AFM研究微绒毛、细胞膜微丝骨架及应用

论文摘要

细胞膜是细胞最重要的结构成分,在维持细胞内环境稳态和多种生理功能中均起到重要作用,而细胞膜的某些生理功能的发挥离不开细胞表面的一些特殊结构,如微绒毛,它在营养物质吸收、免疫调节、信号传导等活动中起到重要作用。由于传统技术的限制,生理条件下,纳米尺度上微绒毛结构的变化与吸收功能的关系还没有直接的证实。微丝不但对微绒毛结构起到支撑作用,还是细胞结构的重要成分,参与细胞形貌的维持、细胞粘附、细胞运动等生理功能,而近生理条件下,微绒毛和微丝在细胞中的空间分布特点还存在许多问题尚待探讨。此外,微丝参与机械力引起的多种生理活动,然而微丝是否参与相邻细胞间自噬信号的传递还不清楚。原子力显微镜(AFM)在细胞生物学研究中具有特殊优势,可以生理条件下对多种生物样品进行高分辨成像的同时获得样品的理化性质,已经应用于从单分子、细胞到组织样品的研究中。本文针对以上问题,利用AFM的高分辨成像,以及精准控制力优势,结合荧光显微镜的成像特点,在活细胞水平上,观察了微绒毛和微绒毛簇的动态变化;近生理条件下,纳米尺度上,研究了微绒毛结构的变化与吸收功能的关系,以及微丝和微绒毛的空间分布特点;此外,还初步探究了微丝在机械力引起的相连细胞间自噬信号传递中的重要作用。主要内容如下:第一,通过AFM的高分辨成像,在纳米尺度上,观察到细胞表面的微绒毛结构,获得单根微绒毛的尺寸及形貌特征。对活细胞进行连续原位成像,研究了细胞表面两种亚型的单根微绒毛及微绒毛簇的动态变化,发现了单根微绒毛的生长周期和微绒毛簇的解聚和聚合的现象。此外,对饥饿状态下,微绒毛结构的变化与葡聚糖吸收的直接相关性进行了研究,发现了微绒毛结构是动态可逆的变化。第二,基于AFM精准控制力的特点,探究了细胞膜外微绒毛及细胞膜内侧微丝的分布。在基本不破坏细胞结构的情况下,研究了微绒毛及微丝结构在细胞中的两层分布:细胞膜表面为微丝构成的单根和聚集成簇的微绒毛结构以及在这层下面是由粗细不同的微丝构成的致密网格结构。此外,通过AFM高分辨成像还获得了的单根微丝的形貌和细胞内致密微丝网格结构的特点。第三、利用AFM精准控制力的优势,还初步探究了微丝在自噬信号传递中的作用。通过AFM的针尖刺激细胞,研究了纳米机械力对细胞自噬水平的影响,发现了机械力引起的细胞自噬能传递给相连细胞,并且这种传递在同种或不同种细胞间均会发生。最后,通过构建N2a细胞的间隙连接,探究了间隙连接在相邻细胞间自噬传递中的作用。以上研究工作展示了AFM在研究活细胞的动态过程和细胞内微丝的空间分布中的优势,以及微丝在力信号传递中的功能。文章最后对以上工作进行了总结和展望。

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摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 细胞表面研究

1.2 细胞膜的结构与功能

1.2.1 细胞膜的结构

1.2.2 细胞膜的功能

1.3 微绒毛的结构与功能

1.3.1 微绒毛结构

1.3.2 微绒毛的功能

1.4 微丝的结构与功能

1.4.1 微丝的结构

1.4.2 微丝的功能

1.5 原子力显微镜

1.5.1 工作原理

1.5.2 工作模式

1.5.3 AFM在生物学研究中的应用

1.5.3.1 在细胞膜研究中的应用

1.5.3.2 在微绒毛研究中的应用

1.5.3.3 在微丝研究中的应用

1.5.3.4 在生物领域中的其他应用

1.6 小结

1.7 本研究课题的提出

第二章 AFM对细胞表面微绒毛结构的表征

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 实验材料和仪器

2.2.2 实验步骤

2.2.2.1 主要试剂的配制

2.2.2.2 细胞培养

2.2.2.3 微丝的染色

2.2.2.4 免疫荧光实验

2.2.2.5 微绒毛结构的动态

2.2.2.6 饥饿实验

2.2.2.7 细胞的吸收功能

2.2.2.8 微绒毛变化与吸收功能的关系

2.3 结果和讨论

2.3.1 联合AFM与荧光显微镜对细胞表面微绒毛结构表征

2.3.2 AFM对微绒毛结构动态观察

2.3.3 饥饿引起的微绒毛结构变化影响细胞吸收功能

2.4 小结

第三章 AFM对细胞膜微丝骨架结构的表征

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 实验材料和仪器

3.2.2 实验步骤

3.2.2.1 主要试剂的配制

3.2.2.2 细胞培养

3.2.2.3 微丝的染色

3.2.2.4 细胞不同层次结构表征

3.2.2.5 微丝空间分布的揭示

3.3 结果和讨论

3.3.1 激光共聚焦图像揭示细胞不同层次结构

3.3.2 联合AFM与荧光显微镜对细胞表面微绒毛结构表征

3.3.3 细胞膜相关的微丝骨架的超微结构的表征

3.3.4 联合AFM与荧光显微镜对细胞表面微丝表征

3.3.5 肌动蛋白微丝组成的空间异质结构的表征

3.4 小结

第四章微丝在细胞自噬传递中的作用

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 实验材料和仪器

4.2.2 实验步骤

4.2.2.1 主要试剂的配制

4.2.2.2 质粒的构建

4.2.2.3 细胞的培养

4.2.2.4 细胞稳定株的构建

4.2.2.5 细胞株的瞬转染

4.2.2.6 不同种细胞间连接的标记

4.2.2.7 AFM对细胞进行纳米机械力作用

4.2.2.8 微丝结构的染色

4.2.2.9 机械压力作用细胞

4.3 结果与讨论

4.3.1 细胞稳定株的获得

4.3.2 微丝在机械力感应中的作用

4.3.3 纳米机械力引起细胞自噬

4.3.4 细胞间自噬信号的传递

4.3.5 间隙连接在相连细胞自噬传递中的作用

4.4 小结

第五章总结与展望

参考文献

附录1 已发表和待发表文章目录

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘林

导师: 李宾

关键词: 原子力显微镜,荧光显微镜,微绒毛,微丝,自噬

来源: 中国科学院大学(中国科学院上海应用物理研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国科学院大学(中国科学院上海应用物理研究所)

分类号: Q241

总页数: 120

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