王芳[1]2004年在《神经胶质细胞上的mGluRs与帕金森病的相关性研究》文中研究指明帕金森病(Parkinson’S disease,PD)是55岁以上老年人常见的慢性、进行性神经退行性疾病，严重影响人类的健康水平和生活质量。PD的主要病理及生化改变为黑质-纹状体通路的DA能神经元退行性变、Lewy's小体的出现以及纹状体DA含量的绝对减少。但是，对于导致DA神经元变性、死亡的机制目前还不清楚。在已经提出的众多学说中，氧化应激、兴奋性毒性、线粒体功能障碍是导致DA能神经元死亡最主要的叁个机制。谷氨酸(glutamate，Glu)是中枢神经系统内的一种重要的兴奋性神经递质。但是，各种病理因素导致的细胞外Glu浓度过高，过度激活Glu受体而产生兴奋性神经毒性，是PD的一个重要发病机制。 神经胶质细胞在PD等神经退行性病的发生、发展过程中发挥重要的作用。本文研究工作探讨了激动星形胶质细胞上的Ⅱ、Ⅲ组亲代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors，mGluRs)的激活是否具有保护中脑神经元的作用；鉴于神经胶质细胞上的高亲和力Glu转运体(Glutamate transporters，GluTs)的主动摄取是清除胞外Glu的主要途径，本文工作进而探讨这种保护作用是否与促进星形胶质细胞摄取Glu有关；在此基础上，研究C6星形胶质瘤细胞株上mGluRs的表达情况及其配基对Glu摄取的调节作用，探索mGluRs配基调节作用的生物学物质基础，进一步佐证在星形胶质细胞上研究获得的结论。体外培养中脑神经元，用Annexin V法检测细胞凋亡率，研究发现，直接给予Mpp~+(150 μM)并不能使中脑神经元的凋亡率明显增加，而经Mpp~+(150 μM)处理的星形胶质细胞的培养基明显促进神经元凋亡；预先用Ⅱ、Ⅲ组mGluRs激动剂DCG-IV和L-AP4与神经元预孵育，并不能降低中脑神经元的凋亡率，但是DCG-IV和L-AP4与星形胶质细胞预孵育制备的条件培养基可以明显降低中脑南京医科人学硕1:学位沦文神经元的凋亡率，这种作用可被11、JIl组mGluRS拮抗剂APICA和MSOP所拮杭。研究结果提示选择性激活星形胶质细胞上11、m组mGluRS可保护中脑神经元免受MPP+活化星形胶质细胞产生的毒性作用。为了阐明其机制，应用同位素标记法检测DCG一w和L一AP4对MPP+抑制星形胶质细胞摄取Glu的影响。研究发现，DCG一IV和L一AP4均能逆转MPP+引起的Glu摄取抑制，并且这种逆转作用可分别被H和111组mGluRS拮杭剂APICA和MSOP所拮抗。应用免疫细胞化学和免疫印迹法的研究发现:C6细胞表达mGluRI、2/3、4、6、7，DCG一W和L一AP4可调节C6细胞摄取Glu，进一步佐证了在星形胶质细胞上研究获得的研究结果。 总之，本文研究工作首次报道了激动星形胶质细胞上的11、m组mGluRS可以通过促进星形胶质细胞摄取Glu而保护中脑神经元免受MpP+活化星形月免质细胞导致的神经毒性作用，并在学术界首次发现C6胶质瘤细胞上存在mGluRI、2/3、4、6、7。这些研究结果为阐明神经月免质细胞上的mGluRS与PD发生、发展的相关性及进一步探索PD的病因学、研制新一代治疗PD的药物积累了学术基础。
顾兵[2]2003年在《亲代谢型谷氨酸受体与帕金森病相关性研究》文中研究说明国外近期的统计资料表明，帕金森病(Parkinson's disease，PD)的发病率为总人口的0.1％～0.2％，其中在55岁以上人口占1.4％。社会老龄化使得PD发病率呈明显上升趋势。尽管PD病因学研究备受各国学者的广泛关注，PD的病因和发病机制至今仍未阐明。目前认为PD的发生是由于中脑黑质多巴胺(DA)能神经元选择性退变，并且残存的神经元中出现嗜酸性包涵体。黑质致密部(SNc)DA能神经元的缺失，最终导致间接通路活性的增强，尤其是丘脑底核(STN)谷氨酸(Glu)能神经元的活性增强，从而出现锥体外系病变。手术治疗旨在减弱间接通路活性的传导，但其侵害性大、费用昂贵，只适合为数较少的患者。长期应用左旋多巴复合外周脱羧酶抑制剂的DA替代疗法，大部分患者出现疗效减退，运动波动等各种不良反应。因而，神经药理学家转向开发一种能间接减弱间接通路传导的抗PD药物。 Glu和γ-氨基丁酸(GABA)是脑内两种主要的兴奋性和抑制性神经递质，它们的正常传导是维持基底神经节(BG)运动环路生理功能的必需条件。依据运动环路功能解剖理论，在PD中DA D_2受体介导的对纹状体-苍白球神经元抑制作用的减弱，导致直接通路的活性降低，间接通路的Glu能传导明显增强。而STN至苍白球内侧段/黑质网状区(GPi/SNr)的Glu能投射活性增加，使其发出的GABA能投射对丘脑的抑制增强，使输出结构对丘脑的紧张性抑制加剧。因而，通过增强DA能的神经传导或者遏制Glu能兴奋性传导，降低间接通路的活性，有望能最终治疗PD。 Glu与PD发病机制的密切相关，不仅因为运动环路中存在继发的Glu能传导障碍，而且Glu作为兴奋性氨基酸可造成神经元的损伤。STN将 南京医科大学博士学位论文Gill能神经元的兴奋性淑到黑质，而当 SNc DA能神经元损伤后，Gill能神经元便会异常活跃，使oU释放量增加，导致““大量内流，造成神经元内 of》超载，触发一系列 c／片关的a＃x反应，致使＋＋能神n元变性和／或坏死。由于DA分泌减少削弱了对STN的抑制，增强了兴奋性传出神经元的放电，进一步加重兴奋性毒性。另一种可能是通过增加一氧化氮合酶64合成，导致NO生成增加，损伤线粒体呼吸链酶复合物1。而线粒体功能缺陷致使生理浓度的Gill介导“”内流，间接地产生兴奋性神经毒性和黑质谷耽甘肽（GSH）的水平降低。在这过程中，兴奋性神经毒性，线粒体功能缺失，自由基生成增加和细胞内灯“超载等一系列病理改变紧密相联，任何一个环节损伤都可导致DA能神经元退变。 Gill主要是通过活化突触膜上的受体发挥生理效应。Gill受体可分成亲离子型谷氨酸受体门GluRs）和亲代谢型谷氨酸受体（mGluRs）两大类。在 BG对运动指今的加工传导过程中，mGluRs发挥着重要的调控作用。目前证实 mGluRs有叁组 8个亚型，它们都与 G蛋白相偶联。许多研究表明第 1组的 mGluRs激活，使蛋白激酶 C （PL活化；促使N水解产生D。和DAG，增强由iGl恤异常所介导的神经兴奋毒性。第1组mGluRs位于突触后膜上，分布在离子通道型受体的边缘，发挥突触后抑制效应。第11，Ill组6b mGluRs激活，可抑制腺菩酸环化酶 （A活性，使 cAW生成减少，N可抑制电压依赖性钙通道的活性。位于突触前膜上第 Ill组的mGluRs激活，可以减少Gin释放。突触前膜上的mGluRs作为自身受体负反馈调节O 传导；而作为DA能神经末梢的突触前受体，能调节DA释放和DA能神经元放电。定位在突触后膜上的mGluRs调节神经元兴奋性和介导通过iGlllRs 的电流。免疫组化和原位杂交技术的运用，揭示mGIuRs在黑质一纹状体部位的表达密度较高，且存在亚型的区域性分布。 鉴于mGluRs在快速m 兴奋性突触传递上发挥娜细的效应，并不存在于自主神经系统的靶器官上，各亚型的分布又有一定的特征性，mGluRs可望成为新一代疗效高，副作用少的抗PD的药物靶标。本文工作就是在整体行为学，神经生化，组织病理学和细胞等多水平多层次探讨mGluRs与PD发生的相关性，为探索PD的临床治疗和开拓新一代治疗药 3 南京医科大学博士学位论文物积累学术和实验数据。第一部分亲代谢型脆酸受体配捌黑质6－OHDA损毁大鼠的抗氧化作用目 的：探讨亲代谢型谷氨酸受体（SGlllRS）配基对PD模型大鼠的抗氧化作用。方 法：采用 6－羟基多巴单侧黑质损毁建立 PD大鼠模型，应用化学比色法测定血清总抗氧化能力（TAOC）抑制活性氧能力（ROS）和谷耽甘肽（GSH）含量。结 果：与模型对照组相比，I组二桔抗剂SIB－1893、11组 mGluRs激动剂 APDC、Ill组 mGluRs激动齐 L－SOP和L．DOM均能增加血清IAOC和GSH水平，提高清除ROS能力，尤以APDC组作用最为显着。结 论：I组mGl顺桔抗剂和11，Ill组mGluRs激动剂对6－羟基多巴损毁大鼠具有部分抗氧化功能，有利于机体减轻氧化应激所致的损伤。
徐瑰翎[3]2007年在《天麻对帕金森病大鼠神经元保护及机制的研究》文中研究表明帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的中老年中枢神经系统退行性疾病,随着人口的老龄化,PD已成为威胁人类健康的主要疾病之一。PD主要病理变化是黑质致密部多巴胺神经元(dopaminergic neuron)脱失,导致了患者出现运动减少、僵直、震颤等临床症状。由于PD的发病原因至今不十分清楚,因此也无理想的防治措施。神经保护性治疗已成为当前PD研究的热点之一。现代药理证明天麻及其制剂具有调节免疫、抗炎、抗凋亡等功效,对神经细胞具有保护作用。本研究使用高效液相、免疫组织化学等技术研究探讨了天麻对PD大鼠行为学、形态学、与PD有关的神经递质、细胞凋亡等因素的影响,将有助于揭示PD的发病机理及天麻防治PD的作用机制,为临床用药提供理论依据,具有重要的理论意义和实用价值。实验选用SD大鼠60只,应用6-OHDA复制PD模型50只。动物随机分为六组:①正常对照组;②模型对照组;③西药对照组(美多巴组);④天麻大剂量组(简称大剂量组);⑤天麻中剂量组(简称中剂量组);⑥天麻小剂量组(简称小剂量组)。动物的存活期为14天。实验分为四个部分:①天麻对PD鼠行为学、病理学变化的影响;②天麻对PD大鼠纹状体DA及其代谢产物含量的影响;③应用免疫组化技术观察PD鼠黑质(substantia nigra,SN)与腹侧被盖区(the ventral tegmental area,VTA)肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和胶质源神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic growth factor,GDFN)的表达影响;④应用免疫组化技术观察PD鼠SN、VTA区酪氨羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)和Caspase-3的表达。主要结果如下:1天麻对PD大鼠行为学和形体学的影响旋转实验:各组大鼠注射阿朴吗啡(apomorphine,APO)后10Min.都出现不同程度的兴奋状态:躁动,觅食等。大鼠旋转实验结果显示:天麻可改善PD大鼠的行为异常,其中天麻小剂量组和美多巴组与模型组比较有显着性差异(p<0.05),大、中剂量组与模型组比较无统计学意义。Morris水迷宫实验:定位航行试验的结果显示小剂量组与模型组比较有统计学意义(p<0.05)。HE染色结果:天麻各剂量组大鼠SN区神经元的形态基本相似,数量未见明显减少,仅见少数神经元变性。2天麻对PD大鼠纹状体DA及其代谢产物含量的影响高压液相色谱(法)检测结果统计显示:模型组DA、DOPAC和HVA均较正常组显着降低(p<0.01)。DOPAC/DA与HVADA/比值与正常组比较都不同程度地升高。其中小剂量组的DA、DOPAC和HVA的含量与模型组比较有显着升高(p<0.05),接近正常组和美多巴组;大、中剂量组的DA及其代谢产物提高不明显没有统计学意义。3天麻对PD鼠脑内胶质细胞TNF-α、GDNF表达的影响TNF-α图像分析及统计结果显示:①模型组VTA、SN区DA能神经元胞质TNF-α表达量较正常组显著升高(p<0.01);小剂量组、美多巴组VTA和SN与正常组比较差异均不显着(p>0.05),与模型组比较TNF-α表达明显降低且差异显著(p<0.05);小剂量组与美多巴组相比差异不显着(p>0.05)。各组右侧(未损伤侧)SN和VTA间比较差异均不显着(p>0.05)。GDNF图像分析及统计结果显示:①与模型组比较,中、小剂量组VTA、SN区DA能神经元胞质GDNF表达量显着升高(p<0.05);②与正常组相比小剂量组VTA、SN区GDNF表达升高差异显着(p<0.05);③与美多巴组比较小剂量组VTA的GDNF表达亦升高(p<0.05)。4天麻对PD鼠黑质Caspase-3表达及TH阳性神经元的影响实验研究表明:与正常组比较模型组PD大鼠中脑黑质致密部酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元的数目减少了约45%;各天麻治疗组可部分减少黑质致密部TH阳性神经元的丢失,其丢失程度较模型组明显减低,其中小剂量组和中剂量组,减少约16%和17%,效果较好;大剂量和美多巴组,减少约22%和20%。相应的小剂量和中级量组的Caspase-3阳性神经元表达较模型组明显减少。各组Caspase-3阳性神经元的表达与TH阳性神经元的表达呈相反趋势。结论:①免疫炎症和细胞凋亡可能是PD大鼠中脑多巴胺神经元丢失的主要方式。②天麻可通过调节上述因素减少细胞凋亡,其中天麻小剂量组有较好的作用。提示天麻可不同程度地保护多巴胺神经元,减缓PD病程的进展
王森[4]2006年在《ATP敏感性钾通道和帕金森病的相关性研究》文中指出ATP敏感性钾通道和帕金森病的相关性研究 帕金森病(Parkinson's disease，PD)是锥体外系功能紊乱引起的一种慢性中枢神经系统疾病，其临床特征为震颤、肌强直、姿势和运动平衡失调，严重患者伴有记忆障碍和痴呆，病情呈慢性进行性加重，晚期往往全身僵硬，生活不能自理，严重影响老年人的身心健康和生活质量。临床流行病学调查结果表明，我国65岁以上老年人群帕金森病的发病率约2％，是仅次于脑血管病的神经系统常见病。目前认为PD是由于黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元进行性变性、死亡使纹状体内DA含量减少所致，应用拟DA药L-DOPA进行替代治疗是该病目前临床治疗的主要手段，尽管可以缓解大多数患者的症状，但这类药物并不能阻止疾病的进展，且长期使用易出现随意运动障碍、诱发心脏病等许多严重的不良反应，这已成为困扰PD临床治疗学的一大难题。尽管对导致DA神经元变性死亡的病因已经提出许多学说，如遗传因素、氧化应激、线粒体功能障碍、兴奋性神经毒性、钙稳态破坏、炎性神经病理损伤等学说，但导致多巴胺能神经元变性、坏死的确切的机制目前仍然不是十分清楚。显然，加强PD的病因学及其神经生物学研究，寻找研发治疗PD理想新药的靶标，对于提高人类健康水平具有重大意义。 ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel，K_(ATP))是一种耦联细胞电活动和代谢、以细胞内的ATP/ADP水平为门控因素、非电压依赖性的特殊钾离子通道。包括本实验室研究已表明：1)K_(ATP)在PD相关基底神经节核团高水平表达；2)K_(ATP)参与调节多种与PD相关的神经递质如多巴胺和谷氨酸的释放；3)K_(ATP)开放是脑神经元在急性缺血缺氧、氧化应激等病理因素导致损伤时的重要内源性保护机制。在已有的学术基础上，我们提出K_(ATP)和PD的发生、发展存在相关性的科学问题，本文的研究工作旨在阐明K_(ATP)在PD发病机制中
孟长虹[5]2003年在《亲代谢型谷氨酸受体与帕金森病的相关性研究》文中提出帕金森病是好发于中老年人的慢性中枢神经系统变性疾病，严重影响中老年人的生活质量和健康水平。目前PD的发病机制仍不清楚，临床也缺乏理想的治疗药物。一般认为其主要的病理改变是黑质纹状体多巴胺能神经元缺失后引起的BG直接通路活性的减低和间接通路活性的增强，使得丘脑和皮层神经元受到过度抑制，从而出现震颤、肌僵直、运动减少和姿势不稳等一系列的临床症状。因此，降低间接通路的活性是治疗PD的主要目标，这可以通过增强多巴胺能神经传导或者降低谷氨酸能传导来达到。 Glu是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，其受体包括iGluRs和mGluRs。近年来iGluRs在帕金森病的发生、发展过程中的作用已被广泛研究，并提出了兴奋性氨基酸的神经毒性作用可能是PD发生与发展的重要机制之一。许多研究指出iGluRs的拮抗剂具有抗PD作用，但是由于该组受体分布不具有特异性，应用后伴随着严重的副反应。近年来，mGluRs在神经传导中的作用越来越受到重视，研究指出，mGluRs受体可能是治疗PD的重要靶标。 mGluRs是一类与G蛋白偶联而调节磷脂代谢或腺苷环化酶活性的新型谷氨酸受体，随着分子生物学技术的发展和应用，各亚型mGluRs的cDNAs相继被克隆成功，有关mGluRs对中枢神经系统的调节作用的研究也逐渐受到人们的重视。根据其分子结构、药理学特性和信号转导机制的不同分为叁组八个亚型：第Ⅰ组包括mGluR1和mGluR5，与Gq蛋白偶联，主要通过活化PLC，促进PIP_2水解和IP_3产生，导致细胞内Ca~(++)的释放；第Ⅱ组包括mGluR2和mGluR3；第Ⅲ组有mGluR4，mGluR6，mGluR7和mGluR8，Ⅱ、Ⅲ组mGluRs均与Gi／Go蛋白偶联，通过抑制AC减少抑制cAMP的生成，进而抑制蛋白激酶A。 南京医科大学硕士学位论文 近年来，随着mGluRs特异性激动剂和桔抗剂的出现，许多研究者开士台探索mGluAs各亚型在调节中枢神经系统功能中的作用。研究表明，mGluRs受体激活后可以调节谷氨酸能和非谷氨酸能突触部位的递质释放，而且直接调节谷氨酸释放的突触前 mGluRs和定位于突触后膜上的mGluRs都可以调控神经元信号转导。越来越多的神经化学研究也指出，mGluRs参与脑内 DA和m 释放的调节。众所周知，BG部位DA和m 神经传导的异常在PD的发病机制中占据重要地位，合理调节DA和m 的释放将有助于切断PD发病的环节。但在PD动物模型和调节神经递质释放的角度阐述mGluRs与PD相关性的研究至今未见报道。本文工作在建立6－OHDA致＊模型大鼠和PD细胞模型的基础上，应用在体微透析的方法研究 mGluRs受体的激动剂或桔抗剂对纹状体 DA和o 水平的影响及其 mGluns配基对 6－OHDA诱导的 PC12细胞死亡和 Gill释放的影响，旨在阐明mGluRs与PD发生的相关性，为进一步探索PD的病因学、研制新一代治疗PD的药物积累学术与实验依据。第一部分 mGluRs配伙 6－OHDA所致 PD模型大鼠砍体 DA和Gh扔的形响一在附透析实柱目的：在6－OHDA单侧损毁的PD大鼠模型上研究各组二受体配基对纹状体细胞外液DA和m 水平的影响。方法：使用立体定位技术将神经毒素6－0＊＊A旧 … 注入大鼠一侧黑质致密部制备单侧 PD大鼠模型。叁周后皮下注射APO门刀5 mgilig）观察大鼠的旋转行为，筛选成功的帕金森病大鼠模型进行实验。在成功模型大鼠双侧纹状体植人套管，大鼠恢复一周后沿套管插人探针，用人工脑脊液灌流给药。模型大鼠分为叁组，分别给予1组mGluRs桔抗剂DL－AP3（、30、300 pmol·L刁入 11组 mGluRs激动剂 DCG4V（0．l、l、10兄 100 pmol工一’）和二 组 mGluRs激动剂 L一AP4（ 0．l、l气 10、100卜mol工－’人收集的微透析样品采用 HPLC－电化学检测和 HPLC－荧光检测联用的方法测定 DA、Gin水平的变化。结果：I组 mGluRs桔抗剂 DL－AP3对健侧纹状体细胞外 DA和 GltJ水平均无显着影响， 南京医科大学硕上学位沦文但可显着增加患侧纹状体细胞外DA含量达扣％门0、300 11mOI·L－’入并显着降低细胞外Gin水平；11组mGIuRs受体激动剂DCGJV①．l、＊＊卜mol·L“’）可显着增加双侧纹状体细胞外液DA和m 水平二 Ill组受体激动剂 L－AP4在 100卜mol·L－‘时使健侧纹状体细胞外 DA水平降低约 16％，l刁 pmol工”’的卜Ap4均显着增加患侧纹状体的 DA水平；卜AP 4可显着降低双侧纹状体细胞外的mu水平。结估：1组 mGluRs桔抗剂和＊、Ill组 mGluRs的激动剂能显着增力。PD模型大鼠患侧纹状体细胞外液 DA含量，并显着降低患侧纹状体细胞外液的 Gin水平，表明 1组 mGluRs桔抗剂和＊、Ill组 mGluRs的激动剂对PD具有治疗学价值。第H部分 ＊、Ill组mGIuRs没动剂对6－OHDA诱导的PC12细胞死亡和＊ 释放的o响目 的：研究 mGluRs是否对6刁HDA诱导的 PC12细胞毒性有保护作用。方法二分别用 DCG一IV （ 0 pmol·L一’）或 L一AP4 （ 0 pmol·L”’）预处理K12细胞2
姚红红[6]2006年在《激动星形胶质细胞上Ⅱ、Ⅲ组mGluRs对中脑神经元的保护作用及其机制研究》文中研究指明激动星形胶质细胞上Ⅱ、Ⅲ组mGluRs对中脑神经元的保护作用及其机制研究 帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种锥体外系功能紊乱引起的慢性中枢神经系统退行性疾病，其主要病理学特征表现为黑质致密部多巴胺(dopamine，DA)能神经元进行性变性、缺失，导致黑质纹状体DA能神经元投射减少，出现一系列临床症状。目前临床仍以替代治疗为主，左旋多巴和D_2受体激动剂能改善PD症状，但不能阻制疾病发展，这使人们对PD治疗的认识由单纯替代疗法逐渐转向保护中脑DA能神经元。尽管PD的确切病因还不清楚，但大量研究表明星形胶质细胞活化和功能异常能促进、加剧DA能神经元的缺失，调节星形胶质细胞的功能被认为是保护DA能神经元的重要策略。 星形胶质细胞是脑内数量最多的细胞类型，不仅为神经元提供营养和结构支持，也和神经元共同调控信号传导，实现与神经元的通讯或对话，促进和引导神经干细胞的发生。更重要的是，星形胶质细胞上的各种转运体参与摄取并维持突触间隙的神经递质水平如谷氨酸(glutamate，Glu)和γ-氨基丁酸。研究表明，由Glu介导的兴奋性毒性作用在PD病变中发挥主要作用。突触间隙Glu清除和失活的主要途径是通过星形胶质细胞上高亲和力谷氨酸转运体(glutamate transporters，GluTs)对Glu的主动重摄取，星形胶质细胞上GluTs对维持突触间隙Glu正常浓度，对PD的治疗具有重要意义。 Glu通过Glu受体而发挥不同的生理作用。Glu受体分为亲离子型谷氨酸受体(ionotropic glutamate receptor，iGluRs)和亲代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors，mGluRs)两大类。其中，mGluRs被认为是研发治疗PD药物的有益靶标，证据如下：1)mGluRs在与PD发病相关的基底神经节(basal ganglia，BG)核团高水平表达；2)mGluRs参与调节与PD发病密切相关的神经递质的信号传递，如Glu和DA的释放等；3)选择性激动mGluRs保护PD病理模型中DA能
孙向荣[7]2011年在《苍白球代谢型谷氨酸受体的电生理学及功能学研究》文中研究说明苍白球(globus pallidus, GP)是基底神经节的重要组成部分,在机体正常运动功能调节及帕金森病(Parkinson's disease, PD)发病中起重要作用。谷氨酸是脑内最重要的兴奋性神经递质。谷氨酸受体包括离子型和代谢型两大类。由于代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors, mGluRs)对谷氨酸能突触传递起重要的调节作用,且研究表明抑制谷氨酸的释放可以有效缓解帕金森病症状,所以近年来对mGluRs的功能及其与神经退行性疾病相关性的研究已越来越受到人们的重视。形态学实验已证实苍白球表达有多种mGluRs,功能学研究表明Ⅰ组mGluRs阻断剂及某些Ⅲ组mGluRs激动剂可以起到抗帕金森病作用。目的：探讨正常及帕金森病状态下mGluRs对苍白球神经元的电生理学和行为学效应,并对其可能的机制做进一步探讨。方法：细胞外电生理记录,免疫组织化学,行为学等实验方法。结果：1.苍白球Ⅰ组mGluRs的电生理学效应：1)在正常大鼠,苍白球微量压力注射Ⅰ组mGluRs激动剂DHPG可增加神经元放电频率；选择性mGluRl受体阻断剂LY367385自身对苍白球神经元放电频率没有明显影响,而选择性mGluR5受体阻断剂MPEP可兴奋苍白球神经元；DHPG对苍白球神经元的兴奋效应可被LY367385阻断而不能被MPEP阻断。2)在帕金森病模型大鼠6-OHDA损毁侧,DHPG对苍白球神经元的兴奋效应明显弱于正常对照组；LY367385对苍白球神经元放电频率没有明显影响,而MPEP对苍白球神经元有兴奋效应；LY367385与MPEP都不能阻断DHPG对6-OHDA损毁侧苍白球神经元的兴奋效应。3)在帕金森病模型大鼠6-OHDA未损毁侧,DHPG可兴奋苍白球神经元,该兴奋效应与正常对照组相比无差别,但明显强于其对帕金森病模型大鼠损毁侧神经元的兴奋效应；LY367385单独应用对苍白球神经元放电无明显影响,而MPEP可降低神经元的放电频率；DHPG对苍白球神经元的兴奋效应不能被LY367385阻断但可以被MPEP阻断。4)在正常大鼠,DHPG引起的兴奋效应与苍白球神经元基础放电频率无相关性。而在帕金森病模型大鼠,DHPG引起的兴奋效应与苍白球神经元基础放电频率呈负相关。2.免疫组化染色显示在6-OHDA帕金森病模型大鼠损毁侧,苍白球mGluRlα表达较正常大鼠降低；而未损毁侧苍白球mGluRlα表达降低更为明显；苍白球mGluR5表达则无明显改变。3.行为学实验显示,单侧苍白球微量注射DHPG可使氟哌啶醇僵直大鼠发生对侧偏转,该效应能被LY367385阻断但不能被MPEP阻断。4.Ⅲ组mGluRs的电生理学效应：1)Ⅲ组mGluRs激动剂L-AP4对大鼠苍白球神经元既有兴奋作用也有抑制作用,以兴奋作用为主。L-AP4的作用可被Ⅲ组mGluRs抑制剂CPPG阻断。2)L-AP4对苍白球神经元的兴奋效应在6-OHDA大鼠损毁侧明显增强,而在未损毁侧有减弱趋势。5.行为学实验显示,苍白球微量注射L-AP4可使氟哌啶醇僵直大鼠发生对侧偏转,该效应可被CPPG阻断。结论：Ⅰ组mGluRs激动剂DHPG可以兴奋大鼠苍白球神经元,生理状态下该效应主要由mGluRl介导,而帕金森病状态下则由mGluRl和mGluR5共同介导；在帕金森病状态下,DHPG对苍白球神经元兴奋效应的减弱可能和mGluRl表达减少有关；Ⅲ组mGluRs激动剂L-AP4对苍白球神经元的作用以兴奋为主,且该作用在帕金森病状态下明显增强。上述实验结果为苍白球mGluRs系统在帕金森病发病和治疗中的作用提供了一定的理论和实验依据。
王昊[8]2012年在《重度颅脑创伤后应用（S）-4C3HPG减轻颅脑损伤的作用及可能机制》文中研究指明创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是现代社会中的一个突出问题，在全身各部位创伤中，颅脑创伤死残率高居第一位。统计数据表明，美国颅脑创伤发生率约为2‰，每年新发生颅脑创伤病人50万，其中10%属于重型颅脑创伤，大约2万人死亡，3万人致残，直接和间接经济损失数百亿美元。伴随全球经济以及现代化交通的高速发展，颅脑创伤越来越成为威胁人类健康的重要问题。怎样减轻颅脑损伤带来的神经功能损害，提高颅脑创伤的救治水平，始终是人们研究的焦点问题。目前认为兴奋性氨基酸毒性作用是继发性损伤重要机制之一，其它包括过度炎症、钙超载及氧自由基的释放等方面。兴奋性氨酸主要是谷氨酸，它是脊椎动物中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，不但维持神经细胞的正常功能，而且还可以调节突触稳定性及效能，参与学习和记忆过程。在颅脑创伤后，由于脑损伤区域神经元及神经胶质细胞崩解等原因，谷氨酸会从神经元、星形胶质细胞大量释放到细胞间液，激活谷氨酸受体而发挥兴奋毒性作用，导致颅脑创伤后的继发性损伤，因此通过伤后控制谷氨酸的释放，将可能产生有效的脑保护作用。(S)-4C3HPG是一种混合型代谢型谷氨酸受体调节剂，既是(group I glutamate metabotropic receptor，mGluR I)I组代谢型谷氨酸受体的拮抗剂也是(group II glutamate metabotropic receptor，mGluR II)II组代谢型谷氨酸受体的激动剂。目前已证实(S)-4C3HPG对阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease)、帕金森病(Parkinson’s disease)、抑郁症、精神分裂症、癫痫及锥体外系疾病的治疗，减轻脑缺血后的脑梗塞灶等慢性疾病及神经保护方面都有较好的效果。本课题组通过前期研究证实，在小鼠中度颅脑创伤（moderate traumatic brain injury，mTBI）致伤前30min给予(S)-4C3HPG可通过抑制谷氨酸释放及炎症因子产生，从而减轻颅脑创伤急性期的损伤。而在更为严重的重度颅脑创伤(severe traumatic brain injury，sTBI)发生后使用该药物是否也存在脑保护作用目前尚不清楚。临床研究表明，在颅脑损伤后早诊断、早治疗对创伤的预后起着关键性作用。因此，在前期研究的基础上，利用重力撞击致伤法构建了小鼠重度脑损伤(sTBI)模型，结合小鼠脑损伤后脑脊液谷氨酸浓度的动态变化，在sTBI模型小鼠致伤后急性期给药，选择4个时间点(15min、1h、3h、6h)给予(S)-4C3HPG，观察它对重度脑损伤后急性期伤情的影响，分析其作用与谷氨酸浓度及炎症因子的关系，以明确在重度脑损伤后调节谷氨酸释放获得有效脑保护作用的可能性，进而为应用(S)-4C3HPG阻断谷氨酸的兴奋毒性作用，作为创伤性重型颅脑损伤临床治疗的实验依据。主要实验方法、结果及结论：1.建立小鼠创伤性重度颅脑损伤模型，观察在致伤后急性期给予(S)-4C3HPG对小鼠伤情的影响在本课题组建立的中度脑撞击伤(mTBI)模型的基础上进行改进，选取SPF级C57BL/6健康雄性小鼠，使用戊巴比妥钠麻醉小鼠，在小鼠左侧顶叶前囟及后囟间开4mm×4mm骨窗，使用20g重物自50cm高度落下，对左侧顶叶进行撞击，撞击直径3mm，深度3mm，建立重度颅脑损伤模型，致伤后复原骨片，缝合皮肤。实验动物完全随机分为6组，每组10只：①假手术组：麻醉小鼠后仅进行开颅和缝合处理；②对照组(control)：仅致伤，无任何药物干预；③(S)-4C3HPG药物处理组(4组)：分别在sTBI伤后15min、1h、3h、6h这4个时间点予以腹腔注射(s)-4C3HPG5mg/kg。在致伤后24h对各组进行神经功能缺损评定。神经功能评定后处死小鼠，用干湿重法检测各组动物损伤侧皮层组织含水量。结果：致伤后24h小鼠均存活、活动减少、反应迟缓，肉眼观小鼠脑组织挫伤明显、出血。光镜下早期神经元胞体缩小变形、胞核固缩，胞质深染等急性坏死性改变。检测(S)-4C3HPG药物处理15min组和1h组神经功能缺损[分别为(1.70±0.48)、(1.90±0.56)]均显着低于对照组[(2.80±0.42)]，P<0.01；脑含水量[分别为(80.14±0.28)%、(80.17±0.52)%]与对照组[(82.55±0.34)%]比较，也显着降低，P<0.01。说明在颅脑撞击伤后早期给予(S)-4C3HPG减轻了创伤区域脑水肿，神经功能的损害也随之减轻，伤后尽早予以药物干预有较明显的神经保护作用。2.颅脑损伤急性期应用(s)-4C3HPG后脑脊液中谷氨酸浓度的变化与损伤区炎症因子表达之间的关系在小鼠创伤性重度颅脑损伤后24h时抽取各组小鼠脑脊液。采用梯度高效液相法(HPLC)测定动物重度颅脑撞击伤模型各组伤后24小时脑脊液中谷氨酸浓度。(RT-PCR)检测伤后24h伤侧皮层炎症因子，测定伤侧皮层炎症因子TNF-α、IL-1βmRNA含量。结果：在sTBI后24h时检测致伤组小鼠脑脊液中谷氨酸浓度较假手术组显着增高(P<0.01)。但与对照组比较，(S)-4C3HPG药物处理15min、1h组在伤后24h测得的脑脊液中谷氨酸浓度都显着低于对照组(P<0.01)。而(S)-4C3HPG药物处理3、6h组与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。在对伤侧皮层炎症因子的检测中显示，致伤后24h，(S)-4C3HPG药物处理15min、1h组在TNF-α、IL-1β mRNA表达水平与对照组比较明显降低(P<0.01)。而在(S)-4C3HPG药物处理3、6h组中伤侧皮层TNF-α、IL-1βmRNA表达水平与对照组无统计学差异(P>0.05)。实验证明，神经功能损害及脑水肿的程度与伤后谷氨酸浓度及炎症因子表达水平的增高密切相关。结论：在颅脑创伤后尽早应用(S)-4C3HPG来调节谷氨酸的释放，可明显减少兴奋性氨基酸毒性作用，降低炎症反应的诱发因素，减轻了神经功能的损害。而在急性期后致伤的因素可能主要是炎症反应，即使抑制了谷氨酸的毒性作用，也不能起到有效神经保护的作用。在重度颅脑创伤后脑脊液中谷氨酸浓度的变化与炎症因子的变化具有同向性。在重度颅脑损伤后，脑损伤区域神经元及神经胶质细胞崩解，导致谷氨酸的急剧释放，其兴奋毒性作用诱导了炎症因子的高表达，这些因素共同导致了创伤后脑血流紊乱、脑水肿、神经元死亡等一系列复杂的继发性改变，加重了颅脑损伤后神经功能的损害。在颅脑损伤后应用(S)-4C3HPG阻断谷氨酸的兴奋毒性作用，将产生有效的脑保护作用。
刘枫[9]2013年在《代谢型谷氨酸受体5-脂多糖作用小胶质细胞的全新靶点初步研究》文中进行了进一步梳理正常中枢神经系统因血脑屏障的存在使免疫系统的成分不能进入，被认为是免疫特免区。然而，越来越多的证据显示，中枢与免疫系统存在着相互作用。神经通路参与了细胞与体液免疫反应的调控，而免疫系统也主要通过细胞因子来影响中枢神经系统的功能。中枢神经系统内有免疫受体的分布，而免疫系统也有神经受体的表达，它们共用一套相同的信号分子(神经递质，神经肽，细胞因子等)。长久以来，神经-免疫间相互作用的研究都局限于其信号分子与受体间的作用，在神经细胞上往往同时有免疫受体的表达，而在免疫细胞，特别是小胶质细胞上同样也可见到神经受体的表达，那么在这两类受体之间除通过神经递质或免疫因子产生相互作用外，是否在受体蛋白之间存在直接的相互作用，目前尚未见相关报道。为此，本研究，拟以脑小胶质细胞为切入点，就小胶质细胞免疫受体与神经受体是否存在直接的蛋白作用进行探讨，期望所获结果能有助于我们更好地理解神经系统-免疫系统之间的联系，并为临床相关疾病的防治提供有益的理论基础。小胶质细胞广泛分布于中枢神经系统内,参与脑内的固有免疫反应,构成中枢神经系统抵御病原体入侵的第一防线,被认为是正常中枢神经系统中最有代表性的免疫细胞。小胶质细胞是中枢神经系统受损伤后最早发生反应的细胞类型。中枢神经系统的多种病理状态如创伤，中风，炎症反应和神经退行性疾病等，均可激活小胶质细胞，启动固有免疫反应，产生多种细胞因子及炎症趋化因子，进而导致各种白细胞穿过血脑屏障到达炎症反应区域。神经元-小胶质细胞间的相互作用在控制小胶质细胞的功能及其激活方面起到了重要的作用。小胶质细胞上表达各种神经递质受体来，感受神经元释放的神经递质，调控小胶质细胞的活性，并进一步对神经元上的相关受体作用从而影响神经元的功能。小胶质细胞在神经-免疫相互作用中起到了至关重要的作用。小胶质细胞上有多种神经递质受体(D2DR，NMDAR1，mGluR5等)和天然免疫受体(TLR4)的表达，弄清这些受体在炎症反应时的相互作用，对炎症机制的了解会起到很大的推动作用。本实验以LPS刺激小胶质细胞为炎症模型，使用了叁种小胶质细胞，1TLR4正常的小胶质细胞株N9；2TLR4缺陷的小胶质细胞株EOC20；3TLR4缺失的原代小胶质细胞。研究了上述免疫受体及神经递质受体在炎症反应时的相互作用关系。实验从研究炎症状态时小胶质细胞上天然免疫受体(TLR4)与神经递质受体(D2DR，NMDAR1)间相互作用入手，通过免疫共沉淀，荧光共定位及荧光共振能量转移(FRET)技术证实了免疫受体TR4与神经递质受体NMDAR1受体间存在蛋白质相互作用后，进一步的功能实验发现LPS刺激能引发小胶质细胞的钙振荡现象，这种钙振荡与小胶质细胞上表达的mGluR5受体有关。后续实验围绕mGluR5受体，利用免疫共沉淀，FRET，免疫荧光共定位，NF-κB报告基因及ELISA等相关技术，研究了mGluR5受体在LPS刺激小胶质细胞时的作用及其与LPS，NMDAR1，TLR4间的相互关系，得到结果如下：主要结果和结论：1N9，EOC20小胶质细胞株上有多巴胺D2受体(D2DR)的表达，LPS刺激后其表达量增高，但免疫共沉淀实验未检测到TLR4/D2DR受体间的蛋白质相互作用；2N9，EOC20小胶质细胞株上有免疫受体TLR4受体的表达，N9，EOC20细胞株及TLR4缺失的原代小胶质细胞上均有谷氨酸受体mGluR5及NMDAR1受体的表达，小胶质细胞上的免疫与神经受体的共表达为神经与免疫系统间的联系奠定了物质基础；3LPS刺激N9，EOC20小胶质细胞株时，LPS能与mGluR5受体直接结合，提示LPS在作用于小胶质细胞时存在TLR4以外的信号通路；4LPS刺激N9，EOC20细胞株及TLR4缺失的原代小胶质细胞均能引发荧光钙振荡；这种振荡依赖于细胞内的游离钙离子，并能被mGluR5受体拮抗剂所拮抗。结果提示LPS刺激通过小胶质细胞时通过直接作用于mGluR5受体，引发小胶质细胞的荧光钙振荡；5LPS刺激N9，EOC20细胞株及TLR4缺失的原代小胶质细胞后，能够引发NMDAR1受体的Ser896位点的磷酸化，这种磷酸化能被mGluR5受体拮抗剂所拮抗。结果提示LPS刺激小胶质细胞，可直接作用于mGluR5受体引发了NMDAR1受体的磷酸化过程；6LPS刺激N9，EOC20小胶质细胞株，能引发TLR4/NMDAR1间的蛋白质相互作用，这种相互作用能被mGluR5受体拮抗剂所拮抗；7LPS刺激N9，EOC20小胶质细胞株时，通过作用于mGluR5受体，能增强NF-κB的活性。提示LPS作用于小胶质细胞时，存在TLR4以外的活化NF-κB的途径；8对mGluR5受体的激活，能抑制LPS刺激N9细胞导致的TNF-α分泌增高。提示mGluR5受体参与了抗炎反应，可能成为调节炎症反应的新的靶点。综上所述，我们的研究证实了在小胶质细胞上，LPS除了经典的TLR4信号通路以外，还存在mGluR5受体这个新的作用靶点，LPS通过这个靶点，活化了NF-κB，通过某种机制，降低了TNF-α炎性介质的分泌，起到抗炎的作用。推测该信号通路如下：LPS刺激小胶质细胞，除了与TLR4结合外，还直接作用于mGluR5受体，引发小胶质细胞内游离钙的钙振荡，磷酸化NMDAR1受体的Ser896位点，使得大量滞留于内质网的NMDAR1受体向胞膜迁移，并与胞膜上的TLR4受体发生蛋白质相互作用。
陈奕芝[10]2007年在《β-细辛醚对谷氨酸所致神经元损伤的保护作用》文中研究说明神经系统疾病发病率逐年上升，严重威胁着人们的健康，造成沉重的社会及经济负担，已成为人类迫切需要解决的首要问题。在缺血性中风、癫痫、颅脑损伤、帕金森病、肌萎缩侧索硬化等疾病过程中，谷氨酸能神经通路异常激活并由此而产生的兴奋性毒性，是造成神经元损伤的重要原因。已有大量动物实验研究和逐渐增多的临床实验表明，能够减少突触前谷氨酸释放，或抑制突触后谷氨酸受体的物质，有可能减轻多种原因触发的谷氨酸介导的神经元损伤。尽管目前已经明确和开发了一系列的谷氨酸受体拮抗剂，对多种神经系统疾病有潜在的临床应用价值，但由于其存在的不良反应而限制了其在临床方面的应用。中医药的现代研究表明很多中药对中枢神经系统有保护作用，本实验室前期在体实验研究结果表明β-细辛醚可显着抑制由脑缺血——再灌注诱导的神经细胞凋亡。为了更加深入地研究和明确β-细辛醚的作用机制，探讨神经系统疾病中起主要作用的氨基酸兴奋性毒性机制及其治疗药物，本实验拟在体外培养PC12细胞和原代培养乳鼠脑皮层神经元的基础上，探讨β-细辛醚对兴奋性氨基酸——谷氨酸损伤神经元的干预作用，试图通过本研究，能够阐明体外谷氨酸兴奋性损伤的作用机制及为开发抗兴奋性氨基酸毒性新药提供研究基础。研究目的：1．观察β-细辛醚对生理状态下PC12细胞和大鼠脑皮层神经元形态和细胞活力的影响，初步了解β-细辛醚对神经细胞的干预作用；2．观察β-细辛醚对谷氨酸诱导的PC12细胞及乳鼠脑皮层神经元的保护作用，并探讨其作用机理。研究方法：1．提取并精制β-细辛醚；2．将基质A(每100ml培养基中含3mg吐温-80和3mg甘油)、基质B(每100ml培养基中含48mg吐温-80和48mg甘油)及36.014、72.028、144.057、288.114、576.228、1152.456、2304.912μmol／Lβ-细辛醚与PCI2细胞共培养24h，观察对其形态学和细胞活力的影响；3．建立PC12细胞谷氨酸损伤模型；4．体外培养PC12细胞，β-细辛醚(36.014、72.028、144.057μmol／L)预给药4h，荡洗后加入终浓度为10mmol／L的谷氨酸继续培养16h，MTT法检测细胞活力，倒置相差显微镜观察细胞形态学变化，透射电镜观察细胞超微结构改变，分光光度计检测培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)的含量，流式细胞术检测细胞凋亡率、细胞内游离钙离子浓度、线粒体膜电位(MMP)的变化，探讨β-细辛醚对谷氨酸诱导损伤的PC12细胞的干预作用；5．体外培养大鼠脑皮层神经元，培养至第10d，光学显微镜和免疫细胞化学染色鉴定神经元；6．建立大鼠脑皮层神经元谷氨酸损伤模型；7．将36.014、72.028、144.057、288.114、576.228、1152.456、2304.912μmol／Lβ-细辛醚与培养至第12-14d的脑皮层神经元共培养24h，观察对其形态学和细胞活力的影响；8．脑皮层神经元培养至第12～14d，β-细辛醚(36.014、72.028、144.057μmol／L)预给药4h，荡洗后加入终浓度为40mmol／L的谷氨酸继续培养16h，MTT法检测细胞活力，应用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化，透射电镜观察细胞超微结构改变，分光光度计检测培养上清中LDH的含量，流式细胞仪检测神经元凋亡率、神经元胞内游离钙离子浓度、MMP的变化，探讨β-细辛醚对谷氨酸诱导损伤的脑皮层神经元的干预作用。研究结果：1．相差显微镜下PC12细胞呈现神经细胞样形态，胞体呈叁角形、菱形、梭形，2～4个突触，相互交叉成网状，折光性较强：透射电镜下细胞核呈圆形，单个存在，染色质分布均匀，核膜完整，细胞质富含线粒体、内质网、溶酶体，细胞膜完整，微绒毛丰富；也可见核膜消失，染色质密集，成分叶状，为处于分裂、增殖的PC12细胞；2．PC12细胞与基质A组、基质B组及36.014、72.028、144.057、288.114、576.228、1152.456、2304.912μmol／Lβ-细辛醚共培养6h，基质A组、基质B组及36.014～576.228μmol／Lβ-细辛醚组细胞形态未有明显改变，1152.456、2304.912μmol／Lβ-细辛醚组细胞的突起减少，细胞皱缩，折光性下降，部分细胞脱落；共培养24h，基质A组、基质B组及36.014～288.114μmol／Lβ-细辛醚组PC12细胞形态未有明显改变，576.228μmol／Lβ-细辛醚组PC12细胞已有损伤，表现为细胞突起结构消失减少、细胞圆缩聚集，1152.456、2304.912μmol／Lβ-细辛醚组PC12细胞损伤进一步加重；3．10mmol／L的谷氨酸与PC12细胞共培养16h，相差显微镜下见细胞不同程度的变圆、皱缩，突触缩短、减少，局部脱落、裂解成碎片；透射电镜未见明显凋亡特征性改变，细胞核完整，染色质减少、溶解消失，出现空隙，细胞质疏松，线粒体肿胀、脱颗粒、嵴断裂，空泡形成，内质网扩张、形成空泡，溶酶体肿胀，细胞膜尚完整，微绒毛消失。10μmol／L尼莫地平及36.014、72.028、144.057μmol／Lβ-细辛醚预给药4h，光镜下尼莫地平组及β-细辛醚组细胞形态无明显改变，透射电镜下可见尼莫地平组少量细胞线粒体略减少，溶酶体缩小，出现空隙，微绒毛减少等改变，也可见与正常培养PC12细胞结构无明显差异的细胞；144.057μmol／Lβ-细辛醚组细胞超微结构无明显改变；4．10mmol／L的谷氨酸与PC12细胞共培养16h，细胞活力下降(0.88±0.05)，培养液中LDH含量增多((607.24±14.31)U／L)，细胞凋亡率增加(10.82％)，细胞内游离钙离子浓度升高(189.29±19.72)，线粒体膜电位下降((66.88±4.70)％)；10μmol／L尼莫地平组及144.057、72.028、36.014μmol／Lβ-细辛醚组的细胞活力、培养液中LDH含量、细胞凋亡率、细胞内钙离子浓度及线粒体膜电位分别为(1.00±0.02、1.00±0.04、0.97±0.04、0.94±0.01)、((272.46±22.02、375.44±15.07、519.08±11.07、550.24±13.62)U╱L)、(4.90±1.14、4.95±1.84、6.83±1.79、8.68±1.37)％、(144.73±14.02、145.73±21.25、158.99±28.12、176.93±18.31)、(88.28±1.55、81.36±6.19、77.14±6.58、70.36±6.90)％；5．相差显微镜下培养至10d的脑皮层神经元胞体呈锥形或多角形，突起主干和分支明显延长并增粗，有明显的光晕，折光性增强，富有立体感，形成稠密的网络结构；细胞免疫化学染色结果显示，大部分细胞可见神经元烯醇酶(neuron specific enolase，NSE)免疫阳性颗粒位于核周质及突起中(呈棕黄色)，细胞核不染色，为一圆形或椭圆形淡染区，胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)染色呈弱阳性；透射电镜可见神经元体积较大，细胞核、细胞质均较大，呈浅灰色着色，染色质分布均匀，核膜双层结构完整，线粒体、溶酶体、内质网等细胞器较丰富；.6．培养至12～14d的脑皮层神经元与36.014、72.028、144.057、288.114、576.228、1152.456、2304.912μmol／Lβ-细辛醚共培养24h，与正常培养的神经元比较，36.014～576.228μmol／Lβ-细辛醚组神经元形态无明显改变；而1152.456μmol／Lβ-细辛醚组神经元胞体相对较大；2304.912μmol／Lβ-细辛醚则对神经元有损伤作用，神经元变圆、皱缩，折光性下降，部分突起收缩；7．培养至12～14d的脑皮层神经元与40mmol／L谷氨酸共培养16h后，折光性明显下降，部分细胞变圆、皱缩、脱落，裂解成碎片，透射电镜可见神经元胞核呈圆形，核膜光滑、完整，染色质边聚，线粒体肿胀，部分内质网扩张；10μmol／L尼莫地平及36.014、72.028、144.057μmol／Lβ-细辛醚预给药4h，能不同程度地减轻谷氨酸对脑皮层神经元的损伤，光镜下细胞形态无明显改变，透射电镜下可见144.057μmol／Lβ-细辛醚组其神经元除少量染色质边聚、内质网轻微扩张、线粒体轻度肿胀外，余与正常培养的脑皮层神经元无明显差异；.8．培养至12～14d的脑皮层神经元与40mmol／L谷氨酸共培养16h后，其凋亡细胞增多(21.05±4.81)％，培养液中LDH含量增高(619.40±36.71)U／L，细胞内游离钙离子浓度升高(107.49±21.10)，线粒体膜电位轻微下降(91.93±8.54)％，但与正常对照组比较，未有统计学差异(P>0．05)；1μmol／L尼莫地平组及144.057、72.028、36.014μmol／Lβ-细辛醚组的细胞活力、培养液中LDH含量、细胞凋亡率、细胞内钙离子浓度、线粒体膜电位分别为(0.66±0.01、0.63±0.01、0.58±0.01、0.56±0.01)、(440.80±27.28、475.00±33.51、561.64±39.36、593.56±41.50)U／L、(6.80±2.48、5.97±0.88、9.01±2.46、9.83±1.92)％、(92.56±21.13、94.64±20.97、84.89±18.82、107.57±24.12)、(99.27±1.89、98.57±2.48、95.48±7.22、95.10±5.16)％。研究结论：1．本实验体外培养高分化PC12细胞，接种在含5％胎牛血清、5％马血清的高糖DMEM培养基培养，2h后完全贴壁，细胞呈小叁角形，12h呈现神经细胞样形态，胞体呈叁角形、菱形、梭形，伸出2～4个突起，折光性较强，24h后突起较长，互相交叉，48h后细胞生长呈网状，符合神经细胞的形态结构，可用于实验；2．基质A、基质B对正常培养的PC12细胞的形态学及细胞活力无明显影响，576.228、1152.456、2304.912μmol／L的β-细辛醚能抑制体外培养的PC12细胞增殖。关于β-细辛醚对体外培养的PC12细胞增殖的抑制作用是作用于增殖周期中的哪一个环节，并通过何种机制来实现，还需要进一步研究；3．谷氨酸对高分化PC12细胞的毒性作用有明显的剂量依赖关系，随着谷氨酸浓度的增加，其毒性作用增强；10mmol／L谷氨酸与PC12细胞共培养16h，可造成PC12细胞凋亡模型；4．36.014、72.028、144.057μmol／Lβ-细辛醚预给药4h，均能不同程度地减轻10mmol／L谷氨酸对PC12的损伤作用，抑制LDH漏出，拮抗细胞内钙离子浓度的异常升高，稳定MMP状态，从而发挥其抗神经元凋亡的作用；5．本实验建立的新生大鼠脑皮层神经元培养方法，可得到纯度较高的神经元，为揭示神经元、神经网络超微结构及神经元生理、生化和病理等方面的复杂变化和研究神经药理学提供了便利；6．一定浓度的β-细辛醚对正常培养的大鼠脑皮层神经元有促生长作用，其神经元胞体较大，突起密集；7．谷氨酸对脑皮层神经元的毒性作用有明显的剂量依赖关系，随着谷氨酸浓度的增加，其毒性作用增强；40mmol／L谷氨酸与脑皮层神经元共培养16h，可造成神经元凋亡模型；8．36.014、72.028、144.057μmol／Lβ-细辛醚预给药4h，均能不同程度地减轻经40mmol／L谷氨酸诱导损伤的脑皮层神经元其凋亡和坏死，抑制LDH漏出，减少由谷氨酸引起的细胞内钙离子异常增多，但对MMP无明显影响。表明β-细辛醚可能通过抑制谷氨酸受体活性、钙拮抗作用而减轻谷氨酸诱导的神经元的损伤。
参考文献：
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