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人源ARH3-ADPR复合物三维结构与功能研究

2020-12-09阅读(817)

人源ARH3-ADPR复合物三维结构与功能研究

论文摘要

在生物体蛋白质生物合成后,蛋白质的共价修饰和酶促修饰称为翻译后修饰。ADP-核糖化是向蛋白质中添加一个或多个ADP-核糖部分。这是一种可逆的翻译后修饰,涉及细胞信号传导,DNA修复,基因调控和细胞凋亡等多种细胞过程。它由多聚核糖聚合酶（PARP）家族催化。一旦DNA发生损伤,多聚核糖聚合酶家族会被招募至DNA损伤位点,并将NAD+供体上共价连接的ADP-核糖部分转移到特异性氨基酸残基,比如天冬酰胺、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和半胱氨酸等侧链上。多聚ADP-核糖（PAR）链可以作为一种DNA损伤修复蛋白的信号,当DNA损伤修复完成后,PAR链就会被PAR链会被糖苷水解酶降解。蛋白的ADP-核糖基化在多种生物过程中（尤其DNA损伤修复）起重要作用。最近研究表明:丝氨酸是一个ADP-核糖基化重要的受体,并且丝氨酸的ADP-核糖基化被ADP-核糖水解酶3（ARH3或ADPRHL2）水解。然而,ARH3介导丝氨酸-ADP-核糖基化水解的具体机制尚不清楚。本论文中,通过克隆人源ARH3（19-363）的基因,构建p ET15b的重组基因,利用原核表达系统,经一系列纯化步骤得到浓度较高、均一性较好的重组蛋白并结晶、收集高分辨率晶体衍射数据、解析晶体结构,从而得到ARH3和ADPR复合物的结构。相关数据分析表明:在人源ARH3中有一组酸性氨基酸与催化中心的两个镁离子进行配位,作用于丝氨酸连接的ADP核糖基团的水解。特别是,还在催化中心发现了41位的谷氨酸的动态构象变化。这表明镁离子和Glu41及351位的水分子可能在丝氨酸-ADPR底物中介导了糖苷键的水解。此外,通过结构分析,发现ADPR被包裹在一个活性口袋中,并且和ARH3氨基酸的主链及侧链形成许多氢键,构成一个氢键网络。基于这些结构的发现,采用定点突变实验来探究ARH3结构中催化口袋上的关键氨基酸功能上的作用,进一步说明丝氨酸在介导DNA损伤修复上参与ADP-核糖基团的水解。不仅如此,ADPR的识别能够把ARH3招募到DNA损伤部位,这对DNA损伤应答修复十分重要。本论文将综合运用结构生物学及细胞生物学,分子生物学的知识技术手段,对ARH3从丝氨酸水解ADPR-核糖基团并引发DNA损伤修复的分子机制进行初步探究。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 第一章 绪论
  •   1.1 ADP-核糖基化
  •   1.2 去-ADP-核糖酶催化机制
  •   1.3 研究目的与意义
  •     1.3.1 研究目的
  •     1.3.2 研究意义
  • 第二章 实验材料与方法
  •   2.1 主要仪器
  •   2.2 实验材料与试剂
  •   2.3 实验方法
  • 第三章 hARH3 基因克隆、纯化结晶与数据收集
  •   3.1 重组基因的构建
  •     3.1.1 引物设计
  •     3.1.2 ARH3 基因PCR扩增
  •     3.1.3 PCR产物及质粒载体的双酶切反应
  •     3.1.4 连接反应
  •     3.1.5 重组质粒的转化与阳性克隆鉴定
  •     3.1.6 蛋白表达与纯化
  •     3.1.7 ARH3与ADPR复合物的结晶
  •   3.2 实验结果
  •     3.2.1 ARH3 基因PCR扩增结果
  •     3.2.2 内切酶双酶切
  •     3.2.3 重组质粒的转化与阳性克隆鉴定
  •     3.2.4 镍柱纯化结果
  •     3.2.5 Source15 Q离子交换柱纯化结果
  •     3.2.6 Superdex75 Increase分子筛色谱柱纯化结果
  •     3.2.7 ARH3-ADPR复合物晶体
  •     3.2.8 数据收集和处理
  •     3.2.9 结构确定和精修
  •   3.3 本章小结
  • 第四章 ARH3-ADPR复合物的结构分析
  •   4.1 apo-ARH3 结构
  •   4.2 ARH3-ADPR复合物结构
  •   4.3 ARH3中ADPR结合腔结构
  •   4.4 本章小结
  • 第五章 ARH3 的催化机制
  •   5.1 ARH3 的催化位点
  •   5.2 ADP-核糖水解酶不同的催化机制
  •   5.3 ARH3和PARG结合口袋之间的结构对比
  •   5.4 本章小结
  • 第六章 ARH3 的催化功能分析
  •   6.1 ARH3 中的关键氨基酸突变消除了ARH3 酶活性
  •     6.1.1 质粒和siRNA
  •     6.1.2 细胞培养
  •     6.1.3 PAR的合成和纯化
  •     6.1.4 ADPR的水解测定
  •     6.1.5 激光微辐射和显微镜图像收集
  •     6.1.6彗星实验
  •   6.2 ARH3 的酶活性在DNA损伤修复中起重要作用
  •   6.3 本章小结
  • 结语
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间取得的研究成果

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 王梦曦

    导师: 刘秀华

    关键词: 核糖水解酶,核糖基化,损伤修复,晶体结构,功能分析

    来源: 河北大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 河北大学

    基金: 国家自然科学基金(编号:81672794),河北省百人计划(编号:E2016100014),河北省教育基金(编号:SLRC2017023)

    分类号: Q75

    总页数: 66

    文件大小: 2963K

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