王德韬[1]2015年在《microRNA在非小细胞肺癌发生、发展进程中调控机制的研究》文中研究表明非小细胞肺癌占肺癌总数的80-85%,并伴有极高的死亡率,早期诊断可以改善这一现状。在多种NSCLC亚型中,经常检测出KRAS基因被激活和抑癌基因LKB1/P53失活。KRAS基因激活同时伴有LKB1/P53缺失的NSCLC恶性程度显着升高。但是,LKB1/P53缺失后的NSCLC特征性miRNA表达谱,以及这些miRNAs在肿瘤中的作用机制尚未系统研究。本研究中,我们通过solexa测序分析了正常小鼠(C57BL/6)、良性肿瘤小鼠模型(KRASG12D)和恶性肿瘤模型(KRASG12D/P53-/-和KRASG12D/LKB1-/-)的肺组织中差异表达的miRNAs。利用生物信息学的方法分析了30个持续性表达上调和24个持续性表达下调miRNAs的靶基因及靶基因富集的信号通路,并进一步分析了这些靶蛋白之间的蛋白互作关系。随后在54种与对照小鼠肺组织相比表达量下调的miRNAs中,选取miR-10a和miR-199a-5p在NSCLC细胞系中作进一步验证。研究发现,miR-199a-5p和miR-10a的表达量在小鼠肺癌组织模型和人临床组织样本中显着降低。研究证明,miR-199a-5p在NSCLC细胞中通过靶向MAP3K11抑制细胞的增殖和周期。miR-10a则通过抑制MAP3K7和WNK3抑制非小细胞肺癌的增殖,促进细胞凋亡。研究一并证实了P53可以在肺腺癌细胞系SPCA-1中调控miR-10a的转录。P53作为重要的转录因子在肿瘤发生进程中扮演重要角色。研究发现,miR-150可以通过靶向P53 mRNA的3'-UTR调控P53的表达,进而影响细胞周期。P53缺失的H1299细胞中过表达P53后,检测发现miR-34a,miR-184,miR-181a和miR-148的表达量显着升高。综上研究结果表明,miR-150,P53以及相关miNRAs在NSCLC中组成网络,调控NSCLC的发生和发展。
吕晶玉[2]2003年在《WNK基因表达的研究》文中研究指明前言 WNK激酶是一个新的蛋白激酶家族，是With no lysine kinase的缩写。该激酶家族成员在通常保守的位于激酶区域第二亚区的赖氨酸位点，赖氨酸被半胱氨酸所替代，但激酶的生物活性没有发生变化。而其它蛋白激酶此位点的改变通常会丧失激酶生物活性。高表达WNK激酶家族的一个成员——WNK1在HEK293细胞中，没有检测到已知的作用底物生物活性的变化，说明WNK激酶属于一个新的信号传导通路。 大鼠的WNK1基因是这个家族中第一个被克隆的基因。2001年，Wilson等克隆了此家族的另两个成员——人的WNK1和WNK4基因，分别位于12号和17号染色体，这两个基因是一种孟德尔遗传型高血压病的致病基因，致病突变分别是WNK1基因第一内含子的大片段缺失，导致患者白细胞的基因表达量提高5倍左右。WNK4基因突变是位于coiled-coil区域附近一段高度保守区域的错义突变。Northern印迹杂交表明WNK1广泛表达在人类、大鼠和小鼠的各个组织中，有两个转录子。而WNK4则主要在肾脏中表达。 Ⅱ型假性低醛固酮血症(pseudohypoaldosteronism type Ⅱ，PHAⅡ，OMIM #145260)，也被称为Gordon综合症。它以高血压，高血钾和代谢性酸中毒为主要临床表现，它是氯依赖性的，临床异常能够被钠-氯共转子NCCT的特异性拮抗剂——双氢克尿噻纠正，说明此疾病的发生和离子转运相关。 WNK激酶不同于其它蛋白激酶，它们的上游调控子和下游作用底物仍不清楚。免疫荧光表明WNK1激酶位于多种和氯离子内流相关的上皮中，表明它在多种组织中参与氯离子转运的调控。WNK4激酶是紧密复合物的一部分。实验表明野生型WNK4能够抑制NCCT对钠离子的摄入，而WNK1能够抑制这种负调控作用。说明WNK激酶和离子转运通道相作用，调控离子转运，与高血压病的发生相关。 本实验应用克隆、测序、Northern印迹杂交、原位杂交、体外翻译和免疫共沉淀技术，旨在研究WNK基因的表达情况及WNK4激酶的功能。材料与方法 1.材料与试剂 人肾脏组织来源于医院交通创伤患者，小鼠肾脏组织来源于Bal b/c小鼠。pGEM一T载体，感受态细菌JM109，反转录试剂盒和体外翻译试剂盒均购自Promega公司。PcDNA3 .1载体，DH5a感受态细菌及PCR扩增试剂购自Invitrogen公司。Bigdye购自ApPlied Biosystem公司。Northern印迹杂交膜和eo一irrununopreeipitation kit购自Clonteeh公司。同位素购自Am-ersh二和NEN公司。质粒纯化及组织总RNA提取试剂盒购自QIAgen公司。限制性内切酶购自Biolab公司。 2.克隆人WNK4全长cDNA到pGEM一T载体中 提取人肾脏总翻A，用位于WNK4 cDNA第7一27和3808一3833的序列为上下游引物，用long template expanded PCR system扩增WNK4全长eD-NA，产物经纯化后连接到pGEM一T载体，转化感受态细菌，PCR筛查阳性克隆，小量制备阳性质粒，酶切质粒，选取含有正确插人片段的质粒进行测序反应，Navigator 4.0软件分析结果，对序列完全正确的质粒进行大量制备，冻存备用。 3.WNK4基因全长的SNPs检测 设计引物，使PCR产物单一并覆盖基因全长，纯化扩增产物，进行测序反应，用G50纯化产物，于3700型自动测序仪上测序，Navigator 4.0软件分析结果，并进行统计学分析。 4.WNKI基因不同探针的Nori五二印迹杂交 PCR扩增人WNKI基因外显子l，4，5，10一15，以a，转录终止子下游1.6kb一2.2kb片段，纯化产物，同位素标记探针，与人多种组织杂交，洗膜后，曝光在X光片下，洗片并分析结果。 5.原位杂交 以小鼠肾脏总翩A为模板，扩增WNKI基因外显子1，24一28，以a片段和WNK4基因外显子13一16片段，纯化后连接在pGEM一T载体上。筛选阳性克隆，测序，大量制备序列完全正确的质粒。以这些质粒为模板，PCR扩增插人片段，纯化后标记同位素，与小鼠多组织杂交，确定探针特异性。线性化质粒，分别用竹和SP6 RNA多聚酶，掺人3，s一dUTp，体外转录正义和反义探针。检测探针的cPm值。对小鼠肾脏组织切片脱蜡，预杂交，杂交，洗切片，脱水，曝光在X光片下，洗片分析结果，根据信号强弱决定曝光时间。将切片浸人感光乳胶中曝光一定时间，然后洗切片，染色，置于显微镜下观察结果。 6.构建表达载体 .构建带有e一Myc标签的syntenin表达载体.，构建带有HA标签的人WNK4基因coiled一coilZ区域连同附近一个基序的表达载体。用含有限制性酶切位点的上下游引物，以小鼠肾脏总RNA为模板，扩增syntenin基因cDNA，酶切peDNA3 .1载体和扩增产物，纯化酶切产物，T4连接酶连接syn-tenin和载体，转化感受态细菌DHS。，PCR筛查阳性克隆，小量制备阳性质粒，酶切质粒，对结果正确的质粒进行测序反应，分析测序结果，对正确的质粒进行大量制备，冻存备用。以含有wNK4全长。DNA的pGEM一T载体为模板，用含有HA标签及酶切位点的上下游引物进行PCR扩增，酶切peDNA3 .1载体和扩增产物，其它同上。 7.体外翻译蛋白质 用TNT竹eoupled retieuloeyte lysate system kit体外翻译蛋白质，加人l林g的syntenin一e一
张瀚文[3]2014年在《大鼠视交叉上核（SCN）昼夜节律性别差异及WNK3激酶的相关性研究》文中研究表明地球上几乎所有生物，其生理机能、生化代谢和行为表现，诸如体温和血压日夜波动、激素水平起伏涨落、睡眠-觉醒交替等均呈现约24h与日节律相一致的规律性变化，这种现象叫做昼夜节律。维持正常的昼夜节律对生物体具有十分重要的作用，昼夜节律紊乱常常导致多种疾病和行为异常，比如睡眠障碍、内分泌紊乱、心血管疾病、肿瘤、动物迁徙和求偶异常等。既往研究发现，睡眠觉醒过程做为昼夜节律最突出的表现在男女是不同的，在正常的睡眠状况下，女性比男性更愿意早睡早起，且女性常常比男性主诉更多的睡眠问题；此外，女性褪黑素和深部体温等反映昼夜节律的指标时相比男性提前，提示了男女昼夜节律可能存在差异。哺乳动物昼夜节律分叁级调控，其一级中枢定位于下丘脑视交叉上核（Suprachiasmatic nucleus SCN）区域，被喻为哺乳动物昼夜节律的“起搏点”，目前认为只受到光照调节，因此，观察SCN区自身昼夜节律是否存在性别差异可能解释两性睡眠、深部体温和褪黑素分泌等这些外在昼夜节律表现差异。首先，SCN区昼夜节律的分子学基础是由一系列转录-翻译正负反馈的钟基因和调节钟基因表达的激酶所构成。Per1（Period1，周期基因1），Cry1（Cryptochrom1，隐花色素基因1），Clock（Circadian Locomotor Output Cycles Kaout，时钟基因），Bmal1（Brain and Muscle Arnt Like protein-1，脑和肌肉组织芳香羟受体核转运类似蛋白-1）等钟基因做为SCN区昼夜节律正负反馈的核心组件对昼夜节律产生具有重要作用，因此，观察这些钟基因表达昼夜节律是否存在性别差异可以反映两性SCN区昼夜节律是否具有性别差异。其次，我科在前期工作中发现，WNK3（With No Kinas3）激酶作为一种新的丝苏氨酸激酶，可能通过磷酸化钟基因参与生物钟的调控。其本身位于X染色体，自身表达可能存在性别差异。因此，SCN区昼夜节律性别差异也可能源自于SCN区调控钟基因的某些激酶表达性别差异造成。综上所述，因此，深入研究昼夜节律性别差异及其调节机制，对深入理解两性昼夜节律特点以及对男女节律紊乱疾病差异化治疗具有重要意义。本研究分为两个部分：第一，验证大鼠SCN区核心钟基因Per1，Cry1，Clock，Bmal1表达昼夜节律性及性别差异；第二，探究WNK3表达昼夜节律性和性别差异性，并对其参与昼夜节律性别差异调控机制进行探讨。第一部分验证大鼠核心钟基因表达昼夜节律性及性别差异目的：观察研究12h光照、12h黑暗（12h-light：12h-dark cycle，LD）条件下，不同时点雌、雄性大鼠SCN区钟基因Per1、Cry1、Clock、Bmal1转录表达，探究雌雄大鼠生物钟昼夜节律是否存在分子学水平差异。方法：1、取体重和日龄相近大鼠按照性别分为两组，于LD条件下饲养2周建立稳定节律；2、一昼夜（24h）内每隔4h随机选取雌、雄动物各一只取SCN区冻存备用(至少取材叁批)；3、运用实时定量PCR（Real-time PCR）技术对雌、雄性大鼠SCN区钟基因Per1、Cry1、Clock、Bmal1各时点mRNA表达进行定量分析；4、通过振幅F检验验证钟基因mRNA表达是否具有昼夜节律；5、运用余弦节律软件拟合节律曲线获得节律参数，比较雌、雄动物SCN区核心钟基因Per1、Cry1、Clock、Bmal1表达昼夜节律参数是否具有性别差异。结果：1、在LD光照条件下，雌、雄大鼠SCN区核心钟基因Per1、Cry1、Clock、Bmal1表达呈现昼夜节律波动（振幅F检验，P＜0.05）；2、在LD光照条件下，不同性别大鼠各钟基因表达昼夜节律参数比较如下：1）、与雄性相比，雌性Cry1mRNA表达的峰值相位显着提前（Students’ t test, P＜0.001），而两性昼夜节律其他参数诸如振幅、中值、峰值相和谷值相mRNA水平相一致（Students’t test, P＞0.05）；2）、与雄性相比，雌性Bmal1mRNA表达的峰值相位显着提前（Students’ t test, P＜0.01），峰值相mRNA水平低于雄性（Students’ t test, P＜0.05），昼夜节律中值水平低于雄性，（Students’ t test, P＜0.05），而两性昼夜节律振幅和谷值相mRNA水平相一致；3）、两性Clock和Per1mRNA表达的所有昼夜节律参数（峰值相位及时间、振幅、中值、峰谷相mRNA表达水平）等均无统计学差异（Students’ t test, P＞0.05）。结论：在LD光照条件下，雌、雄大鼠SCN区昼夜节律呈现性别差异，但在分子水平，并不是所有的钟基因均能反应出这种差异，其中，雌性Cry1、Bmal1昼夜节律曲线峰值相位较雄性的显着提前，而两性Clock、Per1的所有昼夜节律参数均未呈现统计学上差异。第二部分探究WNK3激酶昼夜节律性和性别差异目的：探究雌、雄大鼠下丘脑视交叉上核WNK3激酶表达是否具有昼夜节律和性别差异，对WNK3激酶参与昼夜节律性别差异调控机制进行初步探讨。方法：1、取体重和日龄相近大鼠按照性别分为两组，于LD条件下饲养2周建立稳定节律；2、一昼夜（24h）内每隔4h随机选取雌、雄动物各一只取SCN区冻存备用(至少取材叁批)；3、运用实时定量PCR（Real-time PCR）和Western blot技术对雌、雄性大鼠SCN区WNK3各时点转录和表达进行定量分析；4、通过振幅F检验验证WNK3表达是否具有昼夜节律；5、运用余弦节律软件拟合节律曲线获得节律参数，比较雌、雄动物SCN区WNK3表达昼夜节律参数是否具有性别差异。结果：1、在LD光照条件下，雌、雄大鼠SCN区WNK3蛋白和mRNA表达均呈现昼夜节律性（振幅F检验，P＜0.05）；2、在LD光照条件下，雌、雄大鼠SCN区WNK3蛋白和mRNA表达昼夜节律参数比较结果：1）、与雄性相比，雌性WNK3蛋白表达的峰值相位显着提前（Students’ t test, P＜0.001），而两性昼夜节律其他参数诸如振幅、中值、峰值相和谷值相蛋白水平相一致（Students’ t test,P＞0.05）。2）、两性WNK3mRNA表达所有昼夜节律参数诸如峰值相位、振幅、中值、峰值相和谷相mRNA水平等均无统计学差异（Students’ t test, P＞0.05）；3、在LD光照条件下，雌、雄SD大鼠SCN区与WNK3mRNA表达在各昼夜节律参数均相一致的钟基因为Clock；而与WNK3蛋白表达相一致的钟基因为Cry1。结论：1、在LD光照条件下，雌、雄大鼠SCN区WNK3转录和表达呈现昼夜节律波动；2、在LD光照条件下，WNK3蛋白表达昼夜节律参数呈现性别差异，其中，雌性的峰值相位较雄性的显着提前，而WNK3mRNA表达昼夜节律在两性别间未见统计学差异；3、Clock和Cry1可能为WNK3参与SCN区昼夜节律性别差异相互作用的候选分子
李苗[4]2008年在《GATA-1乙酰化对WNK4基因表达调控机制的研究》文中提出前言WNK4(with no lysine[K]kinase-4)基因是新近分离克隆的一个蛋白激酶基因,该基因第7外显子(exon7)和第17外显子(exon17)突变可导致常染色体显性遗传性疾病,假性低醛固酮血症(Pseudohypoaldosteronism typeⅡ,PHAⅡ)。研究表明WNK4可以作用于肾脏远曲小管和集合管上的离子转运体(Na-Cl共转运体,NCCT)和离子通道(钾离子通道,ROMK),从而起到对血压和离子平衡的调控作用。目前大量的研究集中在探索WNK4基因的功能上,但WNK4基因的上游调控因子仍不清楚。乙酰化在多种基因的表达调控中发挥重要作用,两类作用相反的酶,组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)参与调节蛋白质乙酰化状态。曲古抑菌素A(TSA)能够特异性抑制HDAC活性从而引起组蛋白和一些转录相关因子的乙酰化。迄今为止尚无有关乙酰化对WNK4基因表达调控的研究。本研究以TSA作为乙酰化作用因素,探索乙酰化对人胚肾HEK293细胞中WNK4基因rnRNA和蛋白表达水平的影响,并鉴定WNK4启动子区的GATA-1反应元件及TSA对GATA-1蛋白乙酰化水平及DNA亲和力和WNK4启动子活性的影响,从而探索乙酰化调节WNK4基因表达的机制。材料与方法一、实验材料1、人胚肾HEK293细胞系2、胚胎(胎龄22周)肾脏组织标本3、Real-time PCR及Western印迹杂交相关试剂4、基因克隆及萤光素酶报告基因检测相关分子生物学试剂5、电泳泳动迁移实验(EMSA)、染色质免疫沉淀(ChIP)及免疫沉淀(IP)相关试剂二、实验方法1、Real-time RT-PCR检测TSA刺激前后WNK4 mRNA表达水平的变化。2、Western印迹杂交检测TSA对WNK4蛋白表达水平的影响。3、应用软件及萤光素酶报告基因系统分析WNK4启动子结构。4、RT-PCR实验检测GATA-1mRNA在HEK293细胞及胚胎肾脏组织中的表达。5、EMSA及ChIP鉴定WNK4启动子内GATA-1反应元件及TSA对GATA-1蛋白与该位点结合力的影响。6、免疫沉淀结合Western印迹杂交检测TSA对GATA-1蛋白乙酰化水平的影响。7、萤光素酶报告基因检测GATA-1反应元件在TSA对WNK4启动子活性影响中的作用。结果1、Real-time RT-PCR结果显示TSA以浓度依赖方式上调WNK4 mRNA表达水平。2、Western印迹杂交表明TSA诱导的乙酰化使HEK293细胞中WNK4蛋白水平显着增加。3、软件分析及萤光素酶报告基因检测在WNK4启动子内发现了一些潜在的受乙酰化调控的转录因子结合位点。4、RT-PCR的结果提示GATA-1 mRNA在HEK293细胞及胚胎肾脏组织中有明显的表达。5、EMSA及ChIP实验在分别在体外及体内条件下证明了WNK4启动子-426～-416区为GATA-1反应元件,并且TSA使GATA-1蛋白与该位点结合增强。6、免疫沉淀结合Western印迹杂交显示TSA可直接引起GATA-1蛋白的乙酰化。7、应用萤光素酶报告基因系统证明了GATA-1反应元件是WNK4启动子中一个强大的正调控元件,同时它在TSA诱导的WNK4启动子的转录激活中发挥重要作用。结论1、WNK4启动子-426～-416区为GATA-1反应元件。2、TSA引起的GATA-1乙酰化可增强其与WNK4基因启动子GATA-1反应元件的结合,从而上调WNK4启动子转录活性,这是乙酰化调节WNK4基因表达的一种机制。
钱盈佳[5]2011年在《在转基因水稻中超量表达WNK激酶基因的研究》文中提出白叶枯病是水稻的“叁大病害”之一,Xa21基因是最早克隆的水稻抗病基因。经酵母杂交实验研究发现WNK激酶蛋白能与水稻白叶枯病抗性基因Xa21介导的XB3蛋白相互作用。本研究以水稻WNK激酶家族的8个成员为研究对象,借助于转基因技术,分别构建了8个WNK激酶基因的过表达载体,并将这些过表达结构分别导入感病水稻品种台北309中,并通过接菌实验调查各转基因植株的抗病性,以期分析WNK激酶基因的表达对水稻白叶枯病抗病途径的影响。这一研究将有利于进一步认识水稻白叶枯病抗病的分子机制。主要研究结果如下：(1)在已公开的数据库中检索获得水稻WNK激酶基因家族8个成员的cDNA序列,并对其编码区序列进行了成对比较。在此基础上,在农杆菌双元载体上分别构建了由玉米Ubi启动子控制的WNK激酶基因的过表达载体。(2)通过农杆菌介导的转化法将构建的过表达结构导入了感病水稻品种台北309中,已获得了含各载体的转基因水稻植株。对转基因水稻植株进行潮霉素抗性及目的基因PCR分析,证明目的基因已整合入转基因水稻基因组中。经过多代种植检测,在部分转化子中选育获得了纯合转基因系。(3)对部分转基因植株叶片总RNA进行了RT-PCR分析,结果表明大多数转基因植株中目的基因的表达量已有不同程度的提高。说明导入过表达结构已在转基因水稻中发挥了预期的作用。(4)对转基因水稻植株的白叶枯病菌混合菌株抗病接种试验结果显示,过表达WNK激酶基因的转基因水稻植株对白叶枯病菌混合菌株的抗性均有一定的提高。(5)经常规杂交将含WNK转基因纯合系与含Xa21基因的台北309转基因植株聚合,对聚合两个转基因的阳性植株用强致病菌P6进行接种,调查其抗病性,并与未转化对照比较。结果显示,聚合后部分阳性植株与未转化对照相比,抗病性有了极显着增强。
杨建琪[6]2015年在《肾细胞癌中WNK2基因甲基化状态与mRNA表达的研究》文中研究指明目的:肾细胞癌(Renal Cell Carcinoma,RCC)是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一,其恶性程度较高,易发生转移,近年来其发病率仍处于上升趋势。目前,RCC的发病机制还未完全清楚,流行病学调查研究显示:吸烟、肥胖、高血压、糖尿病、遗传等因素可能与肾细胞癌的发生有关。抑癌基因的失活是恶性肿瘤发生的重要原因之一。随着表观遗传学的不断发展,目前发现多种表观遗传学修饰方式,主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和RNA干扰等,其中DNA甲基化是最重要的修饰方式之一。许多观点认为,抑癌基因的失活与DNA启动子区异常甲基化密切相关。研究发现,几乎所有蛋白激酶在激酶结构域第2亚单位有一个高度保守的赖氨酸,但在WNK激酶中缺失此赖氨酸,因此得名With no K kinase(K代表赖氨酸),缩写为WNK。WNK2是WNK家族成员之一,位于人类染色体9q22.31,是新发现的一个抑癌基因。WNK2基因主要通过表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)介导的Ras/Raf/丝裂原激活蛋白激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信号传导通路和Rac/p21活化激酶(p21 activated kinase,PAK)信号传导通路之间的串话机制来调节细胞周期。最初在神经胶质瘤中发现WNK2基因启动子区高甲基化导致其表达沉默,随后在脑膜瘤、胰腺导管腺癌中也发现了WNK2基因启动子区的高甲基化。但是,WNK2基因与RCC之间的相关研究还未见报道。本课题以RCC组织、癌旁组织及正常肾组织为标本,研究WNK2基因启动子区的甲基化状态及m RNA表达水平,同时分析它们与临床数据之间的关系,探讨WNK2基因在RCC发生及发展中的作用,目地为RCC的病因、临床诊断和治疗提供新的思路。方法:1 WNK2基因启动子区甲基化状态检测:应用甲基化特异性聚合酶链式反应(Methylation Specific PCR,MSP)法检测58例RCC组织及相对应的癌旁组织和正常肾组织中WNK2基因的甲基化状态,并分析WNK2基因的异常甲基化在RCC发生、发展中的作用以及与临床数据间的关系。2 WNK2基因的m RNA相对表达量检测:采用反转录聚合酶链式反应(Reverse Transcriptase-PCR,RT-PCR)法检测WNK2基因m RNA在58例RCC组织及相对应的癌旁组织和正常肾组织中的相对表达量,并分析在RCC组织中WNK2基因m RNA相对表达量和临床数据间的关系。3采用统计学软件包SPSS20.0对实验数据进行分析。结果:1 RCC组织中WNK2基因甲基化状态RCC组织中WNK2基因甲基化状态有叁种:即完全甲基化、半甲基化、完全非甲基化。2 RCC组织、癌旁组织和正常肾组织中WNK2基因甲基化状态及与临床资料之间的关系2.1 RCC组织、癌旁组织和正常肾组织中WNK2基因启动子区的甲基化状态及比较在58例RCC组织、58例癌旁组织和58例正常肾组织中WNK2基因启动子区甲基化阳性率分别为65.5%(38/58),34.4%(20/58),10.3%(6/58),叁组间存在明显差异(X2=38.161,P=0.000)。RCC组织的甲基化阳性率明显高于癌旁组织(X2=11.172,P=0.001)及正常组织(X2=37.495,P=0.000)。2.2 RCC组织中WNK2基因启动子区甲基化状态在不同临床资料间的比较WNK2基因启动子区甲基化状态在性别(P=0.820)、年龄(P=0.134)、分期(P=1.000)、肿瘤大小(P=0.718)这些不同临床资料之间的差别无统计学意义(P均大于0.05)。3 58例RCC组织、58例癌旁组织和58例正常肾组织中WNK2基因m RNA的相对表达量,以及RCC组织中WNK2基因m RNA相对表达量与临床资料之间的关系3.1在58例RCC组织、58例癌旁组织和58例正常肾组织中WNK2基因相对表达量分别为0.54±0.03、0.66±0.05、0.68±0.03,经统计学分析,叁组之间有显着差异(P<0.05)。WNK2基因m RNA在RCC组织中的相对表达量明显低于癌旁组织(P<0.05)及正常肾组织(P<0.05)。3.2 WNK2基因的m RNA相对表达量与性别(P=0.142)、年龄(P=0.217)、肿瘤大小(P=0.145)这些不同临床资料之间的差别无统计学意义(P均大于0.05)。4在RCC组织中,WNK2基因m RNA的相对表达量在甲基化阳性病例中为0.52±0.04低于甲基化阴性病例中m RNA的相对表达量0.57±0.02,P<0.05,差异有统计学意义。结论:1在正常肾组织、癌旁组织和RCC组织中,WNK2启动子区甲基化阳性率呈升高趋势,提示WNK2基因启动子区的异常甲基化可能参与RCC的发生。2在正常肾组织、癌旁组织和RCC组织中,WNK2基因m RNA相对表达量呈下降趋势,提示WNK2基因m RNA的表达下调可能参与RCC的形成。3在RCC组织中,甲基化阳性组中WNK2基因m RNA的相对表达量低于甲基化阴性组中m RNA的相对表达量,并且差异有统计学意义,提示WNK2基因启动子区高甲基化可能是导致其m RNA表达的降低的原因之一。
黄大维[7]2012年在《使用比较基因组学手段分析转录区域核酸组分的特征和演化的分子机制》文中研究指明转录区域是基因组中存储遗传信息的主要区域之一,其核酸组分的特征常常表现为碱基含量的不平衡,是基因组学研究中的重要研究方向之一。核酸组分的不均衡的一个重要特征是GC含量由基因的5’端向3’端先升高后降低的梯度分布现象,称为GCgradient。 GC gradient存在于单子叶植物中,但不存在于双子叶植物中,其形成与转录偶联突变有关。在细菌和后生动物中是否存在GC gradient,其形成是否也与转录偶联突变有关,其主要的影响因素有那些,目前尚缺乏系统的研究。在后生动物中大量存在的内含子位于转录区域,其核酸组成特征与编码区不同。后生动物自冷血到温血发生了内含子长度扩增的演化过程。内含子长度扩增的机制、其与GC gradient的关系、其核酸组分在演化中的变化目前仍缺乏系统的研究。在以上的框架下,我们的研究使用了比较基因组学的手段,分析了细菌和后生动物的GC gradient特征和不存在细菌中但在后生动物中普遍存在的内含子的长度扩增趋势及此趋势对转录区域核酸组分的影响,得到的结果如下。使用全基因组霰弹法测定的长双歧杆菌Bifidobacterium longum subsp. longum BBMN68基因组长2265943bp,具有59.95%的GC含量。对BBMN68和其他长双歧杆菌基因组的比较分析显示7株都不具有典型的前导链后随链的碱基不对称,显示了长双歧杆菌在复制过程中的特殊性。我们接下来用滑动窗口的方法分析了长双歧杆菌在起始密码子及附近区域1、2、3位的GC含量(GC1、GC2、GC3)、发现其在基因间区无明显区别。与单子叶植物不同,我们在长双歧杆菌的转录区域未发现典型的GC gradient。在编码区,我们发现了GC3>GC1>GC2的现象；基因间区的GC含量在50%左右。对已经公布基因组序列的另外1640株细菌的GC1、GC2、GC3的分析显示存在叁种GC含量特征类型：转录单元内GC1>GC2>GC3,基因间区GC含量在10%～40%；转录单元内GC1>GC3>GC2,基因间区GC含量在30%～55%；转录单元内GC3>GC1>GC2,基因间区GC含量在40%～75%。我们还发现GC1,GC2, GC3的变异系数在基因间区的GC含量小于40%时,与GC含量呈现负相关；而在基因间区的GC含量大于50%后,则由负相关变为正相关。在后生动物中,我们继续进行GC gradient的研究,在温血脊椎动物中也含有类似单子叶植物的GC gradient,与前人结论一致,即GC gradient出现于温血脊椎动物和冷血脊椎动物的过渡阶段。在人睾丸中高表达的基因倾向于存在更显着的GC gradient。在5’UTR中存在intron (UTR5I)的基因,其UTR5I的总长度越短,GC gradient的趋势越显着。5’UTR更长的基因具有更弱的GC gradient特征。起始密码子向3’方向下游的外显子内跳动,会移动CDS区域中的内含子进入5’UTR而迅速增加5’UTR长度,因此这种突变会导致GC gradient减弱。进一步分析发现含有UTR5I的基因在始密码子下游,ATG密码子出现频率较高,使得起始密码子在突变压力下可以向3’方向移动。由于具有不同的5’UTR结构的isoform可能具有不同的GC gradient,我们研究了使用不同起始密码子的全长isoform。根据isoform产生的机制将其分为两类：AS型(使用邻近或相同的启动子,并由于可变剪切(alternative splicing, AS)产生不同的isoform)和AP型(使用位置相差较远的启动子,并由于使用不同启动子(alternative promoter, AP)转录不同的isoform)。我们发现AP型基因倾向于比AS型长,并具有更明显的GC gradient特征。AP型基因的内含子倾向于使得其isoform的hnRNA长度差异更大,且这些内含子行使表达调控功能。Slide Window Ka/Ks值显示一般AP型isoform共有的exon承受比N端区域更高的选择压力。我们在后生动物中进一步研究发现,5’UTR内含子在数量和长度上均呈现从低等到高等的增加趋势,且内含子长度增加主要是由其中的重复序列引发的。在基因组的演化史中,DNA、LTR、LINE先发生了扩增,导致了内含子的长度增加,之后SINE发生了扩增,进一步提高了内含子的长度和GC含量。在脊椎动物中,内含子作为转录区域的主要组成部分,其GC含量的演化引起了转录区域核酸组成的变化。由于在生殖细胞中转录偶联的突变和转座子扩增是可以遗传的且均依赖转录,因此生殖细胞中的转录过程在基因的演化过程中扮演了重要的角色。
谢敏敏[8]2013年在《拟南芥WNK家族基因AtWNK9的功能研究》文中研究指明拟南芥AtWNK9基因属于WNK基因家族，本研究先利用生物信息学的方法对AtWNK9蛋白结构、磷酸化位点、启动子顺式作用元件、基因组织器官表达模式进行了分析。结果显示AtWNK9属于丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族，存在多个磷酸化位点，启动子区域含有多个激素和非生物胁迫响应元件，且AtWNK9基因主要在根中表达，定位在细胞核内。构建了AtWNK9过量表达载体，并转化拟南芥获得了AtWNK9过量表达株系；鉴定AtWNK9基因的T-DNA插入突变体，获得了wnk9缺失突变体纯合子。拟南芥原生质体转化实验证明AtWNK9定位在细胞核，实时定量PCR和GUS染色实验，发现AtWNK9基因在拟南芥根中高效表达。用ABA(100μM)、盐(300mM)、葡萄糖(2%)、热(37℃)、冷(4℃)处理14天大的野生型拟南芥，定量分析AtWNK9基因表达量，发现AtWNK9基因的表达量受ABA、NaCl、葡萄糖、热和冷等激素及非生物胁迫的诱导，其中ABA的诱导效果最明显；外源ABA处理时，AtWNK9的过量表达和功能缺失突变体与野生型相比，在主根伸长、气孔开度、失水率、脯氨酸含量等方面都存在明显差异，AtWNK9过表达突变体相对于野生型Col-4对ABA超敏感，而功能缺失突变体wnk9相对于野生型Col-0对ABA不敏感。对过量表达植株AtWNK9ox3、AtWNK9ox4、AtWNK9ox7和缺失突变体wnk9进行10~12天的干旱处理，发现过表达突变体的抗干旱能力明显比野生型强，而功能缺失突变体的抗干旱能力比野生型弱。定量PCR分析发现，外源ABA处理后，RAB18、RD22、ABI3和ABF3在过表达突变体AtWNK9ox3中表达量比野生型Col-4中高，而在功能缺失突变体wnk9中，表达量比野生型Col-0低； ABI1、ERA1在过表达突变体AtWNK9ox3中表达量比野生型Col-4低，而在功能缺失突变体wnk9中表达量比野生型Col-0高。综上所述，拟南芥AtWNK9通过影响ABA信号通路中相关基因的表达量，作为正调节子参与ABA的信号转导，增强了拟南芥的抗干旱能力。
孙志军[9]2004年在《WNK4基因在高血压病中的功能特性分析》文中研究指明目的 高血压病是当今世界最严重的社会公共健康复杂疾病之一，能引起一系列严重后果，如心衰、肾衰、心源性休克等。其发病受多种遗传因素和环境因素共同作用，其中遗传因素在高血压的发病机制中起重要作用。随着人类基因组测序的完成，研究与疾病表型的基因序列变异已成为医学遗传学的一个主要课题。单个核苷酸多态(single-nucleotide polymorphism，SNP)作为第叁代遗传标记，具有数量大、分布广的特点。系统地在群体水平上筛查鉴定SNPS，特别是编码区和基因调控区的SNPs，通过病例-对照组间的比较和统计学分析，就有可能获得与疾病相关联的SNPs位点或单倍型，这对于阐明某些复杂多基因疾病的遗传机制具有重要意义。WNK4(with no K=lysine kinase)基因是新近分离克隆的一种蛋白激酶基因。该基因第7外显子(exon7)和第17外显子(exon17)突变可导致常染色体显性遗传疾病假性低醛固酮血症(Pseudohypoaldosteronism type Ⅱ，PHAⅡ)。PHAⅡ主要表现为高血钾、代谢性酸中毒和高血压，而且WNK4基因已被定位于血压控制热点区域17q12-21上，因此WNK4基因可能与原发性高血压密切相关。为了阐明WNK4基因与原发性高血压的关系及其在原发性高血压发病机制中的作用，本研究在中国东北汉族高血压高发地区对WHK4基因位于编码区内的两个SNP进行了大样本RFLP筛查。同时对WNK4基因的表达调控机制及其与原发性高血压的关系进行初步研究。 方法 1．通过文献报道和小样本测序确定WNK4基因cSNP，之后进行大样本限制片断长度多态(restricted fragment long polymorphism，RFLP)检测，并对我国东北汉族高血压高发地区人群进行群体病例对照分析研究，探讨cSNP与原发性高血压的相关性。同时根据文献报道比较我国东北汉族人群与欧洲高加索人、非洲人及美国黑人等种族cSNP基因型频率和等位基因频率分布，了解不同种族间WNK4基因cSNP的种族分布差异。 2.RT一PCR方法分析WNK4基因表达谱:Trizol一步法提取胎儿不同组织RNA，以其为模板进行RT一PCR反应分析WNK4基因表达谱。 3.不同处理因素对WNK4基因表达的影响:分别以重组人雌激素、生长激素、胰岛素、地塞米松、血管紧张素n及空白对照处理COS一细胞24小时，Trizol一步法提取细胞RNA，分别进行RT一PCR及Northem杂交检测WNK4基因mRNA表达变化。 4.WNK4基因转录起始点确定:以人肾Marathon cDNA为模板，以5‘Marathon RACE反应确定WNK4基因转录起始点，根据基因组数据库所获得的WNK4基因序列设计3’基因特异性引物(3’GSP)，引物序列:5‘TGGGTCTCCATGTCCTCCrl’l，I’r3’。以聚合酶链反应方法在人Marathon cD-NA文库中进行扩增获得对应的cDNA片段，再一次扩增，以前次产物稀释50倍为模板，巢式PCR确定转录起始点。 5.构建WNK4基因启动子pCAT报道表达载体:以基因组DNA为模板，上游引物:5‘CACTGACCTCTCCGTTCGGC3’，下游引物:5’CAGATCAT-TCAGGGCAAAGAC3’，95℃预变性smin，然后按94℃lmin、60℃1而n、72℃lmin3Os进行35个循环，最后72℃延伸10min，扩增WNK4基因启动子序列。PCR产物纯化后，连接到pMD18克隆载体，质粒大量转化并提取质粒，Hindlll和Xbd双酶切，将纯化的酶切产物连接到pCAT载体构建wNK4基因启动子pCAT一WNK4一promoter报道表达载体，测序鉴定证实没有突变发生且符合阅读框架。 6.EMSA方法鉴定WNK4基因启动子区域顺式作用元件及反式作用因子。提取成人肾组织核蛋白并以Bradford比色法测定核蛋白浓度。人工合成含有转录因子API、SPI的双链寡核昔酸序列SA，以T4多核昔酸激酶标记探针后与核蛋白冰浴中连接结合反应，之后8%PAGE凝胶电泳约10小时，放射性自显影。 7.wNK4基因启动子序列G甩的功能鉴定:WNK4基因启动子pCAT-wNK4一promoter报道表达载体转化质粒JM109感受态细胞，无内毒素型超纯质粒DNA提取法提取质粒，酶切鉴定后，脂质体转染法转染COS一细胞，分别以InM，10nM浓度地塞米松处理细胞24小时，同时设置一空白对照，收集细胞，酶联免疫吸附试验(e川守me一hnkedi~unosorbant assay，EllsA)检测CAT蛋白质的表达。结果 1，小样本测序检测到WNK4基因exon7一个新SNP(G1662A)，大样本RFLP筛查证实该SNP和另一个位于exons的cSNP(G1816T)的等位基因频率在高血压及正常人群间存在显着性差异，但基因型频率无显着性差异。两者与我国东北汉族高血压发病存在密切相关。同时通过对不同种族人群的对比分析发现我国东北汉族人群WNK4基因exons GI 8 16T多态的基因型频率和等位基因频率与高加索人、非洲人比较差异明显，具有统计学意义(p<0.001)，但与美国黑人相近，没有显着性差异(p>0.05)。 2.WNK4基因表达谱分析结果显示WNK4基因在胎儿肾脏有高强度表达，在脑、肺、心、脾、肠等组织中有表达，但在肝组织中却无表达。 3.以重组人生长激素(hGH，终浓度为6IunoFL)、重组人雌激素(p一EZ，终浓度为1林m0FL)、血管紧张素n(Angn，终浓度为5林m0FL)、地塞米松(Dexamethson，终浓度为1 nmoFL)及?
袁沛[10]2016年在《红茶改善秀丽隐杆线虫渗透应激作用研究》文中指出作为全球最受欢迎茶类,红茶保健功能受到广泛关注。本论文研究了渗透应激条件下红茶对秀丽隐杆线虫的保护作用。研究结果如下：在500mmol/L Nacl渗透应激12hr后,红茶水提取物能有效提高秀丽隐杆线虫存活率。与对照组相比,50mg/L、100mg/L和200mg/L红茶水提取物处理组存活率分别提高了22.62%、34.70%与26.97%,虫体长度分别延长了4.39%、17.94%与11.87%。红茶还也能增加秀丽隐杆线虫在Na2SO4、Kcl与Lic1 3种盐渗透应激存活率。说明,红茶能改善秀丽隐杆线虫抗渗透应激能力,且与离子盐种类无关。红茶的抗渗透应激作用与p38 MAPK信号通路不相关。红茶处理48hr后,与野生型N2一样,红茶水提取物同样能够延长unc-43、nsy-1、pmk-1和sek-1基因突变品系AU3、KU4、MT205与KU25存活率。此外,红茶处理48hr秀丽隐杆线虫体内unc-43、nsy-1和pmk-1基因没有显示出显着变化。红茶的抗渗透应激作用与WNK/GCK Ⅵ信号通路相关。渗透应激时,红茶水提取物不能显着提高wnk-1和gck-3基因突变品系RB879与EV232的存活率。同样,红茶处理48hr后,秀丽隐杆线虫体内wnk-1和gck-3表达水平显着增加。红茶水提取物可以显着降低渗透应激时突变体IG274线虫内蛋白质nlp-29::GFP的表达量,但并不能降低AM140线虫体内PolyQ35::YFP蛋白质异常聚集。上述结果表明,红茶可以通过上调WNK/GCK Ⅵ信号通路从而提高秀丽隐杆线虫的抗渗透应激能力。由于秀丽隐杆线虫体内信号通路高度保守,此研究可以为红茶改善高等动物渗透平衡能力提供重要参考依据,这对于进一步揭示红茶保健作用具有重要的生物学意义。
参考文献：
[1]. microRNA在非小细胞肺癌发生、发展进程中调控机制的研究[D]. 王德韬. 上海大学. 2015
[2]. WNK基因表达的研究[D]. 吕晶玉. 中国医科大学. 2003
[3]. 大鼠视交叉上核（SCN）昼夜节律性别差异及WNK3激酶的相关性研究[D]. 张瀚文. 第二军医大学. 2014
[4]. GATA-1乙酰化对WNK4基因表达调控机制的研究[D]. 李苗. 中国医科大学. 2008
[5]. 在转基因水稻中超量表达WNK激酶基因的研究[D]. 钱盈佳. 扬州大学. 2011
[6]. 肾细胞癌中WNK2基因甲基化状态与mRNA表达的研究[D]. 杨建琪. 河北医科大学. 2015
[7]. 使用比较基因组学手段分析转录区域核酸组分的特征和演化的分子机制[D]. 黄大维. 中国科学院北京基因组研究所. 2012
[8]. 拟南芥WNK家族基因AtWNK9的功能研究[D]. 谢敏敏. 湖南大学. 2013
[9]. WNK4基因在高血压病中的功能特性分析[D]. 孙志军. 中国医科大学. 2004
[10]. 红茶改善秀丽隐杆线虫渗透应激作用研究[D]. 袁沛. 湖南农业大学. 2016
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