用于植物发育和代谢途径的研究。拟南芥突变体的筛选已成为研究许多重要理论问题的前提。在稀土农用研究中利用拟南芥的工作还很少,目前还没有关于拟南芥抗稀土元素突变体筛选的研究。本试验试图筛选出拟南芥抗La突变体,为La抗性基因定位提供基础材料。拟南芥抗La突变体的研究将从基因角度阐明稀土积累的遗传效应,填补稀土研究的空白,完善稀土农用的环境安全性评价体系。由于La~(3+)很容易和其它阴离子发生络合沉淀,降低了La在培养基中的有效浓度,同时也使得La分布不均匀,不利于突变体的筛选,因此进行了筛选条件的摸索。在pH5.8、0.8%琼脂条件下,在1/2MS+20 mg/kg及以上La浓度培养基中出现白色沉淀,在50 mg/kg La~(3+)浓度水平,植株也能生长。为避免了离子的沉淀,以1/2MS(-P)为基础培养基和纯稀土培养基试验,20 mg/kg La~(3+)完全抑制幼苗主根的生长,而且两者试验结果相同,确立了以纯稀土培养基为筛选培养基。为保证稀土培养基的均一性,避免空气中CO2造成La~(3+)沉淀,将pH调至5.5。筛选方法试验中,双层培养试验根生长至50mg/kg La~(3+)浓度稀土培养基中仍能继续生长。由于拟南芥幼苗茎和叶片处于非胁迫条件,植物的根吸收的La向上部转运很少,导致幼苗可以忍耐更高浓度的胁迫。考虑到双层培养基每皿的接种量有限,种子发芽不一致,根生长条件很难控制,因而选用了根向地性弯曲生长为突变指标的筛选方法。筛选压力试验,在6、6.5mg/kg La~(3+)培养基上,拟南芥根弯曲与对照一致;7、7.5 mg/kg La~(3+)培养基上,拟南芥能生长,但比对照长得慢,根弯曲较短;8mg/kg及以上,拟南芥不生长。含La~(3+)的培养基较对照软,而且稀土含量越高,培养基越软。由于琼脂用量和培养基的pH值在改善培养基凝固效果方面有互补作用。为得到在pH5.5下合适的凝固效果,提高琼脂浓度至1.0%。发现拟南芥在7-13mg/kg La~(3+)水平培养基上生长处于抑制状态,仍能生长;在14 mg/kg及以上浓度基本不生长。在pH5.5,1%琼脂浓度条件下,确立了野生型拟南芥完全不能生长的14mg/kgLa~(3+)浓度为最适宜筛选压力。对所获得的5120个T2代株系约50,000粒种子,用上述确定的筛选浓度和筛选方法进行筛选。共筛选到63株可能突变体,在营养土中培养,分单株收获。在培养过程中发现一株晚熟株,其抽薹比对照晚15天。对获得的63株可能突变体用上述方法进一步鉴定,尚未发现稳定遗传的抗La突变株系。
游常军[6]2009年在《OsIRL基因家族分析及开花基因的功能研究》文中提出水稻是一种重要的粮食作物,也是一种单子叶植物研究的模式植物。随着水稻基因组测序计划的完成,功能基因组学研究的重点在于发掘大量预测基因的功能。插入突变是一种高通量的功能分析方法,而突变群体的侧翼序列以及表型信息均为正向遗传学和反向遗传学研究的重要资源。以本实验室的水稻T-DNA插入突变群体为实验材料,我们对15,494份转基因植株进行了PCR阳性检测,结果表明阳性率为88.3%。利用TAIL-PCR的方法,从水稻T-DNA插入突变群体中分离得到6,798条T-DNA侧翼序列,其中2,643条侧翼序列与水稻基因组序列之间的同源程度很高(E-value< 10-5)。通过大规模表型筛选,一共获得277份具有明显异常表型的突变体家系。经过分析33份家系,获得了2份突变表型与T-DNA标签基因共分离的家系(04Z11EM13和03Z11DQ39)。03Z11DQ39家系(或称为osirll家系)的突变表型为半矮和迟抽穗,而对应的T-DNA标签基因OsIRL1 (Oryza sativa intracellular Ras-group-related LRR 1)是拟南芥PIRL家族基因在水稻中的1个同源基因。进一步调查osirl1家系显示,无论在长日条件下还是短日条件下,osirl1突变体均表现为抽穗延迟。在长日条件或短日条件下种植的osirl1突变体中,Ehdl和Hd3a的表达水平都严重下降,而Hdl基因的表达也受到部分影响。此外,我们发现生物钟基因CablR在osirl1突变体中的表达也有所下降。但是,OsIRL1基因的表达在野生型植株以及osirl1突变体中并没有检测到明显差异,而OsIRL1基因的抑制表达及超量表达转基因植株也都没有表现出类似于osirl1突变体相同或相反的突变表型。因此,osirl1突变体的突变性状可能并不是由OsIRL1基因所控制。与其他已知的植物LRR蛋白相比较,拟南芥PIRL家族蛋白与酵母及动物中的Ras相关LRR蛋白具有更高的同源性；这类Ras相关LRR蛋白可以和Ras蛋白相互作用并参与信号传导途径。除了OsIRL1蛋白之外,本研究还鉴定了PIRL家族蛋白在水稻中的其他7个同源蛋白作为OsIRL蛋白家族的成员。我们对OsIRL基因家族成员的基因结构、染色体定位、蛋白质模体组成以及进化关系作了系统的分析。大多数OsIRL基因位于水稻染色体上的基因组大片段复制区间,但并不存在串联排列的OsIRL基因。利用定量RT-PCR以及芯片数据采集的方法,我们分析了OsIRL基因家族成员在整个水稻发育时期以及光或3种激素(赤霉素、萘乙酸以及激动素)等胁迫条件下的表达谱。结果表明,所有OsIRL基因家族成员都至少在一个发育时期的组织或器官中表达,并且这些成员的表达谱也具有多样性,一些OsIRL基因在某些发育时期具有表达优势。与未处理的对照相比较,5个OsIRL基因家族成员的表达在胁迫条件下表现上升或下降；其中4个OsIRL基因可以对2种或2种以上的胁迫条件产生响应,表明这些成员可能在生理水平上参与不同激素以及光等相关信号途径之间的相互作用。利用反向遗传学策略我们也获得并鉴定了5个T-DNA或Tos17插入位点在OsIRL基因(共4个成员)内的突变体家系。这些表达谱信息以及本研究所鉴定的T-DNA或Tos17插入突变体将有助于我们进一步分析OsIRL基因的生物学功能。为了进行成功的有性繁殖,植物必须在合适的时期开花(或抽穗)。开花突变体的分子遗传学研究可以有效的鉴定开花相关的调控元件以及遗传途径。此前的研究已经鉴定了一个“永不开花”的水稻T-DNA插入突变体(即rid1突变体),并证实该突变表型是由于T-DNA插入RID1 (Rice Indeterminate 1)基因内所造成。本研究通过RT-PCR扩增以及RACE技术获得了RID1基因的全长cDNA序列。在洋葱表皮细胞中的瞬时表达结果显示RID1蛋白定位于细胞核中。定量RT-PCR分析结果显示：无论是在长日条件还是在短日条件下,rid1突变体中Ehd1、Hd3a和RFT1的表达均下降到几乎检测不到的水平,而Hd1和Ghd7的表达水平也受到部分影响。除了Hd3a和RFT1之外,本研究还检测了另外5个FTL (FT-like)基因的表达,并发现它们的表达量在rid1突变体中也有不同程度的改变。此外,RID1基因可能独立于生物钟系统。我们提出了1个模型用于将RID1基因定位于水稻开花调控的分子遗传途径中,其中存在2个水稻开花转换所必需的元件。第1个元件是位于开花途径上游的RID1基因,该基因可以调控分别由Hd1和Ehd1介导的两条开花途径以及其他一些未知的水稻开花途径；另外1个元件包括Hd3a、RFT1以及/或其他一些FTL基因,该元件可以整合不同开花途径中传递的开花信号并诱导水稻开花。一旦这两个元件中的任何一个遭到完全的破坏,水稻都将永远不能完成开花转换。
马晶晶[7]2002年在《低能离子注入拟南芥的生物学效应分析》文中研究指明离子束生物技术是一种新型的生物诱变技术，它是通过将低能离子束注入生物体内，来研究其生物学效应和作用机理，并将它应用于遗传育种和基因工程等方面的一种综合技术。经过近十年的研究，人们对它的生物学效应和作用机理有了初步的认识，但还没有掌握低能离子注入生物体的作用规律，特别是对低能离子诱变高等植物的后代的遗传规律的研究尚处于初步阶段。本研究特选择模式植物拟南芥为实验材料进行低能离子处理，观察和统计了离子注入所引起的的生物学效应，并利用RAPD技术对部分变异株进行了遗传分析，旨在为进一步探索低能离子与生物体相互作用规律的研究打下基础。通过本文的研究，主要取得了如下的结果： 首先，对不同剂量的低能N~+处理的拟南芥的M_0代、M_1代和M_2代种子的萌发力进行了比较和分析，发现经不同剂量的低能离子处理的拟南芥的当代和后代的种子的发芽率和成苗率都比对照有不同程度的降低，降低关系与剂量成正相关，其中80次剂量处理的当代种子的发芽率和成苗率仅为对照的7.81％和58.82％，这表明低能离子注入可以引起种子的萌发力的下降。 其次，对不同剂量的低能N~+处理的拟南芥的M_2代试管苗和M_3代温室苗生长状况和株高、花形、育性等性状进行了比较和分析，发现经不同剂量的低能离子处理的的M_2代试管苗和M_3代温室苗的生长速度均比对照低，其生长速度以60次、40次、80次剂量的顺序依次降低；发现M_2代试管苗表型出现了许多变异，如黄化、致死、半致死、形态变异(叶形、花形和株高)等改变，其中经80次剂量处理的拟南芥不仅黄化现象严重，黄化比例达22.22％，且植株特别矮小，连续叁代株高仅为6cm、5.79cm和3.78cm，平均不到对照的1／3，经80次剂量处理的拟南芥的花多为无柄花，结实率明显下降，部分60次剂量处理的M_3代温室苗的叶出现了前两代所没有的簇生现象，而且，有些变异部分表现为稳定遗传，如80次剂量处理的部分株系的矮化变异经过叁代仍然保持稳定。由此可见，低能离子注入不仅可以引起拟南芥苗的生长状态和表型的变异，而且部分变异是可以稳定遗传的。 再次，对不同剂量的低能N~+处理的拟南芥的M_2代试管苗的叶片外植体愈伤组织的诱导和耐盐性进行了比较和分析，发现经不同剂量的低能离子处理的M_2代试管苗的叶片外植体，离子处理影响其出愈率，高剂量处理会抑制愈伤的诱导，但低剂量离子注入对愈伤组织的增殖有一定的促进作用；愈伤组织的耐盐性也与剂量相关，低剂量的耐盐能力比对照的低，但是高剂量处理反而提高愈伤的耐盐性，这间接表明低能离子引起了拟南芥的生理状态的变化，产生了生理效应。 最后，对 80次剂量处现的拟南芥的 MZ代试管稍和 60次剂员处理的 M3代温室茵 采用RAPD技术对DNA的差异进行了分析，检测发现经低能N”注入处理的材料，其 PCR条带缺失或增加，而对照组未发现明显的变化，而且条带的变异率随剂量的升高 而上升，从引物的角度看，80次剂量处理的比代试管苗的多态性表现为67．5％，60 次剂量处理的 M。代温室苗表现为 17．5％，说明通过低能离子的诱变使拟南芥的 DNA 产生了变异。 以上结果充分显示低能离子能够引起生物体DNA产生变异，从而导致表型的变 异，是一种有效的诱变剂，表明离子柬生物技术是一种非常有效的物理诱变技术，在 生产实际中具有广泛的应用价值。
张景霞[8]2011年在《拟南芥AtFes1A与植物耐热性》文中认为热激蛋白HSP70通过ATPase循环完成其功能。多种蛋白及辅助分子伴侣参与HSP70的ATPase循环,如J蛋白和底物能够刺激HSP70水解ATP生成ADP,而ADP脱离HSP70则需要核苷酸交换因子(Nucleotide Exchange Factors,NEFs)的协助,因此, NEFs是HSP70分子伴侣体系中的一类关键辅助因子。目前,NEFs的研究多集中于原核生物(大肠杆菌中的GrpE)、酵母(Fes1p、Sse1p)和哺乳动物(Bag-1、HspBP1)中,有关植物NEFs的研究尚未见报道。为此,作者对酵母Fes1基因在拟南芥中的同源物进行了研究。拟南芥基因组中存在叁个Fes1基因的同源物,它们都归属于ARM(Armadillo repeat)蛋白家族。作者将它们命名为AtFes1A(At3g09350)、AtFes1B (At3g53800)、AtFes1C (At5g02150)。Real-Time PCR实验证实,在这叁个成员中,AtFes1A是高温诱导下表达量最高的一个,所以作者主要研究了AtFes1A基因。对AtFes1A的定位和表达特性进行研究,发现AtFes1A是一个定位在细胞质中的,受高温诱导表达的蛋白。作者自ABRC订购了AtFes1A基因的T-DNA插入突变体(salk-021784和salk-012416),对AtFes1A基因的功能进行研究。最后,作者以热敏感的北美萤火虫萤光酶作为靶标蛋白,研究了AtFes1A基因缺失导致拟南芥热敏感的原初起因。主要实验结果如下:1.拟南芥基因组中存在叁个Fes1的同源基因:AtFes1A、AtFes1B和AtFes1C。AtFes1A是叁个成员中高温诱导表达最高的一个基因。在Fes1基因缺失酵母中导入高拷贝质粒pYX242携带的AtFes1A基因的cDNA序列,发现酵母的热敏感表型基本得到恢复,说明在耐热方面,AtFes1A具有与酵母Fes1相似的功能。为确定AtFes1A基因的表达特性,作者检测了该基因在高温、低温、干旱、NaCl胁迫下的表达水平。实验结果表明,AtFes1A基因的表达受高温诱导强烈表达,在低温和干旱胁迫下表达稍有上调,NaCl不能诱导AtFes1A基因的表达。利用农杆菌侵染的方法,将含有AtFes1A基因的cDNA序列和GFP基因的融合基因转化拟南芥,GFP荧光分析发现:GFP在保卫细胞和原生质体的细胞质中表达,说明AtFes1A基因定位在细胞质中。为检测AtFes1A蛋白能否加速ADP脱离从而提高HSP70蛋白的ATPase活性,作者利用孔雀绿-钼酸铵分光光度法进行了稳态的ATPase实验,通过检测HSP70水解ATP产生无机磷的速度来判断AtFes1A是否对HSP70具有刺激作用。实验结果表明,高浓度或低浓度的AtFes1A对HSP70的ATPase活性都没有明显的影响,说明AtFes1A可能不具有刺激ADP加速脱离HSP70的功能。2.自ABRC订购了AtFes1A基因的T-DNA插入突变体(salk-021784和salk-012416)。通过PCR及测序对T-DNA插入AtFes1A基因的位置进行鉴定。salk-021784和salk-012416突变体中T-DNA分别插入AtFes1A基因的第六外显子和第五内含子上,突变体的纯合子中检测不到AtFes1A基因的转录产物和蛋白。获得耐热性实验表明,与野生型相比,突变体在下胚轴延伸时期和幼苗时期都有明显的获得耐热性缺陷,突变体种子萌发时期的耐热性也明显降低。突变体salk-021784的互补实验表明,AtFes1A基因的表达能够基本修复突变体的热敏感表型。以上结果充分说明,突变体的热敏感表型确实是由于AtFes1A基因敲除引起的。3.为研究AtFes1A基因突变导致拟南芥热敏感的原因,作者检测高温处理后,与耐热相关的HSPs(HSP70、HSP101、sHSP classI和sHSP classII)基因和Hsfs(HsfA2和HsfB1)基因转录本的表达情况。Northern杂交结果显示,与野生型相比,突变体salk-021784中HSPs和Hsfs基因的转录本水平较高。为验证实验结果的可靠性,作者利用Real-Time PCR对突变体(salk-021784和salk-012416)中耐热相关的HSPs和Hsfs基因的转录本进行了检测,所得结果Northern杂交的结果一致。以上结果充分说明,AtFes1A基因缺失导致耐热相关的热激蛋白基因的转录本升高。因此,AtFes1A是热激蛋白信号转导的负调控因子。HSP70的高表达能够抑制其他热激蛋白的表达。在salk-021784中,HSP70以及其他的一些热激基因的转录本都上调,HSP70的高表达并没有起到抑制作用。因此,作者检测了salk-021784突变体中HSP70蛋白水平的表达。结果发现,与野生型相比,突变体中的HSP70的蛋白含量并没有因为其转录本的升高而升高,而是明显低于野生型中的。本研究首次报导了AtFes1A能够影响HSP70的稳定性。4.作者利用western-blotting杂交检测了热激后,salk-021784和野生型拟南芥中全蛋白的泛素化程度。Western-blotting杂交结果表明,与野生型相比,salk-021784突变体中有更多的变性蛋白底物被标记了泛素分子,突变体中有更多的变性蛋白被蛋白酶降解。为更进一步的研究拟南芥热敏感的原因,作者构建了番茄线粒体小分子热激蛋白LeHSP23.8启动子驱动的萤光酶基因的植物表达载体,利用农杆菌侵染法转化salk-021784和野生型拟南芥。转萤光酶基因拟南芥在38℃适应2h以激活萤光酶的表达(热激启动子驱动),随后45℃高温处理2h灭活萤光酶,放置在培养箱中恢复,检测恢复不同时间的萤光酶的活力。实验结果发现,与野生型中的萤光酶相比,突变体中的萤光酶的复性程度明显较低。此外,作者还利用western-blotting检测了恢复不同时间的可溶性的萤光酶的水平。实验结果显示,在突变体中的可溶性萤光酶的含量较低,此实验结果暗示萤光酶的活性较低是由于萤光酶可溶性蛋白含量少造成的。利用麦胚系统(用抗AtFes1A抗体封闭麦胚中的AtFes1A蛋白或在麦胚中添加AtFes1A蛋白)检测变性萤光酶的复性情况。实验结果显示,AtFes1A的存在对萤光酶的复性没有显着的影响,说明,在体外的实验中,AtFes1A不能影响分子伴侣机器的功能。总之, AtFes1A是新发现的,影响细胞质HSP70稳定性和影响变性底物复性的,植物耐热相关基因。本文主要创新点:在国际上首次报道了拟南芥AtFes1A基因是植物耐热性相关基因,对拟南芥AtFes1A的亚细胞定位,AtFes1A对细胞质HSP70稳定性的调控,AtFes1A对热激蛋白信号转导的调控,以及AtFes1A对变性底物复性的影响首次进行了研究。
钱叶雄[9]2011年在《低能离子诱导玉米Mu转座子激活及DNA甲基化表观遗传机制的研究》文中认为转座子是植物基因组的重要组成部分，对于研究植物基因组的组成、进化和基因的表达调控等都具有重要意义。植物转座子发掘、应用和活性调控机制的研究是近年来植物遗传育种和分子生物学研究热点之一。研究表明，植物在逆境胁迫条件下表观遗传变化是引起转座子活性变异的重要机制。通过对一些模式植物如拟南芥和水稻的研究，人们已经对植物在逆境胁迫条件下控制转座子活性的表观遗传现象已经有了初步的认识，但是对植物表观遗传调控转座子活性机理的研究还十分有限。本研究利用低能氮离子对含单拷贝Mu转座子系统的玉米花粉进行诱变，探索Mu转座子的转座特点和活性变异，并进一步分析Mu转座子的活性变异与其DNA甲基化表观遗传变化之间的关系。同时，利用生物信息学的方法对玉米RNA介导的DNA甲基化表观遗传调控途径的相关基因家族进行鉴定和表达分析，以揭示其在表观遗传调控中的作用。获得以下主要结果：1、通过低能N~+离子注入单拷贝Mu转座子系统玉米花粉的研究发现，利用能量为30keV，注入剂量在2.4~3.6×10~(15)ion/cm~2之间的N~+离子，能够有效地诱发玉米Mu转座子活性变异。通过遗传杂交获得了子代籽粒，并根据Mu转座子活性变异的指示性状，从子代籽粒中筛选出了两种具有明显表型特征变化的紫色斑点籽粒突变体。当注入剂量为2.4×10~(15)ion/cm~2N~+离子时，从7296个子代籽粒中筛选出了12个密度较稀的斑点籽粒，表明Mu转座子被部分地激活（PA）；当注入剂量为3.6×10~(15)ion/cm~2N~+离子时，从5580个子代籽粒中筛选出了10个密度较浓的斑点籽粒，表明Mu转座子被完全地激活（FA）。2、通过Southern杂交、半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法检测了对照和突变体中非自主性的Mu1因子的转座特点和自主性的MuDR调控因子表达水平。结果表明，两种不同活性的Mu突变体中Mu1因子多态性明显地高于对照植株，分别产生了1.7kb和1.3kb特异性的Mu1限制性片段，表明Mu1因子发生不同程度的切离转座。半定量RT-PCR检测发现，不同生长发育时期和不同组织中与MuDR调控因子活性直接相关的mudrA和mudrB基因表现出差异性的表达水平。在突变体中，成熟的体细胞组织未表现出明显的mudrA和mudrB基因的表达水平上调现象；然而，在生殖组织中却表现出明显的mudrA和mudrB基因的表达水平上调现象，表明了MuDR调控因子的激活主要发生在配子形成期。实时荧光定量PCR检测进一步地显示，突变体成熟的花粉组织中mudrA和mudrB基因的表达量分别较对照提高了1.8～4.3倍和0.8～1.6倍，表明了MuDR调控因子在雄性配子中发生了明显的激活。3、通过限制性酶切和重亚硫酸盐测序相结合的方法，对玉米MuDR调控因子的TIRA和TIRB末端区域的DNA甲基化位点进行了定性和定量的检测。结果表明，在突变体MuDR调控因子的TIRA和TIRB末端，叁种不同模式的胞嘧啶位点（CpG，CpHpG和CpHpH）均较对照植株都发生了不同程度的去甲基化变异。其中，对称的CpG和CpHpG胞嘧啶位点发生去甲基化变异较显着，分别较对照植株降低了35.3～55.9%和38.9～60.0%；而非对称的CpHpH胞嘧啶位点发生去甲基化变异较小，较对照植株降低了3.0～6.1%。此外，从单个的胞嘧啶位点甲基化变异情况分析发现，一些与MuDR的活性相关的重要位点，如32bp核苷酸组成的转座酶的结合位点（MBS），一个特征性的SacI酶切位点以及mudrA和mudrB基因的转录起始位点区域内所含的胞嘧啶位点均发生了不同程度的去甲基化变异，表明这些位点的去甲基化变异直接影响着MuDR调控因子的活性变化。4、通过生物信息学和半定量RT-PCR的方法鉴定与分析了5个编码DCL蛋白的基因（Zmdcl），18个编码AGO蛋白的基因（Zmago），5个编码RDR蛋白的基因（Zmrdr）以及8个编码DMT蛋白的基因（Zmet）及其表达情况。通过与拟南芥和水稻的同源基因的序列比较和进化关系分析表明，大部分基因的序列都是高度保守的，均具有其非常保守的功能基序和重要的功能结构域，预测其与拟南芥和水稻的同源基因编码蛋白具有类似的功能；系统进化树分析显示玉米、水稻和拟南芥中这些功能基因家族都进化成了四个不同的亚族，但在进化上玉米和水稻的同源基因比拟南芥具有更近的亲缘关系。同时，在两种非生物胁迫处理下，通过对这些基因家族的表达谱的分析显示，这些基因在不同的胁迫处理下表现出差异性的表达水平，预测这些基因家族的不同成员在RNA介导的DNA甲基化调控途径中可能具有不同的功能，为下一步对这些基因的克隆和功能验证提供了理论依据。
祁文彩[10]2015年在《低剂量~(60)Co-γ辐照拟南芥的生长刺激效应及增强抗逆性的机理研究》文中指出离子辐射不同程度地影响植物的外部形态,细胞结构以及生理生化过程。低剂量离子辐射产生刺激作用,即辐射兴奋效应,已在不同生物物种中得到验证。60Co-γ射线由于其能量高、穿透力强的特点在生物诱变育种中得到广泛应用。近来,大量的研究证据表明低剂量60Co-γ辐照处理对不同植物的生长发育产生刺激效应。此外,在逆境条件下,低剂量60Co-γ辐照处理能够增强植物的抗逆性,减轻胁迫对植物造成的伤害。然而,有关低剂量60Co-γ辐照的生长刺激效应和提高植物抗逆性的分子机理却知之甚少。本论文以模式植物拟南芥为研究材料,通过比较分析对照和低剂量60Co-γ辐照的种子萌发生长幼苗的不同生理指标以及相关信号途径的基因表达,探讨了低剂量60Co-γ辐照对植物生长促进作用的生理和分子机制。首先,我们用不同剂量60Co-γ辐照处理拟南芥种子,观察分析拟南芥幼苗的生长情况。结果显示,与对照相比(0 Gy),低剂量的60Co-γ辐照(<100 Gy)显着促进拟南芥种子萌发,幼苗主根生长以及鲜重的增加。其中,50 Gy辐照的刺激生长效应最为显着,而150 Gy辐照严重抑制了拟南芥幼苗的生长。此外,我们还发现与对照相比,50 Gy60Co-γ辐照的种子萌发生长的拟南芥植株不仅株高显著增加,莲座叶显着增长,果荚也显着增长,表明低剂量的60Co-γ辐照刺激效应能够从幼苗阶段延续到植株水平。在正常生长条件下,50 Gy 60Co-γ辐照的拟南芥种子萌发生长幼苗中过氧化氢(H2O2)含量比对照幼苗显着升高。我们进一步分析了低剂量60Co-γ辐照对拟南芥NADPH氧化酶编码基因RBOHs表达的影响,结果表明,50 Gy 60Co-γ辐照显著促进了Atrboh B,Atrboh F和Atrboh D基因的表达,其中Atrboh D基因表达升高最明显。通过分析对照和辐照处理拟南芥幼苗中抗氧化酶活性,我们发现低剂量60Co-γ辐照刺激过氧化物酶(POD),超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性升高。为了明确活性氧(ROS)是否在低剂量60Co-γ辐照的生长刺激效应中发挥作用,我们检测了ROS清除剂DMSO处理的生物学效应,结果显示,DMSO处理显着抑制了低剂量60Co-γ辐照对种子萌发和幼苗生长的促进作用,而不影响对照种子的萌发和幼苗的生长。我们进一步分析了拟南芥幼苗中ABA的含量。结果表明,经50 Gy 60Co-γ辐照,野生型拟南芥幼苗中ABA含量明显高于对照。而且,50 Gy 60Co-γ辐照ABA合成突变体aba2-1种子,其种子萌发指数,幼苗根长和鲜重与突变体对照相比没有显着差异,而相同辐照却显着促进野生型拟南芥幼苗生长。我们还研究了低剂量60Co-γ辐照诱导的ABA与ROS之间的关系。结果显示,与未辐照的aba2-1幼苗相比,低剂量60Co-γ辐照没有增加aba2-1幼苗中的H2O2含量。而且,DMSO处理也没有明显影响野生型和突变体幼苗中的ABA含量。此外,对ABA合成、代谢、转运相关基因转录表达定量分析发现,低剂量60Co-γ辐照显著上调了ABA合成途径的一些基因,分解代谢相关基因表达没有明显变化,编码ABA转入蛋白的At ABCG40基因的表达显着上调,而编码ABA转出蛋白的At ABCG25基因的表达被抑制。我们的结果推测ABA参与了低剂量60Co-γ辐照对拟南芥幼苗生长的促进效应。在50 m M或100 m MNa Cl处理条件下,50 Gy 60Co-γ辐照减轻盐胁迫对拟南芥生长的抑制作用最明显,表现为种子萌发指数和幼苗根长显着高于对照。H2O2含量分析表明在盐胁迫下低剂量60Co-γ辐照使幼苗中H2O2含量显着低于对照幼苗含量。而且,50 Gy 60Co-γ辐照显著减少脂质过氧化指标丙二醛(MDA)的含量。抗氧化酶活性分析表明,低剂量60Co-γ辐照显著增加盐胁迫下拟南芥幼苗中POD,SOD和CAT的活性,而且CAT活性最高。脯氨酸含量分析表明,低剂量60Co-γ辐照显著促进盐胁迫下拟南芥幼苗积累脯氨酸。此外,荧光定量分析基因转录表达发现,低剂量60Co-γ辐照显著上调了盐胁迫信号途径相关基因的表达,例如SOS信号途径的SOS1、SOS2、SOS3和盐胁迫响应基因AREB1、DREB2、RD29A和RD29B。我们的结果推测低剂量60Co-γ辐照通过调控生理过程和盐胁迫信号相关基因的表达增强拟南芥抗盐性。在75μM Cd Cl2或0.5 m M Pb(NO3)2处理条件下,与对照相比,50 Gy 60Co-γ辐照最能促进拟南芥种子萌发和幼苗根的生长。不同生理参数检测分析表明,在重金属镉或铅胁迫下50 Gy 60Co-γ辐照降低了幼苗中H2O2含量,显着低于对照幼苗。50 Gy 60Co-γ辐照也显著降低MDA的含量。而且,低剂量60Co-γ辐照显著促进镉或铅胁迫下拟南芥幼苗中抗氧化酶SOD,POD和CAT的活性。脯氨酸含量分析表明,低剂量60Co-γ辐照显著促进重金属胁迫下拟南芥幼苗中脯氨酸含量的积累。此外,对植物防御重金属镉或铅胁迫相关基因表达分析表明,低剂量60Co-γ辐照显著上调了重金属转运蛋白基因At PDR8和At PDR12以及重金属胁迫相关的At ATM3和At PCR1的表达。我们的结果表明低剂量60Co-γ辐照增强拟南芥对重金属镉或铅胁迫的耐受性。综上所述,我们的研究结果表明ROS和ABA信号参与低剂量60Co-γ辐照对拟南芥幼苗生长的刺激效应。在盐和重金属镉或铅胁迫下,低剂量60Co-γ辐照通过增强抗氧化酶活性,降低植物细胞氧化胁迫,积累脯氨酸含量以及调控逆境胁迫信号途径中相关基因的表达减缓环境胁迫对拟南芥幼苗的伤害,提高抗逆性。
参考文献：
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[4]. 中能碳离子束辐射百脉根突变体库创制及花瓣衰老延迟突变体机理研究[D]. 骆善伟. 中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所). 2018
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[7]. 低能离子注入拟南芥的生物学效应分析[D]. 马晶晶. 湖南农业大学. 2002
[8]. 拟南芥AtFes1A与植物耐热性[D]. 张景霞. 山东师范大学. 2011
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[10]. 低剂量~(60)Co-γ辐照拟南芥的生长刺激效应及增强抗逆性的机理研究[D]. 祁文彩. 郑州大学. 2015
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