导读:本文包含了定量抗原捕获论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:IL-18,单克隆抗体,定量抗原捕获ELISA,免疫增强
定量抗原捕获论文文献综述
曹丙蕾[1]（2010）在《山羊IL-18定量抗原捕获ELISA检测方法的建立及其免疫增强作用的研究》一文中研究指出IL-18是一种属于IL-1家族且分布广泛的细胞因子,具有多种生物学功能,其中对机体的免疫增强调节和抗肿瘤作用已受到研究者们的极大关注。人类医学研究证明IL-18在抗微生物感染,尤其是在抗肿瘤免疫方面具有重要的潜在应用价值。且单克隆抗体比多克隆抗体具有较好的优越性,广泛应用到各种疾病的检测、诊断及防治中,并为各种病原微生物的流行病学的分析提供了强有力的工具,极大地提高了临床疾病诊断和治疗的效率。本课题对山羊IL-18(gIL-18)的单克隆抗体进行了研究。将山羊IL-18的成熟蛋白基因经扩增后克隆入原核表达载体pET-28a(+)中,经鉴定和测序后,构建了重组质粒pET-28a-gIL-18。将该质粒转化入表达菌Rosetta(DE3)的感受态细胞中,经诱导表达后获得重组蛋白的表达,并利用载体上所带有的His标签蛋白这一特点,采用Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白gIL-18,从而获得了纯度较高的蛋白,为下一步进行小鼠免疫及单抗的筛选鉴定做好准备。利用纯化的重组gIL-18蛋白对BALB/c小鼠进行免疫,并建立了检测小鼠抗体水平和单抗鉴定的间接ELISA检测方法,融合前抗体效价达到1:107,满足融合时对小鼠抗体的要求。SP2/0骨髓瘤细胞与加强免疫后的小鼠脾细胞在PEG作用下进行融合,经间接ELISA方法检测融合细胞,对于阳性杂交瘤细胞,通过有限稀释法进行多次克隆化,以筛选出能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,并最终确定下两株单抗2E8和4C4作为试验研究对象,并进行了单抗腹水的大量制备,利用饱和硫酸铵法对腹水进行粗提,再进一步利用Protein G亲和层析柱进行纯化,通过SDS-PAGE电泳分析,得到了纯度较高的IgG。通过对此两种单抗的亚型鉴定表明,此两种单抗均属于IgG1亚型。两种单抗2E8和4C4的效价分别为1:105和1:104。经ELISA迭加试验分析表明2E8和4C4可分别结合到IL-18的不同的抗原位点上,两者具有迭加性。经Western blot鉴定表明,单抗2E8和4C4能够与重组gIL-18蛋白发生特异性的反应,且anti-His单抗也可以与重组gIL-18蛋白发生特异反应,而与hIFN-γ蛋白不发生特异反应,与多抗相比,单抗特异性较强,蛋白印迹条带清晰。经IFA鉴定表明,对于gIL-18的重组真核质粒pcDNA3.1-gIL-18转染293FT细胞表达情况的检测,可以利用单抗的特异性,试验证实单抗可以特异性的检测真核质粒在细胞上的表达,产生特异明显的荧光,且对重组Bacmid-gIL-18转染sf9昆虫细胞的表达进行IFA检测也获得相似的结果。通过对山羊IL-18单抗的研究旨在建立山羊IL-18定量抗原捕获ELISA检测方法,利用对其中一种单抗2E8进行辣根过氧化物酶(HRP)的标记并对其特性及效价(1:6000)进行测定,另一种单抗4C4作为捕获抗体,通过对所需包被抗体(单抗4C4)最佳工作浓度、HRP-2E8-IgG二抗最佳稀释比例和ELISA最佳反应条件等进行研究,经方阵滴定试验最终确立了检测山羊IL-18的定量抗原捕获ELISA的检测方法,并依次建立了检测山羊IL-18的标准曲线,检测灵敏度为16pg/mL,且对其他细胞因子如hIFN-γ和hIL-18应用此检测方法进行反应,结果表明无交叉反应,检测值均低于16pg/mL的最小检出限,此检测方法对于山羊IL-18的检测具有一定的特异性。应用此方法检测体外山羊PBMC在LPS刺激下产生的IL-18的水平,及其健康奶牛和奶牛乳腺炎患牛(山羊IL-18和牛IL-18氨基酸同源性为98%)的血清及乳清进行检测,结果表明,山羊PBMC在LPS刺激下IL-18检测含量为85~267 pg/mL,与细胞阴性对照相比,gIL-18含量有显着提高;健康奶牛血清中IL-18含量为44~135 pg/mL,相比之下,病患牛血清中IL-18含量有明显升高,在111~534 pg/mL之间;健康奶牛乳清中IL-18含量为83~167 pg/mL,病患牛乳清中IL-18含量有明显升高,在171~658 pg/mL之间。此检测方法可以对机体体内和体外在炎症反应时IL-18的水平进行定量的检测,从而为各种临床疾病的诊断和治疗奠定基础。同时,针对IL-18具有免疫治疗及免疫增强作用这一功能,将山羊具有生物学活性IL-18蛋白(由本实验室构建、表达并保存的重组杆状病毒表达的rBgIL-18蛋白)作为免疫调节剂,联合口蹄疫O型、亚洲1型二价灭活疫苗对实验动物山羊分别进行rBgIL-18蛋白与疫苗共免疫组(Ⅰ组)、rBgIL-18蛋白预免疫+疫苗组(Ⅱ组)、单用疫苗组(Ⅲ组)和生理盐水阴性对照组(Ⅳ组)等分组试验,以期对IL-18的免疫增强作用更好地进行诠释和应用,从体液免疫和细胞免疫水平上分析试验结果。通过使用口蹄疫O型和亚洲1型检测试剂盒检测各试验期血清中的抗体滴度,从统计学意义上分析处理数据,结果表明,与免疫前相比,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组都有较好的免疫效果,抗体水平都较高且维持时间也较长,Ⅰ组可以较快(42d)达到高抗体水平;与阴性对照组相比,Ⅰ组效果最好,抗体效价最高,维持时间也最长,Ⅱ组次之。而且,利用MTT法从细胞免疫水平上分析淋巴细胞的增殖能力,结果表明,免疫前后相比,PI指数明显有所升高,淋巴细胞在免疫后免疫物的刺激下进行增殖分化。同时,通过对全血细胞的分析也可知,与免疫前相比,免疫后各试验组山羊的淋巴细胞数明显增殖,且所占比例也得到提高。因此,IL-18作为免疫增强佐剂有利于提高机体免疫力,提高疫苗的免疫效力,较好地提高机体抵抗力,为以后在生产实践中的应用打下良好的基础。(本文来源于《山东农业大学》期刊2010-06-14）
童铁钢[2]（2008）在《重组马白细胞介素-18的鉴定及其定量抗原捕获ELISA检测方法的建立》一文中研究指出白细胞介素-18(IL-18)是一种重要的细胞因子,它能作用于I型辅助性T细胞(Th1),并在IL-12的协同作用下能强烈诱导其产生IFN-γ。近来研究表明:IL-18具有广泛的生物学活性,在介导细胞免疫、抵抗微生物感染和抗肿瘤方面起着重要的作用。因此,IL-18在临床上可作为免疫增强剂、抗微生物或抗肿瘤制剂得以应用。到目前为止,国内外已有人、小鼠、猴、猪、牛和羊等种属的IL-18商品化制剂及其相应的单克隆抗体(McAb)或多克隆抗体(PcAb)以及夹心ELISA试剂盒的商品化供应。然而,有关马IL-18(EIL-18)的研究较少且相对滞后,迄今为止,还未见有可供商品化的EIL-18和抗EIL-18 McAb或PcAb及其夹心ELISA试剂盒等相关产品。本研究采用RT-PCR从经ConA刺激的马外周血单核细胞(PBMCs)中扩增获得编码EIL-18前体蛋白(precursor EIL-18,pEIL-18)的DNA,然后克隆至载体pMD18-T中,鉴定正确的重组质粒命名为pMD-EIL-18。自pMD-EIL-18中分别扩增pEIL-18及其成熟蛋白(mature EIL-18,mEIL-18)基因,并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)和pET-26b(+)中,重组质粒鉴定正确后命名为pET-pEIL-18、pET-EIL-18和pET-mEIL-18。然后分别转化至大肠杆菌感受态BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,结果表明所得到重组蛋白分别约为25kD、20kD和18kD,经Western-blot鉴定结果表明这3种重组蛋白均能与兔抗人IL-18发生免疫学反应,将这3种表达的重组蛋白分别命名为rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18。在此基础上,本研究建立了rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18在非变性状态下通过镍柱亲和层析或偶联了抗EIL-18 McAb的CNBr-activated Sepharose 4B亲和层析纯化重组蛋白的方法,采用该方法纯化获得了高纯度的重组蛋白rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18。为鉴定所获得的重组蛋白rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18是否具有生物学活性,本研究还建立了一种检测马IFN-γmRNA拷贝数的实时荧光定量RT-PCR方法,并采用本方法评价了rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18在重组人白细胞介素-12(rhIL-12)协同下在体外刺激马PBMCs所产生IFN-γ的状况。结果表明,rpEIL-18不具有相应的生物学活性,而rEIL-18和rmEIL-18具有类似天然EIL-18生物学活性的特性。利用上述纯化后的rEIL-18抗原免疫新西兰白兔,制备了高效价的抗EIL-18 PcAb。同时,采用相同抗原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以昆虫/杆状病毒表达系统获得的重组mEIL-18(rAcEIL-18)作为检测抗原进行间接ELISA检测,共筛选获得9株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用Western-blot和IFA实验对9株单克隆抗体(McAbs)进行鉴定,结果显示,所获得的9株细胞分泌的抗体均能与rEIL-18和rAcEIL-18发生特异性反应。将此9株McAbs分别与用原核系统分段表达的重组马白细胞介素-18成熟蛋白mEIL-181-78和mEIL-1879-157进行特异性ELISA检测,结果表明,其中5株能识别所表达的mEIL-181-78,而另外4株能与mEIL-1879-157发生反应,说明所获得的9株McAbs至少能针对rmEIL-18 2个或2个以上不同的抗原表位。采用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对该9株McAbs进行亚型鉴定,结果表明,除M1F11、M3A11和N7D9为IgM,其余的McAbs均为IgG1,而且所有McAbs的轻链均为κ链。将9株McAbs分别与rEIL-18和rmEIL-18进行中和活性测定,结果表明S1D7株对有生物活性的rEIL-18和rmEIL-18均具有中和效应。将抗EIL-18的McAbs和PcAb进行粗提和亲和层析纯化,并对纯化后S6A3和B1G1株McAbs和PcAb进行生物素标记。通过对各株McAb或PcAb分别作为捕获抗体或检测抗体进行初步的配对筛选后,以亲和纯化的S6A3株McAb作为捕获抗体,生物素标记的B1G1株McAb作为检测抗体,经方阵试验优化抗原捕获ELISA反应体系,以不同浓度梯度的rEIL-18为捕获抗原进行ELISA检测绘制其OD值-抗原浓度标准曲线,确定检测灵敏度为15pg/mL。采用所建立的抗原捕获ELISA检测方法对健康和EIAV感染的马血清及猪、牛、羊血清进行检测,结果表明,猪血清、牛血清和羊血清在该检测方法中均无发生交叉反应性,健康马血清中EIL-18的含量在40-80pg/mL之间,而EIAV感染后的马血清中EIL-18含量略微升高,在70-150pg/mL之间。由于各种属的IL-18存在一定的交叉反应性,为了检测本研究所获得抗EIL-18 McAbs是否能够用于检测其他种属IL-18并确定其检测极限,参照配对筛选结果和上述建立好的EIL-18定量抗原捕获ELISA检测方法,以S1C6株McAb作为捕获抗体,生物素化的抗EIL-18 PcAb为检测抗体,商品化的重组猪IL-18(rPIL-18)为捕获抗原绘制OD值-抗原浓度标准曲线,确定检测灵敏度为30pg/mL,建立了基于抗EIL-18抗体为检测和捕获抗体的猪IL-18(PIL-18)定量抗原捕获ELISA检测方法;以S5F1株McAb作为捕获抗体,生物素化的抗EIL-18 PcAb为检测抗体,初步建立了以抗EIL-18抗体为检测和捕获抗体的牛IL-18(BIL-18)定量抗原捕获ELISA检测方法。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2008-06-01）
余斌[3]（2006）在《抗猪γ-干扰素单克隆抗体的制备及定量抗原捕获ELISA检测方法的初步建立》一文中研究指出γ-干扰素(IFN-γ)是机体内具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的重要细胞因子。γ-干扰素主要由激活的T细胞、激活的NK细胞和巨噬细胞产生。研究表明，内源性IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映机体的细胞免疫状态，对样本中的IFN-γ进行定量分析，在免疫机制研究、免疫功能分析、疫苗免疫效果评估、器官移植、过敏反应以及多种胞内病原感染的诊断等方面都具有极其重要的理论价值和应用价值。 本研究利用在大肠埃希氏菌中表达的重组猪γ-干扰素(rpIFN-γ)免疫8周龄BALB／c鼠3次后，取脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞按标准程序融合后，以间接ELISA和有限稀释法进行筛选，获得1株能稳定分泌抗猪IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该株单克隆抗体命名为B11株。同时将rpIFN-γ免疫产蛋鸡4次后，收集鸡蛋并分离卵黄，经过氯仿抽提和硫酸氨沉淀，获得卵黄抗体(IgY)粗品。将纯化的rpIFN-γ偶联于溴化氰活化的葡聚糖凝胶4B上，利用免疫亲和层析进一步纯化抗原特异性IgY并用生物素标记，经HABA法测定，每个IgY分子标记4.37个生物素分子。应用亲和纯化的抗猪γ-干扰素单克隆抗体作为捕获抗体，生物素标记的卵黄抗体作为检测抗体，经方阵试验优化抗原捕获ELISA反应体系，利用重组猪γ-干扰素绘制OD值-抗原浓度标准曲线，确定检测灵敏度为7.8ng／mL。本实验初步建立了猪γ-干扰素定量抗原捕获ELISA检测方法，为进一步建立猪γ-干扰素的ELISPOT检测方法奠定坚实的基础。(本文来源于《华中农业大学》期刊2006-06-01）
陆萍[4]（1993）在《磁珠抗原捕获-酶联免疫吸附试验大规模定量检测化疗前后的血吸虫循环阳极抗原》一文中研究指出随着新药的大量应用,血吸虫病的控制更有效了,作为评价疗效的方法,现有的虫卵计数法比较繁琐,而检测抗体又不能区分慢性与活动性感染,对治疗带来不便,有必要建立一种简便而又可靠的检测活动性感染的方法。为此作者报告了一种快速检测CAA的方法:磁珠抗原捕获-酶联免疫吸附试验(MBAC-EIA)。实验所用的McAb为抗CAA-IgG1,(本文来源于《国外医学(寄生虫病分册)》期刊1993年02期）
李晓军,武建国[5]（1990）在《用快速、敏感的抗原捕获ELISA定量检测肌红蛋白》一文中研究指出肌红蛋白(Mb)是骨胳肌、心肌细胞的构成蛋白,血清Mb 升高是肌细胞损伤的早期标志之一.心肌梗塞(AMI)时血Mb 的升高与峰值常早于多种酶与同工酶,故可作为重要的辅助诊断指标.检测Mb 国(本文来源于《临床检验杂志》期刊1990年03期）
定量抗原捕获论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
白细胞介素-18(IL-18)是一种重要的细胞因子,它能作用于I型辅助性T细胞(Th1),并在IL-12的协同作用下能强烈诱导其产生IFN-γ。近来研究表明:IL-18具有广泛的生物学活性,在介导细胞免疫、抵抗微生物感染和抗肿瘤方面起着重要的作用。因此,IL-18在临床上可作为免疫增强剂、抗微生物或抗肿瘤制剂得以应用。到目前为止,国内外已有人、小鼠、猴、猪、牛和羊等种属的IL-18商品化制剂及其相应的单克隆抗体(McAb)或多克隆抗体(PcAb)以及夹心ELISA试剂盒的商品化供应。然而,有关马IL-18(EIL-18)的研究较少且相对滞后,迄今为止,还未见有可供商品化的EIL-18和抗EIL-18 McAb或PcAb及其夹心ELISA试剂盒等相关产品。本研究采用RT-PCR从经ConA刺激的马外周血单核细胞(PBMCs)中扩增获得编码EIL-18前体蛋白(precursor EIL-18,pEIL-18)的DNA,然后克隆至载体pMD18-T中,鉴定正确的重组质粒命名为pMD-EIL-18。自pMD-EIL-18中分别扩增pEIL-18及其成熟蛋白(mature EIL-18,mEIL-18)基因,并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)和pET-26b(+)中,重组质粒鉴定正确后命名为pET-pEIL-18、pET-EIL-18和pET-mEIL-18。然后分别转化至大肠杆菌感受态BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,结果表明所得到重组蛋白分别约为25kD、20kD和18kD,经Western-blot鉴定结果表明这3种重组蛋白均能与兔抗人IL-18发生免疫学反应,将这3种表达的重组蛋白分别命名为rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18。在此基础上,本研究建立了rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18在非变性状态下通过镍柱亲和层析或偶联了抗EIL-18 McAb的CNBr-activated Sepharose 4B亲和层析纯化重组蛋白的方法,采用该方法纯化获得了高纯度的重组蛋白rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18。为鉴定所获得的重组蛋白rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18是否具有生物学活性,本研究还建立了一种检测马IFN-γmRNA拷贝数的实时荧光定量RT-PCR方法,并采用本方法评价了rpEIL-18、rEIL-18和rmEIL-18在重组人白细胞介素-12(rhIL-12)协同下在体外刺激马PBMCs所产生IFN-γ的状况。结果表明,rpEIL-18不具有相应的生物学活性,而rEIL-18和rmEIL-18具有类似天然EIL-18生物学活性的特性。利用上述纯化后的rEIL-18抗原免疫新西兰白兔,制备了高效价的抗EIL-18 PcAb。同时,采用相同抗原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以昆虫/杆状病毒表达系统获得的重组mEIL-18(rAcEIL-18)作为检测抗原进行间接ELISA检测,共筛选获得9株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用Western-blot和IFA实验对9株单克隆抗体(McAbs)进行鉴定,结果显示,所获得的9株细胞分泌的抗体均能与rEIL-18和rAcEIL-18发生特异性反应。将此9株McAbs分别与用原核系统分段表达的重组马白细胞介素-18成熟蛋白mEIL-181-78和mEIL-1879-157进行特异性ELISA检测,结果表明,其中5株能识别所表达的mEIL-181-78,而另外4株能与mEIL-1879-157发生反应,说明所获得的9株McAbs至少能针对rmEIL-18 2个或2个以上不同的抗原表位。采用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对该9株McAbs进行亚型鉴定,结果表明,除M1F11、M3A11和N7D9为IgM,其余的McAbs均为IgG1,而且所有McAbs的轻链均为κ链。将9株McAbs分别与rEIL-18和rmEIL-18进行中和活性测定,结果表明S1D7株对有生物活性的rEIL-18和rmEIL-18均具有中和效应。将抗EIL-18的McAbs和PcAb进行粗提和亲和层析纯化,并对纯化后S6A3和B1G1株McAbs和PcAb进行生物素标记。通过对各株McAb或PcAb分别作为捕获抗体或检测抗体进行初步的配对筛选后,以亲和纯化的S6A3株McAb作为捕获抗体,生物素标记的B1G1株McAb作为检测抗体,经方阵试验优化抗原捕获ELISA反应体系,以不同浓度梯度的rEIL-18为捕获抗原进行ELISA检测绘制其OD值-抗原浓度标准曲线,确定检测灵敏度为15pg/mL。采用所建立的抗原捕获ELISA检测方法对健康和EIAV感染的马血清及猪、牛、羊血清进行检测,结果表明,猪血清、牛血清和羊血清在该检测方法中均无发生交叉反应性,健康马血清中EIL-18的含量在40-80pg/mL之间,而EIAV感染后的马血清中EIL-18含量略微升高,在70-150pg/mL之间。由于各种属的IL-18存在一定的交叉反应性,为了检测本研究所获得抗EIL-18 McAbs是否能够用于检测其他种属IL-18并确定其检测极限,参照配对筛选结果和上述建立好的EIL-18定量抗原捕获ELISA检测方法,以S1C6株McAb作为捕获抗体,生物素化的抗EIL-18 PcAb为检测抗体,商品化的重组猪IL-18(rPIL-18)为捕获抗原绘制OD值-抗原浓度标准曲线,确定检测灵敏度为30pg/mL,建立了基于抗EIL-18抗体为检测和捕获抗体的猪IL-18(PIL-18)定量抗原捕获ELISA检测方法;以S5F1株McAb作为捕获抗体,生物素化的抗EIL-18 PcAb为检测抗体,初步建立了以抗EIL-18抗体为检测和捕获抗体的牛IL-18(BIL-18)定量抗原捕获ELISA检测方法。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
定量抗原捕获论文参考文献
[1].曹丙蕾.山羊IL-18定量抗原捕获ELISA检测方法的建立及其免疫增强作用的研究[D].山东农业大学.2010
[2].童铁钢.重组马白细胞介素-18的鉴定及其定量抗原捕获ELISA检测方法的建立[D].中国农业科学院.2008
[3].余斌.抗猪γ-干扰素单克隆抗体的制备及定量抗原捕获ELISA检测方法的初步建立[D].华中农业大学.2006
[4].陆萍.磁珠抗原捕获-酶联免疫吸附试验大规模定量检测化疗前后的血吸虫循环阳极抗原[J].国外医学(寄生虫病分册).1993
[5].李晓军,武建国.用快速、敏感的抗原捕获ELISA定量检测肌红蛋白[J].临床检验杂志.1990
标签：IL-18; 单克隆抗体; 定量抗原捕获ELISA; 免疫增强;