重组CHO细胞高效表达乙肝表面抗原的研究

孔双泉^[1]2004年在《重组CHO细胞高效表达乙肝表面抗原的研究》文中认为目前，全世界有 3.5～4 亿人为慢性乙肝病毒携带者，其中九千万人发展成继发性肝病。我国是 HBV 感染的高发区，约 1.7 亿人受 HBV 感染，一千七百万人患慢性肝炎。每年死于 HBV 导致的肝癌，肝硬化者约五十万人。 接种乙肝疫苗是预防治乙肝病毒传播的重要手段。目前，生产乙肝疫苗有酵母和 CHO 细胞两种表达系统，其中利用 CHO 细胞表达的 HBsAg 作为疫苗具有免疫原性强，阳转率高的优点，但产量低是目前遇到的主要问题。 本项工作的目的是构建高效表达 HBsAg 的重组 CHO 工程细胞。首先，我们对 S 基因进行了改造。我们提取目前生产使用的工程细胞 C28 的基因组，并根据 S 基因两端 DNA 序列设计一组引物 S 正和 S 反扩增 S 基因片段。我们采用重迭 PCR 技术将 S 基因中 213，216，224 位叁个稀有密码子替换成哺乳动物细胞偏爱的密码子，即 213TTA→ CTG； 216 TTA→ CTG； 224 GTA→GTG。得到 Sm。测序结果表明我们突变获得成功。 其次，我们构建了两个表达载体 P1 和 P4，在构建或选择 CHO 细胞表达载体时，我们考虑了一些调控元件的选择：启动子和增强子 、多聚腺苷酸加尾信号、插入序列（IVS）、选择标记 、多克隆位点（MCS）和抗性基因。 P1 载体的构建。我们利用限制性内切酶 NHeI 和 EcoRI 双酶切 pCI-neo载体和 pMD18-T-Sm，将两个片段连接转化获得 pCI-neo- Sm转化子。设计引物SD 弱和 SD 反扩增出 SV 弱＋DHFR 基因片段（SD 弱）（去除 SV40 启动子中的增强子）。利用限制性内切酶 AsuII 和 PvuII 将 SV 弱＋DHFR 基因片段插入pCI-neo- Sm质粒中，构建成 P1 表达载体。利用限制性内切酶 XbaI 和 AsuII对 P1 载体进行酶切鉴定。以 P1 表达载体为模板，利用引物 S 正 1，S 反 1(扩增 Sm 基因片段)和引物 SD 弱，SD 反（扩增 SV 弱+dhfr 基因片段）分别进行PCR 扩增鉴定。酶切和 PCR 鉴定结果与预期一致。 i吉林大学硕士学位论文 重组 CHO 乙型肝炎疫苗的高效表达 P4 载体的构建。利用 NheI 和 EcoRI 双酶切 pMD18-T-Sm和 pCI 载体，将酶切片段连接转化获得 pCI-Sm载体。以 C28 细胞基因组 DNA 为摸板，D 正和 D反为引物扩增出 DHFR 基因片段。利用限制性内切酶 SalI 和 NotI 将 DHFR 基因片段插入 pCI-Sm 载体中 Sm 基因下游形成一个双顺反子转录单元，获得pCI-Sm-DHFR。根据表达载体 pCIneo 上的 neor基因 5′端序列和 3′端序列设计引物分别扩增出 neor基因 5′端 N5 片段和 neor基因 3′端 N3 片段。将 N5片段与内含子连接扩增，然后再与 N3 片段连接扩增获得 N+i 基因片段，并将其连接到 T 载体上得到 pMD18-T-N+i。利用限制性内切酶 BglII 和 NotI 双酶切 pCI-neo 载体，将大片段用 Klenow Fragment 补平连接转化。用 AsuII 和PstI 酶切此重组质粒和 pMD18-T-N+i，将两个片段连接转化。利用内含子中BglII 和 NotI 酶切位点，将带有 hCMV 启动子的 Sm-DHFR 基因片段引入 NEO 基因中。构建成 P4 载体。利用限制性内切酶 XbaI 和 AsuII 对 P4 载体进行酶切鉴定。以 P4 载体为摸板，分别用叁组引物 D 正和 N3 反、S 正 1 和 D 反、N5正和 S 反 1 进行 PCR 扩增鉴定。酶切和 PCR 鉴定结果与预期一致。 我们构建的 P1 和 P4 表达载体上均带有 hCMV 强启动子、多聚腺苷酸加尾信号、人工构建的内含子和共扩增基因 DHFR 基因，并且插入的 S 基因不带有5′和 3′非翻译区。在 P1 载体上，DHFR 基因的 SV40 启动子中去除了增强子，对 DHFR 基因起到弱化作用。在 P4 载体中，NEO 选择标记基因中插入长的 DNA片段，影响了 NEO 基因转录后加工，弱化了 NEO 基因的表达。同时 DHFR 基因位于 S 基因下游，DHFR 基因的表达被弱化。DHFR 基因的弱化有助于 S 基因拷贝数的增加，NEO 基因的弱化则有助于 S 基因整合到基因组的热点即转录活跃区。P1 和 P4 表达载体以上特点都有利于 S 基因的高效表达。 利用碱裂解的方法对 P1和 P4 进行质粒大量提取经氯化铯密度梯度离心，得到高纯度的 P1 和 P4 质粒。根据 LipofectamineTm Reagent 说明书的转染方 ii吉林大学硕士学位论文 重组 CHO 乙型肝炎疫苗的高效表达法并设置 5ul、10ul、20ul 叁种质脂体浓度转染 CHO/dhfr-细胞，利用乙型肝炎表面抗原检测试剂盒检测 HBsAg 的表达。检测结果显示 P1 和 P4 载体转染结果均呈阳性，表明 P1 和 P4 载体中的 S 基因得到了表达，其中 5ul 质脂体浓度转染效果较好。 我们利用 MTX 对 P1 载体进行加压梯度筛选，首先采用含 2×10-8mol/L MTX的筛选培养基培养，经过 2-3 周培养生长出抗性细胞群。用胰酶将抗性细胞洗下。然后用含 10-7mol/L MTX 的筛选培养基培养。经过 2-3 周培养生长出抗性细胞群后，将抗性细胞用胰酶洗下，转入含 10-6mol/L MTX 的筛选培养基中培养 P4 先采用含 100mg/mL G418 的筛选培养基培养，然后改用含 2×10-8mol/LMTX 的筛选培养基培养。经过 2-3 周培养出抗性细胞

单连慧^[2]2004年在《重组CHO细胞高效表达乙肝表面抗原的研究》文中指出目前，全世界有3.5～4亿人为慢性乙肝病毒携带者，其中九千万人发展成继发性肝病。由于HBV感染及其继发病而死亡的患者每年约1～2百万。我国是HBV感染的高发区，约1.7亿人受HBV感染，一千七百万人患慢性肝炎。每年死于HBV导致的肝癌，肝硬化者约五十万人。注射乙肝疫苗是预防乙型肝炎的重要手段。采用乙肝疫苗来预防乙型肝炎，经过多年广泛应用以被证明是一种安全、可靠、有效的方法。世界卫生组织（WHO）推荐在乙型肝炎高度流行的国家给婴幼儿常规免疫接种。目前我国已将接种乙肝疫苗纳入国家计划免疫体系。我国，由中国预防医学科学院病毒所和长春生物制品研究所共同研制的中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达的乙肝表面抗原S蛋白于1992年批量上市。利用CHO细胞表达的乙肝表面抗原具有免疫原性强，阳转率高的优点，但产量低是目前遇到的主要问题。长春生物制品所目前生产所用细胞株构建于二十世纪八十年代末，产量在1~2 mg HBsAg/48 hr/L，产品供不应求。为了扩大市场份额，向社会提供更多的优质的乙肝疫苗，我们打算构建新的CHO工程细胞株，使其HBsAg表达量在现有水平上得到提高。我们对目前长春生物制品所使用的乙肝疫苗生产细胞株C28的特点进行仔细研究，在查阅大量文献的基础上提出全新的表达载体设计方案，包括更换启动子、引入内含子、去除目的基因的5′和3′非翻译区、弱化抗性标记基因、改造目的基因中的稀有密码子等，构建了乙型肝炎病毒表面抗原S基因的两种新型表达载体。启动子是影响外源基因表达效率的关键因素之一。我们构建的1号和3号两种表达载体是以pCI和pCIneo质粒为出发质粒。pCI和pCIneo都带有hCMV启动子，此启动子比pSV中的SV40早期启动子要强5倍。表达载体中引入天然或人工合成的内含子序列有利于引导外源蛋白前体的稳定性，我们选择的pCI和pCIneo表达载体中，紧接hCMV下游有一IVS序列，有利于目的基因mRNA的成熟与稳定。在目的基因5′非翻译区（UTR），有可能形成一定的二级结构，从而影响目的基因的翻译起始，而3′非翻译区则可能存在降低mRNA稳定性，影响mRNA寿命的区域，从而影响外源基因的表达。所以我们构建1号和3号表达载体时，去除目的基因的5′和3′非翻译区。对dhfr的弱化可以大大提高共扩增基因的拷贝数，而对neo的弱化可促使筛选到整合于染色体热点上的转化子。1号表达载体通过去除SV40早期启动子中的增强子而弱化dhfr基因的表达；3号表达载体在弱化dhfr基因表达的同时，又增添了一种新的选择标记，即neo。采用去除SV40早期启动子中的增强子来弱化启动子强度，从而达到弱化neo基因表达的目的。稀有密码子在真核细胞中对翻译有一定的影响，在真核生物中有两个最稀有密码子TTA和TCG，当几个这种稀有密码子相距较近时会严重阻碍核糖体的前进，使翻译效率大大降低，表达水平下降。在本课题中，通过对乙肝表面抗原S基因密码子使用情况的分析表明，在213，216位氨基酸处分别存在一个使用频率最低的密码子TTA，二者只相距6个核苷酸。我们预计，这两个相距较近的密码子可能会对翻译过程造成很大的影响，从而降低蛋白表达量。因此，我们用哺乳动物细胞最常用密码子CTG来取代TTA，同时将224位稀有密码子GTA突变成GTG得到Sm基因。用PCR方法从长春生物制品研究所基因工程乙肝疫苗生产用工程细胞C28中分离和扩增HBsAg S基因片段，采用重迭PCR技术将第213，216和224位氨基酸的叁个稀有密码子替换成哺乳动物细胞偏爱的密码子，得到Sm。以C28基因组DNA为模板，扩增出570bp的dhfr基因和930bp的SV弱+dhfr基因，其中后者含有SV40早期启动子序列和dhfr基因序列。以pCIneo为模板，扩增出1140bp的SV弱+neo基因，它含有SV40早期启动子序列和完整的新霉素磷酸转移酶基因序列。把Sm基因、dhfr、SV弱+dhfr、SV弱+neo分别克隆到pCI和pCIneo载体上，构建成两种表达载体。两种表达载体经PCR方法和酶切方法证明构建正确。序列分析表明所构建的表达载体插入的外源基因型为我国乙型肝炎病毒主要流行株adr亚型的S基因，对该基因稀有密码子的改造结果也与预期相符；载体上其他表达元件也经测序证实。将两种质粒载体经大提和氯化铯密度梯度离心纯化后转染CHO-dhfr-细胞，在CHO-dhfr-细胞中成功表达出HBsAg。利用DIAGNOSTIC KIT for HBsAg检测HBsAg的表达量。在dhfr基因与目的基因共转化的细胞中，随着培养基中MTX浓度的增加，dhfr基因与外源基因均明显扩增。将1号、3号两种表达载体成功转染到CHO-dhfr-细胞后，1号转染的细胞一直使用MTX筛选培养基,并逐渐增加MTX的浓度，使S基因拷贝数不断增加；3号转染的细胞我们首先使用G418使3号表达载体尽可能整合到染色体的热点部位。然后我们用MTX代替G418筛选培养基，并逐渐加大MTX的浓度，使S基因得到扩增。经不同加压筛选策略获得抗性细胞群，进一步用单克隆培养筛选出了几株高效表达HBsAg的细胞株，为提高重组CHO乙型肝炎疫苗的产量奠定了基础。

杨振西^[3]2013年在《乙肝病毒S抗原和preS1抗原表位融合蛋白（S/preS1）在CHO细胞中的稳定高效表达》文中研究表明乙型肝炎是一种严重的全球性疾病,易引发肝硬化和肝癌。目前国内外尚无显着有效的乙肝治疗方法,主要采用预防为主、治疗为辅的方针。自从1981年第一代乙肝疫苗问世至今,乙型肝炎的蔓延得到有效地控制,全球肝癌的发生率下降了75%。目前全球广泛使用的是利用基因工程技术在酵母和哺乳动物细胞中表达的乙肝病毒表面抗原S蛋白(HBsAg)疫苗,接种疫苗后约有10-15%的人群无应答或者低应答,且一般不能诱导细胞免疫应答。研制能克服现有乙肝疫苗缺陷的新型乙肝疫苗已成为一项迫切的研究课题。研究表明,在主蛋白抗原S的基础上增加额外的HBV表面抗原能够增强免疫原性,含前S蛋白的重组乙型肝炎疫苗是第叁代乙肝疫苗研发的重点,有望替代现在广泛使用的基因工程疫苗。本研究的研究思路是将乙肝病毒S抗原基因和preS1抗原表位(21-47位氨基酸)基因组合形成融合基因,在CHO细胞中实现S/preS1的稳定高效表达。本研究采用转录水平调控为主、转录后调控为辅的表达载体设计思想,将S/preS1基因插入含有克服位置效应、细胞内源性强启动子及mRNA运输及稳定性调控元件的真核细胞表达载体,成功构建表达乙肝病毒S抗原和preS1抗原表位(21-47位氨基酸)融合蛋白(S/preS1)的真核表达载体HMRCHEF53u/Neo-S/preS1。通过脂质体介导表达载体转染CHO-S细胞,经有限稀释克隆筛选,在96孔板内获得单克隆细胞27株,ELISA检测表明均为阳性单克隆。将单克隆细胞经过24孔板、6孔板传入T25细胞方瓶,再次ELISA检测获得13株较高S/preS1表达水平的单克隆细胞系。对13株细胞系进行无血清悬浮批次培养,最终获得了体外生长性状好、S/preS1表达效率高的重组细胞系10G6。RT-PCR结果显示S/preS1基因在重组CHO细胞中得到表达,Western blot印迹分析证实10G6细胞表达的S/preS1同时保留S和preS1的天然免疫原性。以活细胞密度、S/preS1累计表达量、葡萄糖消耗量及乳酸积累量为观察指标,本研究考察了10G6细胞的生长表达特性及稳定性。有血清培养时10G6细胞的最高活细胞密度达到0.67×105cells/mL,S/preS1累积表达水平达到1.82μg/mL培养终止时葡萄糖剩余4.73mM,乳酸累积量为9.85mM。通过计算得到10G6细胞的比生长速率μ和S/preS1表达速率qS/preS1分别为0.2d-1和1.23μg/106cells/d。无血清培养时10G6细胞的最高活细胞密度达到5.4×106cells/mL, S/preS1累积表达水平达到3.99μg/mL,培养终止时葡萄糖完全消耗,乳酸累积量为8.8mM。通过计算得到10G6细胞的比生长速率μ和S/preS1表达速率qS/preS1分别为1.54d-’和0.88μg/106cells/d。结果表明,10G6细胞在无血清培养时的比生长速率μ高于有血清培养,S/preS1表达速率qS/preS1接近低于有血清培养。由于10G6细胞在无血清培养的活细胞密度明显高于有血清培养,相应地S/preS1累积量也明显高于的在10G6细胞在在有血清培养的水平。在为期约2月的连续15批次无血清培养中,各批次10G6细胞的活细胞密度基本保持在4×106cells/mL以上、活力维持在90%以上,反映10G6细胞表达稳定性的S/preS1值基本稳定在1-1.25mg/L水平,表明10G6细胞在无血清培养中具有良好的细胞生长和稳定的产物表达性状,符合生物技术药物规模化生产细胞系的质量要求。流加培养是当前重组蛋白生产的主流培养模式,流加培养根据细胞对营养物质的不断消耗和需求,在培养过程中流加浓缩的营养液,有效地减缓乃至消除营养限制因素,从而延长细胞培养时间,提高细胞培养密度及细胞表达产物浓度。本研究以活细胞密度、细胞活力和S/preS1表达水平为观察指标,分别考察了包括细胞接种密度、流加培养基选择、流加起始时间、培养温度等重要工艺参数,建立了以CHO CD EfficientFeedTM B为流加培养基、接种密度为3×105cells/mL、流加起始时间为2-3d、每48h按10%培养体积补充流加培养基、累计流加3次(30%培养体积)、起始培养温度为37℃、培养6d后温度下调至32℃、培养持续时间17-20d为主要工艺参数的10G6细胞无血清流加培养工艺。采用所建立的10G6细胞无血清流加培养工艺,不同批次10G6细胞流加培养的活细胞密度达到7-10×106cells/ml、S/preS1的累积浓度达到17-20mg/L,较之于10G6细胞的在温度设置为37℃的无血清培养工艺,10G6细胞无血清流加培养工艺的活细胞密度和S/preS1表达水平约分别提高60%和360%。

张艳^[4]2008年在《HBsAg真核表达载体的构建及在CHO细胞高效表达的研究》文中提出以pCI和pCIneo为起始质粒,通过改造目的基因及表达载体,对CHO细胞系统高效表达乙肝表面抗原进行了初步探索。结果显示,通过更换启动子、引入内含子、去除目的基因的5′和3′非翻译区、弱化抗性标记基因、改造目的基因中的稀有密码子等方法,成功构建了乙型肝炎病毒表面抗原S基因的新型表达载体。将构建的表达载体分别转染到CHO/dhfr-细胞中,均表达出了乙型肝炎表面抗原(HBsAg),经叁轮梯度加压筛选获得抗性细胞群。单层培养分泌动态研究表明其HBsAg表达量稳定在512～1024/两天,比原有生产细胞株HBsAg表达量提高近2倍,为提高基因工程乙肝疫苗的产量奠定了实验基础。

金立杰^[5]2007年在《重组乙型肝炎前S2S疫苗的研究》文中研究说明乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的一种传染性疾病。我国现有乙肝疫苗仅含S蛋白,尚有5 %～10 %的人群无反应或弱反应。研究发现, preS2 (前S2)蛋白有很强的免疫原性,可强化同存的S蛋白;前S2抗体产生早,利于快速预防;前S2有多聚人血清白蛋白受体(PHSA-R),可介导与HBV竞争结合肝细胞,从而阻断HBV的感染,具有免疫原性强、快速预防和治疗等多重作用。本课题完成含前S2(120-146)免疫表位重组质粒pcs-S2S的构建,并转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO cells),获得能稳定分泌表达前S2S的重组CHO细胞株;经DNA测序和杂交证明前S2S基因重组到CHO细胞中;表达产物经电泳及免疫印迹证明有前S2蛋白的表达;免疫效力实验证明有S和前S2抗体的产生,并能诱导细胞免疫应答。该研究为研制预防和治疗双重作用的新型乙肝疫苗做了有益的尝试。

王德彬, 颜华^[6]2008年在《含前S的乙肝病毒表面抗原的纯化与分析》文中研究指明将获得的能稳定表达含前S的乙肝病毒表面抗原的重组CHO细胞进行培养,并收取培养液上清,拟分析并纯化重组CHO细胞表达的蛋白。利用高效液相层析试验,分析表达产物,表明重组细胞表达产物具有乙肝表面抗原——大蛋白(LS)的生化特性。并通过沉淀离心和Sepharose CL-4B柱层析进行了初步纯化。结果表明,C10细胞株表达的蛋白与预期设计的相似,并获得初步的纯化。

邓军^[7]2008年在《重组乙肝表面S抗原在CHO-K1细胞中的表达、克隆筛选》文中提出乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的全球性传染病。HBV除了引起急性肝炎外,还可导致慢性肝炎和肝硬化,而且与肝癌的发生有着密切的关系。曾在国内外广泛用于乙型肝炎预防的血源性乙肝疫苗(PDV)因血源供应有限和潜在危险性,己经逐步被基因工程疫苗所代替。中国仓鼠卵巢癌细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO cell)经基因转染后分泌的重组乙肝表面S抗原,和乙肝病人血清来源的抗原同样具有系统的抗原活性,而且在灵长类动物的实验中发现CHO细胞重组乙肝抗原比血清抗原和酵母来源的抗原具有更高的免疫活性,表现为产生更多的抗体和更高的血清滴度。本课题主要内容是建立CHO-K1细胞基因转染乙肝表面S抗原基因的方法,并筛选出稳定表达的CHO细胞株。首先采用分子生物学的方法制备了转染级别的包含乙肝表面S抗原基因的两种质粒pS-1和pcDNA-s-1。然后,用两种转染方法分别转染COS-1细胞和CHO-K1细胞,并用ELISA的方法对转染结果进行检测。经过实验得知,磷酸钙转染法本身受其它很多因素影响且很大,转染方法不稳定;PEI转染法可以有效的转染细胞,实验稳定结果较好,并且确定了最佳的PEI/DNA的质量比为6.7。本实验还对PEI的毒性进行了测定,发现它对CHO-K1细胞毒性不大,细胞存活最少的也有76.01%存活。最后,确定了G418的最佳筛选浓度为600ug/ml后,用PEI转染法转染CHO-K1细胞,经G418加压筛选后,用酶联和透射电镜检测均得到细胞可稳定表达乙肝表面抗原的结论。在本课题中,成功的构建了稳定表达乙肝表面S抗原的CHO细胞株6H3。

高正伦^[8]2007年在《乙肝病毒表面抗原基因在人参细胞中的高效表达》文中研究指明我们在前期工作中建立了人参愈伤组织细胞表达乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的植物表达系统,并就提高表达进行了培养条件的摸索。为了进一步提高HBsAg的表达,我们从表达载体的改造上做了一些探索,对调控HBsAg基因表达的启动子以及翻译增强子进行了改造,构建了十二种不同的植物细胞表达载体pBI/EP、pBI/2EP、pBI/3EP、pBI/4EP、pBI/5EP、pBI/6EP、pBI/7EP、pBI/8EP、pBIBSa(pBI35S)、pBI/2EPomega、pBI/35Somega和pBI/35SRomega,用这些载体分别转化农杆菌LBA4404,再与人参愈伤组织细胞共培养,经G418筛选获得新生抗性细胞,从而将HBsAg基因以及调控基因整合到人参细胞基因组中,经过连续继代培养选育出一株高产细胞系PBIo。PBIo是由质粒pBI/35Somega转化的人参细胞选育而来,携带花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子以及与之串联的烟草花叶病毒TMV(U1株)翻译增强子omega序列。通过对表达载体的改造使HBsAg基因表达有显着提高。在实验中还发现,omega反义RNA序列也具有较强的提高翻译效率的功能。

时成波, 徐军, 王堃, 贾重来, 徐冬冬^[9]2009年在《高效表达乙型肝炎表面抗原的CHO工程细胞株的构建》文中指出目的构建高效表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的CHO工程细胞株。方法从pCIneo质粒出发,构建含有改造了稀有密码子的HBsAgS基因和启动子弱化的二氢叶酸还原酶(DHFR)转录单位的新型表达载体,利用脂质体转染CHO/dhfr-细胞,经3轮氨甲喋呤(MTX)梯度加压筛选和单克隆筛选,获得高效表达HBsAg的CHO工程细胞株,并对HBsAg的分泌动态进行检测。结果所构建的新型表达载体pCI-DS经PCR及酶切鉴定,证明构建正确,转染CHO/dhfr-细胞后,经筛选得到高效表达HBsAg的CHO工程细胞株3F9,表达量达9.21μg/106个细胞·48h。单层细胞培养动态表明,3F9株细胞能在40d内稳定高效表达HBsAg。结论已成功构建稳定高效表达HBsAg的CHO工程细胞株,为提高HBsAg的产量创造了条件。

陈毅^[10]2016年在《非对称垂直流场流分级技术应用于病毒样颗粒稳定性的研究》文中研究表明病毒样颗粒(virus-like particle)是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白,但不包含核酸的自组装颗粒,其形态与真正病毒粒子相同或相似,可作为疫苗的抗原成分。乙肝表面抗原(HBsAg)是一种重要的病毒样颗粒,可以通过注射来使机体产生抗体,达到免疫和阻断乙肝传播的目的。在HBsAg的生产和流通过程中,需要面对许多苛刻的环境因素,比如盐浓度、温度变化,反复冻融等,这些环境因素可能会导致HBsAg出现聚集失活现象,从而影响了疫苗的安全性和有效性。但遗憾的是,目前尚无系统的乙肝疫苗稳定性研究报道。在本文中,我们首次采用无填充介质的非对称垂直流场流分级技术偶联多角度激光散射技术(AF4-MALLS)应用于乙肝疫苗病毒样颗粒的表征,并对两种常见的乙肝疫苗产品(分别由中国仓鼠卵CHO细胞和汉逊酵母细胞表达)在其纯化、生产、运输以及储存过程中所经历的不同环境条件下的颗粒稳定性进行了研究,主要内容包括：1)优化得到了适于分离HBsAg及其聚集体的场流分级条件：①进样和聚焦阶段：进样流速0.2 ml/min,聚焦流速1.8 ml/min,外场流速1.0 ml/min,时间4 min,聚焦阶段和分级阶段的过渡时间是1 min,腔室出口流速保持1.0 ml/min恒定；②分级阶段：外场流速1.0 ml/min保持40 min,然后在5 min内线性衰减到0；③再生阶段：腔室流速1ml/min,保持5min。间隔物厚度350 μm,分离膜为再生纤维素膜,截留分子量为10 kDa。采用AF4-MALLS表征得到中国仓鼠卵CHO细胞表达的CHO-HBsAg和汉逊酵母细胞表达的Hans-HBsAg的重均分子量分别为4742 kDa和3039 kDa；水力学半径分别为29.4 nm和22.8nm。2)通过AF4-MALLS对CHO-HBsAg和Hans-HBsAg在不同溶液环境下的聚集行为进行了研究,并使用抗原诊断试剂盒检测了相应的抗原活性。在2M硫酸铵条件下,CHO-HBsAg比较稳定,活性保持在95%,而Hans-HBsAg明显发生聚集形成分子量105-106 kDa的聚集体,其活性仅保留25%；在反复冻融操作之后,CHO-HBsAg的结构和活性几乎没有什么变化,而Hans-HBsAg发生了明显的聚集,活性仅剩余26.9%：在高温(60℃)处理之后,CHO-HBsAg依然稳定,而Hans-HBsAg的活性已经不足5%。3)系统考察了氯化钠和硫酸铵对Hans-HBsAg稳定性的影响,并对Hans-HBsAg在盐溶液中的聚集行为进行了分析,在此基础上建立了Hans-HBsAg在盐溶液中的聚集模型。Hans-HBsAg在NaCl溶液中发生可逆聚集形成寡聚体(OP),伴随着生物活性的轻微损失。通过透析除去NaCl之后,寡聚体可重新解聚为正常组装体,同时抗原活性随之恢复。在硫酸铵溶液中的聚集情况较为复杂,当硫酸铵浓度较低(<0.5M)且作用时间较短时(<1h),大部分HBsAg聚集成寡聚体形式,当硫酸铵去除后,寡聚体可以重新解聚;而高浓度硫酸铵条件下,OP会进一步聚集形成高聚体(PP), PP的尺寸很大,且该聚集过程会导致抗原活性大幅度降低。即使通过透析去除硫酸铵,也无法使得PP重新解聚成正常组装体,抗原活性也无法恢复。4)考察了几种常见的小分子添加剂对Hans-HBsAg稳定性以及抗原活性的影响。脲和盐酸胍对乙肝疫苗聚集没有明显抑制作用,相反它们作为变性剂,可使蛋白发生聚集；精氨酸对乙肝聚集方面发挥了比较明显的抑制作用,精氨酸对乙肝疫苗聚集的抑制效果与其浓度相关,当精氨酸浓度达到1M时,抑制效果较好；聚乙二醇对乙肝疫苗的抗原活性似乎没有明显影响。而表面活性剂对乙肝疫苗抗原活性的影响表现出不同的效果,吐温80可以提高乙肝疫苗的活性,而Triton100则会使乙肝疫苗的活性降低。

参考文献：

[1]. 重组CHO细胞高效表达乙肝表面抗原的研究[D]. 孔双泉. 吉林大学. 2004

[2]. 重组CHO细胞高效表达乙肝表面抗原的研究[D]. 单连慧. 吉林大学. 2004

[3]. 乙肝病毒S抗原和preS1抗原表位融合蛋白（S/preS1）在CHO细胞中的稳定高效表达[D]. 杨振西. 安徽大学. 2013

[4]. HBsAg真核表达载体的构建及在CHO细胞高效表达的研究[D]. 张艳. 吉林大学. 2008

[5]. 重组乙型肝炎前S2S疫苗的研究[D]. 金立杰. 吉林大学. 2007

[6]. 含前S的乙肝病毒表面抗原的纯化与分析[J]. 王德彬, 颜华. 湖北农业科学. 2008

[7]. 重组乙肝表面S抗原在CHO-K1细胞中的表达、克隆筛选[D]. 邓军. 天津大学. 2008

[8]. 乙肝病毒表面抗原基因在人参细胞中的高效表达[D]. 高正伦. 吉林大学. 2007

[9]. 高效表达乙型肝炎表面抗原的CHO工程细胞株的构建[J]. 时成波, 徐军, 王堃, 贾重来, 徐冬冬. 中国生物制品学杂志. 2009

[10]. 非对称垂直流场流分级技术应用于病毒样颗粒稳定性的研究[D]. 陈毅. 中国科学院研究生院(过程工程研究所). 2016

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