论文摘要
C1,2位脱氢反应是工业上生产甾体药物的重要反应,简单节杆菌（Arothrobacter simplex）则是研究和应用最广泛的C1,2位脱氢菌株。目前在国内主要是利用简单节杆菌对醋酸可的松（CA）进行脱氢反应,从而实现醋酸泼尼松（PA）的工业化生产,简单节杆菌高效脱氢菌株的改造对甾体药物的生产具有重要意义。本研究以来源于简单节杆菌的3-甾酮-Δ1-脱氢酶（KsdD）为研究对象,构建高表达3-甾酮-Δ 1-脱氢酶基因的工程菌株,并尝试建立简单节杆菌的基因敲除体系。克隆简单节杆菌来源的KsdD基因,构建于表达载体pART2中,以简单节杆菌为表达宿主,成功构建7株过表达工程菌株,分别为pART2-WT、pART2-W299A、pART2-W299G、pART2-KsdD1、pART2-KsdD2、pART2-KsdD3、pART2-KsdD4。通过全细胞转化和HPLC分析方法,使用过表达工程菌株对5种甾体化合物（醋酸可的松、可的松、雄烯二酮、甲睾酮、睾酮）进行全细胞转化分析。结果表明,由色氨酸突变为丙氨酸和甘氨酸的pART2-W299A、pART2-W299G工程菌株转化效率高于pART2-WT、pART2-KsdD3工程菌株和对照菌株;而 pART2-KsdD1、pART2-KsdD2、pART2-KsdD4工程菌株在底物转化中表现出了选择偏好性。基于同源重组策略,采用pK18mobsacB质粒构建携带KsdLD3上下游同源臂的自杀质粒,电转化至简单节杆菌,通过筛选验证并未得到期望的敲除菌,可能是蔗糖果聚糖基因（SacB）不能在简单节杆菌中起到反向筛选的作用。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建了携带有Cas9基因、KsdD3 N20的sgRNA、删除pART2质粒sgRNA的敲除载体,电转化简单节杆菌,亦未得到敲除菌株。经过分析,对敲除载体进行了改良及敲除方案的调整,得到4个优化重组敲除质粒（pAS481、pAS482、pAS491、pAS492）,但其敲除体系的可行性正在进一步验证。
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摘要ABSTRACT1 前言 1.1 甾体化合物概述 1.1.1 甾体化合物结构 1.1.2 甾体化合物在医药行业的应用 1.1.3 甾体化合物的生产 1.2 微生物对甾体C1,2位脱氢反应的研究进展 1.2.1 甾体化合物C1,2位脱氢反应的机理 1.2.2 具备C1,2位脱氢能力的菌种 1.3 简单节杆菌的概述及研究进展 1.3.1 简单节杆菌遗传背景的简介 1.3.2 简单节杆菌C1,2位脱氢研究概述 1.3.3 简单节杆菌C1,2位脱氢酶（KsdD）及其高效表达 1.4 KsdD的基因敲除体系研究 1.4.1 非依赖自身同源重组的基因敲除体系 1.4.2 依赖自身同源重组的基因敲除系统 1.4.3 CRISPR-Cas9编辑技术的敲除系统 1.5 本课题的立题背景及意义 1.6 本课题研究内容2 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 菌株与质粒 2.1.2 主要试剂 2.1.3 主要实验仪器 2.1.4 培养基 2.1.5 相关溶液 2.2 实验方法 2.2.1 简单节杆菌菌体培养 2.2.2 简单节杆菌中EGFP异源表达工程菌的构建 2.2.3 简单节杆菌工程菌株的构建 2.2.4 基因敲除载体的构建 2.3 分析方法 2.3.1 甾体化合物的测定方法3 结果与讨论 3.1 简单节杆菌中脱氢酶的过表达研究 3.1.1 绿色荧光蛋白异源表达工程菌的构建 3.1.2 简单节杆菌KsdD3过表达工程菌的构建 3.1.3 工程菌A.simplex/pART2-KsdD3（WT/W299A/W299G）甾体化合物的转化水平分析 3.1.4 简单节杆菌KsdD1/KsdD2/KsdD4过表达工程菌的构建 3.1.5 工程菌A.simplex/pART2-KsdD1（KsdD2/KsdD4）甾体化合物的转化水平分析 3.2 简单节杆菌KsdD3基因敲除的初步探索 3.2.1 简单节杆菌pK18mobsacB-KsdD3自杀载体的构建 3.2.2 简单节杆菌KsdD3基因一次重组菌株的筛选和验证 3.2.3 简单节杆菌KsdD3整合片段的构建及菌株筛选验证 3.2.4 简单节杆菌KsdD3基因的CRISPR-Cas9敲除载体构建 3.2.5 简单节杆菌KsdD3基因的CRISPR-Cas9敲除菌株的筛选 3.2.6 简单节杆菌的CRISPR-Cas9敲除载体构建的优化4 结论 4.1 全文总结 4.2 论文创新点 4.3 论文不足之处5 展望6 参考文献7 攻读硕士学位期间发表论文情况8 致谢
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 侯亚利
导师: 毛淑红
关键词: 简单节杆菌,脱氢酶,甾酮脱氢酶,过表达,转化效率,基因敲除
来源: 天津科技大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 天津科技大学
基金: 国家自然科学基金
分类号: Q78
DOI: 10.27359/d.cnki.gtqgu.2019.000029
总页数: 65
文件大小: 4916K
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标签：简单节杆菌论文; 脱氢酶论文; 甾酮脱氢酶论文; 过表达论文; 转化效率论文; 基因敲除论文;
