牛云飞[1]2004年在《表皮干细胞的体表分布及其分离、培养和鉴定》文中进行了进一步梳理一、研究背景人体皮肤的自我更新主要依靠表皮基底层内存在的表皮干细胞分裂、增殖、分化来完成。皮肤中表皮干细胞数量较少,但其具有强大的增殖能力,在皮肤更新、伤口愈合、肿瘤形成以及维持皮肤内环境的稳定等方面发挥着重要作用。临床工作中发现:严重烧伤、创伤所致的皮肤损伤,不同部位皮肤创面的愈合能力不完全相同,且随着年龄增大,创面的愈合能力逐渐降低,如深Ⅱ°烧伤创面,小儿的愈合能力明显强于老年人,创面上皮化的速度较老年人快,产生这种现象的原因涉及多个方面,其中表皮干细胞数量、位置及增殖分化潜能的差异可能是其重要原因之一。研究发现:皮肤基底层表皮干细胞数量随着年龄增大而逐渐减少,新生儿及少儿皮肤基底层表皮干细胞数量明显多于成年人。人体不同部位皮肤表皮干细胞分布是否也存在差异,目前研究尚不清楚,这一问题的研究对于充分认识皮肤发育、分化、修复机制有重要意义。大面积烧、创伤所致皮肤损伤的治疗,最主要的问题是尽快封闭创面,由于自体皮来源有限,组织工程化皮肤的研究一直是当前研究的热点,目前尚无特别有效的皮肤替代物应用于临床。已经研制出的活性人工皮肤多是以可降解性材料为支架,接种成纤维细胞或表皮细胞构建而成,存在细胞代谢活性不稳定,接种的细胞易衰老、凋亡等问题,影响了其广泛应用。若能分离富集出大量表皮干细胞并加以诱导、调控,可为构建组织工程化皮肤提供大量增殖能力较强的种子细胞。表皮干细胞有着广泛的应用前景,研究其生长分化规律及调控机制,对于创面愈合机制、皮肤组织工程、肿瘤发生及基因治疗的研究具有重大促进作用。二、研究目的1.研究人体不同部位皮肤表皮干细胞的分布差异,为烧伤病人手术植皮及体外分离培养表皮干细胞时选择供皮区提供依据;2.研究表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定方法,观察离体状态下表皮干细胞的生长特性,为表皮干细胞的分离培养及组织工程化皮肤的研究提供细胞学基础。 - 2 -
左海亮[2]2009年在《原代自体表皮细胞移植治疗烧伤的实验研究》文中认为目的:1.为了寻求最佳的分离条件,设计不同胰蛋白酶浓度、不同消化时间分离大鼠表皮细胞。2.在进行大鼠表皮细胞的最佳分离条件的基础上,探讨皮肤面积与表皮细胞数量的关联性。并测定表皮细胞的面积。3.制作大鼠Ⅲ度烧伤模型,在前面工作的基础上,设定不同的移植密度治疗大鼠烧伤创面,并观察创面愈合情况。探讨原代自体表皮细胞移植治疗烧伤的可行性,适宜的移植密度。方法:1.最佳分离条件的测定采用3个不同消化酶浓度和3个不同的消化时间,设为9组。免疫细胞染色鉴定,台盼蓝进行活细胞计数。通过MTT法间接测定活力细胞的数量,通过正交分析判定最佳的消化酶浓度和消化时间,即最佳分离条件。2.在最佳分离条件下分别消化不同面积的大鼠皮肤,分为5组,统计学分析皮肤面积与表皮细胞数量之间的关联性。在24孔板里培养一定数量的表皮细胞,用显微测微尺测定细胞面积。3.建立大鼠烧伤模型,分为治疗组(A、B、C)和对照组(D)。治疗组采用不同细胞移植密度治疗,A组:6.0×10~4/cm~2;B组:1.2×10~5/cm~2;C组:2.4×10~5c/m~2。术后观察各组大鼠的创面的愈合情况,观察并记录各组大鼠创面瘢痕愈合数量和收缩比例等。结果:1、消化得到的细胞经免疫染色证实了分离出的细胞为表皮细胞。未贴壁时细胞呈圆球型,贴壁后呈多角形,培养后呈铺路石样特征,为表皮细胞典型特征。各组台盼蓝染色活细胞计数;MTT法测定活力细胞数量,两个计数结果均经统计学正交分析分析证实:最佳的消化酶浓度和时间是0.25%胰蛋白酶,16小时,即最佳分离条件。2、不同面积大鼠皮肤经最佳分离条件消化后分离得到的表皮细胞,经统计学分析显示,皮肤面积与表皮细胞成线性相关,并得到线性方程。表皮细胞接种到24孔板后,用显微测微尺测量细胞参数,得到表皮细胞面积6540±450um~2。3、移植后A组死亡一只,B组和C组均因感染导致移植失败各一只。A组瘢痕愈合数9例;B组瘢痕愈合数1例;C组瘢痕愈合0例;D组均为瘢痕愈合15例。在创面收缩比例上D组达84.5%,A、B、C组分别为34.3%、20.1%、18.9%。经统计学分析瘢痕愈合:BC组间差异无统计学意义,其余各组间差异均有意义;收缩比例:BC组间差异无统计学意义,其余各组间差异均有意义。结论:1.胰蛋白酶-EDTA消化法可以成功分离表皮细胞,经鉴定为表皮细胞,并经培养证实形态和功能良好。正交分析结果提示:在冷消化法中最佳的消化酶浓度和消化时间是0.25%胰蛋白酶0.04%EDTA(1:1),16小时。冷消化法真皮刮除法最佳的分离条件是以上的消化酶浓度和时间。2.实验证实皮肤面积和表皮细胞数存在关联性,两者呈正相关。通过统计学分析得到线性回归方程y(细胞数×10~5)=6.445x+0.17。3.大鼠烧伤模型的制作是成功的;原代自体表皮细胞移植治疗烧伤是可行的;治疗的可行移植密度是1.2×10~5/cm~2;皮肤面积和治疗面积的对应关系:1cm~2皮肤可以治疗5.5cm~2的切痂区域。
顾华[3]2004年在《人工皮肤种子细胞体外分离、培养及鉴定的实验研究》文中提出目的：探索实验条件下人角质形成细胞及成纤维细胞的体外培养技术，明确培养的角质形成细胞中是否存在表皮干细胞，确定表皮干细胞在皮肤组织中的定位。方法：利用细胞工程方法进行组织分离、原代培养及传代培养等，观察细胞形态；(1)通过免疫组化方法，利用角蛋白单克隆抗体对培养的角质形成细胞进行鉴定，并利用表皮干细胞的相对特异标识分子—CK19对其进行检测分析：(2)利用波形丝蛋白抗体对培养的成纤维细胞进行鉴定；(3)通过免疫组化方法，利用CK19作为特异标识分子，观察人表皮干细胞在不同解剖结构皮肤组织的定位。结果：1、表皮自真皮较完整分离，电镜及免疫组化证实培养细胞为角质形成细胞，免疫组化结果显示：CK反应阳性，部分细胞CK19阳性，表明有表皮干细胞存在。2、利用组织块培养方法，通过倒置显微镜观察及免疫组化染色进行细胞鉴定并证实得到较纯的成纤维细胞。3、免疫组化染色发现CK19阳性细胞位于无毛区皮肤组织的基底层，位于有毛区皮肤组织的毛囊外毛根鞘。结论：体外分离、培养角质形成细胞及成纤维细胞成功，且分离得到的角质形成细胞中有表皮干细胞存在；表皮干细胞在无毛区皮肤组织中位于表皮基底层，在有毛区皮肤组织中位于毛囊外毛根鞘。为人工皮肤的成功构建奠定了基础。
詹日兴[4]2012年在《一氧化氮在烧伤后表皮干细胞离巢迁移中作用的实验研究》文中研究说明烧伤是以皮肤损伤为始发因素的特殊类型创伤，其主要问题是创面问题，如何尽早封闭、修复创面是烧伤治疗的根本任务。创面修复是现代医学研究的重要领域，表皮干细胞(Epidermal Stem Cell,ESC)是皮肤创面自行或生理性愈合的最重要物质基础~[1]。表皮干细胞通过其表达的整合素(integrin)等与皮肤组织细胞外基质(ESC)如胶原、层粘蛋白等结合，而固定于基底层或毛囊外鞘隆突等特定微环境或称为壁龛(niche)的巢穴中，并发现这是维持其干细胞特性的必要条件。现有研究表明，残存、健在的皮肤表皮干细胞在创面的生理性愈合中起着重要作用。残存的表皮干细胞通过脱粘附、离巢迁移、增殖，并向表皮终末细胞分化，形成表皮角质细胞，向创面爬行，进而覆盖创面，最终封闭修复创面。但对于引起表皮干细胞脱粘附、离巢迁移、增殖、分化的因素及其机制目前仍不清楚。研究表明，一氧化氮(Nitric Oxide, NO)是一种作用众多小分子生物活性介质，参与了多种病理及生理过程。并有研究发现， NO在创面愈合过程中的炎症反应、肉芽组织增生及创面重塑中均起着重要作用。它既具有收缩创面、扩张血管、参与炎症反应、抗感染能力，以及促进胶原合成、血管新生、成纤维细胞增殖、增强创面抗张强度(wound breaking strength)等。有文献报道，烧伤早期创面局部有较高浓度的NO，其产生时间与烧伤后ESC离巢迁移时间相重迭~[2]。有研究发现，在小鼠二度烧伤模型中外源性NO可显着促进烧伤创面的愈合；在气道上皮细胞的体外创伤模型中发现，低浓度NO可促进上皮细胞的迁移与创面修复。我们前期实验表明：NO能够促进HaCat细胞的迁移~[3]，其部分作用机制为：一方面，通过增加细胞内cGMP的浓度，使RhoGTPase活性增强，表达增高，细胞骨架出现相应的改变，增强了细胞迁移的动力；另一方面，通过降低β1-整合素的表达，抑制细胞的粘附能力，减少迁移的阻力。因而我们推测，NO可能在ESC脱粘附、离巢迁移过程中起着重要作用。目的探讨烧伤后外源性一氧化氮(NO)对表皮干细胞在创面修复中离巢迁移中的作用，为进一步完善创面修复的基础理论和临床应用指导打下基础。方法1、一氧化氮对体外培养人表皮干细胞粘附、迁移及增殖功能的影响(1)人表皮干细胞分离培养与鉴定：参照Bickenbach~[4]等的Ⅳ型胶原快速黏附法并进行改良，分离纯化培养人ESC。操作如下：取术毕弃用包皮消毒后加入中性蛋白酶Ⅱ于4℃过夜；次日分离表皮、真皮，将表皮剪碎并以2.5g/L胰蛋白酶于37℃消化10min；终止消化后过滤、离心、收集细胞并计数。以K-SFM培养液调整细胞浓度为(1~2)×10~6个细胞/25cm~2，接种于100μg/mL Ⅳ型胶原包被过夜的培养瓶中,常规培养10min，吸弃未贴壁细胞，PBS轻洗2次，更换新的K-SFM培养液常规培养，次日换液，此后每3天换液1次。采用倒置相差显微镜观察细胞生长及形态变化情况。60%~70%细胞融合时，采用2.5g/L胰蛋白酶-0.1g/L乙二胺四乙酸消化2min且按1:2传代。取第2代分离培养细胞完成West Blotting、细胞免疫荧光染色法检测分离培养细胞中β1整合素和ck19蛋白的表达；流式细胞仪检测分离培养细胞a_6~(bri)CD71~(dim)阳性率。(2)划痕实验检测NO对ESC体外迁移功能的影响：将取第2代分离培养细胞制成单细胞悬液1.5×10~5个/mL，接种于Ⅳ型胶原包被过夜的24孔板，每孔接种1mL，常规培养24h，采用含终浓度为4μg/mL丝裂霉素的K-SFM培养液培养2h~[5]。参照Castilho~[6]的方法进行细胞迁移功能检测：用10μL枪头垂直于培养板孔底划痕，PBS清洗2次，分别加入含终浓度为0(对照)、1、10、100、500μmol/L SNAP溶液的K-SFM培养液，置入培养箱中于划痕后12、24h观察拍照，各浓度设定3个复孔。采用ImageJ图像分析软件(美国卫生研究所)计算细胞迁移率=(原划痕宽度－各时相点划痕宽度)÷原划痕宽度×100%。(3) Transwell实验检测NO对ESC趋化能力的影响：在Transwell板(24孔，孔径为8μm)~[7]下室加入含上述浓度SNAP溶液的K-SFM培养液(600μL/孔)，各浓度3个复孔；将取第2代分离培养细胞制成单细胞悬液(浓度为4×10~5个/mL)接种于Transwell上室，每孔接种100μL。常规培养24h，PBS清洗2次，4℃下甲醇固定20min，1g/L结晶紫染色15min，PBS冲洗多次，倒置显微镜下转膜、拍照、每个复孔选取5个视野计数下室细胞，并进行统计分析。(4)黏附实验检测NO对ESC黏附功能的影响：参照文献~[8]方法进行如下操作。采用含终浓度为0(对照)、10、100、500μmol/L SNAP溶液的K-SFM培养液调整细胞悬液浓度为5×10~5个/mL；于37℃采用3g/L BSA封闭Ⅳ型胶原包被过夜的96孔板2h，PBS清洗3次。将细胞悬液接种于96孔板，每孔200μL，各浓度设6个复孔。常规培养1h，PBS清洗3次；加入含体积分数10%CCK-8的K-SFM培养基(100μL/孔)，常规培养4h，酶标仪测定波长450nm处的吸光度值(代表黏附细胞数)。细胞黏附抑制率=(0μmol/L SNAP作用细胞的吸光度值－各浓度SNAP作用细胞的吸光度值)÷0μmol/L SNAP作用细胞的吸光度值×100%，进行统计分析。(5) NO对ESC增殖功能的影响：参照Fujisaki~[9]方法进行如下操作：将取第2代分离培养细胞制成单细胞悬液以3×103/孔接种于Ⅳ型胶原包被过夜的96孔板，培养3d后分别加入含终浓度为0(对照)、10、100、500μmol/L SNAP的K-SFM培养液，各浓度设6个复孔，常规培养；于SNAP作用0(即刻)、12、24、48、72h更换含体积分数10%CCK-8的K-SFM培养基(100μL/孔)，常规培养4h；酶标仪测定波长450nm处的吸光度值(代表孔内细胞数)。2、一氧化氮影响烧伤后在体表皮干细胞迁移的实验研究(1)小鼠浅二度烫伤模型的制备：实验动物健康7周龄15-18g成年C57bl/6小鼠24只，烫伤仪器采用恒温恒压烫伤仪，烫伤时间均为3s，烫伤温度为0℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃(各温度下3只实验动物)，致伤压力为烫伤棒自重0.5kg，烫头面积2cm2。致伤部位：小鼠两后腿中间部背部。烫伤后24h取创面组织行病理组织学观察。根据病理组织学观察结果筛选浅二度的创面致伤温度。(2) BrdU在体标记小鼠表皮干细胞：新生第3天C57bl/6小鼠消毒后腹腔注射BrdU50mg/kg体重，一天两次，连续注射3天；母乳继续饲养；分别于注射BrdU后1天、2周、3周、4周、5周、6周、7周取小鼠两后腿中间部背部皮肤并进行石蜡包埋；免疫荧光组织化学和免疫组织化学检测BrdU在表皮中的代谢及分布变化。(3)一氧化氮影响烧伤后表皮干细胞迁移的实验研究：新生第3天C57bl/6小鼠腹腔注射BrdU后7周(方法同前)；分组腹腔注射：L-精氨酸、L-NMMA、等体积生理盐水及甘氨酸(每组五只小鼠)；进行浅二度烫伤(方法同前)后单笼饲养48h取材并进行石蜡包埋；免疫组织化学检测BrdU在再表皮中阳性数；BrdU在再表皮中阳性数代表表皮干细胞的迁移能力，进行统计分析。结果1、使用中性蛋白酶和胰酶两步消化结合Ⅳ型胶原快速粘附法获得的表皮干细胞形态均一，核浆比大，表现出早期幼稚细胞的形态特征，细胞呈典型大克隆的“铺路石”样生长；2、ESCs鉴定实验中，蛋白质印迹法显示分离的细胞均能表达CK19和整合素β1蛋白条带；细胞免疫荧光化学体外培养的表皮干细胞表面标记物K19、β1-integrin呈强阳性表达；流式细胞仪技术检测表皮干细胞表达a_6~(bri)CD71~(dim)百分率为56.52%；3、体外创伤划痕实验中随着SNAP浓度的升高(0~100μmol/L)，划痕后12、24h细胞迁移率均逐渐增加。划痕后24h，100μmol/L SNAP作用细胞的迁移率显着高于0μmol/L SNAP作用细胞的迁移率(F=27.90，P<0.01)；500μmol/L SNAP作用细胞的迁移率显着低于0μmol/L SNAP(F=65.43，P<0.01)。表明100μmol/L的SNAP处理ESC24小时是促进细胞迁移的较佳作用浓度和时间。4、Transwell实验发现不同SNAP浓度作用下对ESC的趋化作用中，100μmol/L的SNAP处理组与对照组相比转膜细胞数显着增多(P<0.05)。5、粘附实验表明，在(10-1000)μmol/L SNAP作用24小时对ESC具有线性脱粘附作用，且100μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L SNAP对ESC的脱粘附作用具有显着性差异(P<0.05)。6、增殖实验发现，在(1-100)μmol/L SNAP作用在不同时相点对ESC均有促增殖作用，且100μmol/L SNAP对ESC的增殖作用最为显着性(P<0.05)。7、通过超衡温烫伤仪控制烫伤温度为65℃和时间为3s可建立成年C57bl/6小鼠浅二度烫伤模型；8、BrdU滞留实验中组化结果发现，注射BrdU1天时皮肤中所有细胞BrdU均呈不同程度的阳性表达；随着时间推移，BrdU在皮肤细胞核中的表达逐渐减弱、减少；6周以后阳性细胞主要分布于毛囊隆凸部；9、在体ESC迁移实验中发现，再生表皮中BrdU阳性细胞数L-精氨酸组及L-NMMA组与生理盐水组均有显着性差异，L-精氨酸组较L-NMMA组显着增多。结论：通过本研究，我们发现：1、外源性NO对体外培养人ESC具有脱黏附、促增殖作用；适宜浓度的外源性NO对体外培养人ESC的迁移功能有促进作用；2、通过在体BrdU滞留法发现，烧伤后外源性NO可能通过促进ESC脱粘附、离巢迁移、促增殖等而促进创面愈合。
杨学义[5]2004年在《表皮干细胞建系及重建角膜缘干细胞缺损眼表研究》文中研究表明自Bikenbach（1981）首次标记小鼠皮肤干细胞以来的二十余年间，科学家们对表皮干细胞进行了大量研究，但至今没有建立起表皮干细胞系的报道，从而制约了表皮干细胞研究的深入进行。开展分离纯化表皮干细胞建系及生物学特性研究，为表皮干细胞应于医学临床的组织工程及人类重大疾病的细胞治疗打下技术基础。该项研究不仅具有重要的理论意义，而且具有重要的临床应用价值，为无数正受烧伤、刀伤、各种溃烂煎熬及因患有皮肤癌及顽固性皮肤病而感到绝望的病人带来新为生活的希望。寻找可替代角膜缘干细胞的理想种子细胞构建组织工程化上皮，是治疗因疾病及各种理化因素导致双眼角膜缘干细胞缺损（limbal stem cell deficiency，LSCD）而致盲的病人的首要选择。表皮和角膜均来自外胚层，表皮干细胞（epidermal stem cells，ESCs）和角膜缘干细胞（limbal stem cells，LSCs）有相似的生物学特性。虽在胚胎发育过程中二者方向不同，但并不是不可逆的。本研究在总结、比较ESCs和LSCs生物学特性的基础上，借鉴成体干细胞可塑性的最新研究成果，提出以ESCs替代LSCs重建LSCD眼表的设想。进行了关中奶山羊表皮干细胞分离纯化、鉴定及体外诱导分化实验；以人羊膜为载体负载ESCs构建组织工程化角膜上皮，并进行了LSCD模型羊自体和同种异体移植。1 山羊ESCs的分离纯化取大小约0.5×0.5cm2山羊耳皮肤，切成0.2×0.2cm2大小的小块，按表皮面朝上贴于玻璃平皿（φ=5.5cm）中，每皿3～4块，进行组织块培养，每2d换液。经3～4d后，从组织块边缘长出上皮样细胞贴附生长，7～12d后，上皮样细胞铺路石样生长，在上皮样细胞层上有小圆形细胞聚集呈集落生长，约4.8d（n=11）后,这些集落直径达50μm～100μm，平均每组织块可得到原代克隆12.8个（n=11）。在解剖镜下挑取这些克隆，用0.25% Trypsin+0.02% EDTA进行适当处理，用玻璃细管将这些细胞吸入铺有明胶的3.5cm塑料皿中，用无血清培养基培养（已申报国家专利：200410025938.5），共传25代。经细胞形态学和动力学分析，单个干细胞培养9～12d可形成面积为0.8～1.5mm2 的全克隆，每个全克隆约有1500～2000个细胞。该类细胞直径约8～11um，分裂周期约28～30h，原代克隆形成率为58.9%。2 山羊ESCs鉴定免疫组化染色检测0~9代ESCs ，Oct-4、p63、K19、β1-integrin、α6-integrin、CD71、PCNA的表达特征。结果表明原代ESCs高表达 Oct-4，中度表达CD71、PCNA、K19，不表达β1-integrin、p63。Oct-4的表达随传代次数增加而下降，且需有滋养层细胞共培养维持；ESCs在明胶底物上单层生长时高表达p63、K19、β1-integrin、-
陶克[6]2005年在《人胎儿皮脂腺细胞和汗腺细胞的体外分离培养和人胎儿表皮干细胞向毛囊、皮脂腺和汗腺诱导分化的初步研究》文中指出[研究背景] 烧伤后引起的局部或全身损害均与皮肤屏障的丧失有关,尽早封闭创面并最大可能地恢复功能与外观是烧伤治疗的主要目标。目前在烧伤的临床治疗中所广泛采用的自体断层皮片移植法虽然成功救治了众多患者,但也面临着严重烧伤时自体皮源不足、增加创面面积、移植后皮肤挛缩及缺乏皮肤附件等难题。皮肤组织工程技术为烧伤创面的修复提供了新的方法。目前研制开发的组织工程皮肤多以培养的角质形成细胞膜片或自体刃厚皮片为表皮层,以人工合成的真皮接种成纤维细胞或异体/异种脱细胞真皮为真皮层,其中部分已商品化并取得了较好的临床效果。但现有各类组织工程皮肤也面临着共同的难题,即均缺乏毛囊、皮脂腺和汗腺等皮肤附件,无法构建“功能性组织工程皮肤”。皮肤及其附件(毛发、汗腺、皮脂腺等)均是由外胚层衍生而来,表皮干细胞作为皮肤组织特异性干细胞,具有无限增殖潜能及多向分化潜能,被认为是毛囊、皮脂腺和汗腺等皮肤附属器发生、修复、改建的关键性源泉,理论上可以分化为皮肤的各种细胞成份和结构。因此,建立皮脂腺细胞、汗腺细胞体外培养模型,详尽地了解皮脂腺细胞、汗腺细胞体外培养生长特点,并通过模拟特定的微环境,调控表皮干细胞分化方向,在皮肤修复的同时能够诱导毛囊、皮脂腺和汗腺的发生,无疑是构建包含毛囊、皮脂腺和汗腺等皮肤附件的“功能性组织工程皮肤”的重要途径。研究表明脐带血
屈雷[7]2004年在《组织工程化角膜上皮与内皮的构建和移植》文中研究表明角膜作为眼球光学系统的重要组成部分，其上皮的完整性和透明度是良好视力的基本要求，临床上常见各种原因所引起的角膜缘干细胞及角膜上皮的损伤和缺失，使患者视力下降或致盲。上世纪九十年代以来，随着细胞培养技术和组织工程技术的兴起，组织工程化人工角膜、角膜上皮、内皮：基质细胞植片的构建与移植研究也正在兴起。为探索从根本上解决角膜疾患的新方法与途径，本研究用人流产儿、家兔和山羊角膜体外分离角膜缘干细胞、角膜基质细胞和内皮细胞；采用无饲养层细胞培养体系和冻存的角膜缘干细胞构建家兔和山羊角膜上皮组织，并自体移植到角膜缘干细胞完全缺失的动物模型角膜表面，恢复病损角膜上皮；同时，探索来源于自体的表皮干细胞替代角膜缘干细胞用于角膜上皮重建的可行性；利用体外快速扩增获得角膜内皮细胞，以羊膜和角膜基质为载体构建组织工程化角膜内皮组织，为组织工程角膜内皮层移植实验奠定基础。实验研究主要取得以下六个方面成果和进展： 1．流产儿角膜细胞经体外分离培养可甩于组织工程化角膜组织构建，并且认为移植时同种异体免疫反应更弱。但是，就人胎儿角膜细胞体外分离培养的条件和各类细胞的生长特性未见系统报道，资料相对缺乏。为了充分利用好胎儿角膜组织这一资源，本研究对30例人流产胎儿角膜上皮细胞，基质细胞和内皮细胞进行体外分离培养。发现胎儿角膜上皮细胞采用dispase消化法和完整的全层角膜组织贴壁法可获得纯化的角膜上皮细胞，传至10代冷冻保存；胎儿角膜基质细胞无论采用消化法还是组织块法都可得到纯化培养的目的，传至20代冷冻保存；而角膜内皮细胞体外纯化培养比较困难。 2．山羊或家兔角膜缘上皮组织用1．2 IU／ml dispase酶和0．25％胰蛋白酶4℃冷消化，认为1．2 IU／ml dispase酶是分离角膜缘干细胞较理想的消化酶，其作用时间以冷消化14h～16h为宜。比较DMEM／F12，RPMll640和EpilifeTM叁种培养液培养原代山羊和家兔角膜缘干细胞用DMEM／F12培养液可提高细胞的传代次数。山羊角膜缘干细胞传至20代，家兔角膜缘干细胞己传至14代，于一196℃液态氮冷冻保存，获得稳定增殖的角膜缘干细胞。将角膜缘干细胞分别保存在4℃、一20℃、一80℃冰箱和一196℃液态氮中，分别在12～48 h，l～7 d、1～6周和1～6月解冻，经体外培养扩增，细胞在形态上和增殖能力上与冻存前基本相似。可以满足不同的实验条件下，对角膜缘干细胞的运输、保存和增殖的要求，为组织工程技术构建角膜上皮提供丰富的细胞来源。 3．为了制作角膜缘干细胞完全缺失，用于移植角膜缘干细胞的动物模型，将角膜缘上皮板层切除，中央角膜用1 N NaOH擦除上皮层的方法，成功制作实验性角膜缘干
闫迎军[8]2007年在《应用脂肪干细胞与脱细胞真皮构建组织工程皮肤》文中指出皮肤软组织缺损是整形外科和烧伤外科经常遇到的问题，临床上通常采用自体皮肤或异体皮肤移植进行修复。然而，这一治疗过程存在着缺乏充足的自体皮源，供区继发性损伤大，异体皮肤移植引发免疫排斥反应等等众多缺点。近二十年来，随着细胞生物学和分子生物学的迅猛发展、高新技术的应用以及学科间的相互渗透，创伤修复与组织再生从基础研究到临床应用都获得了迅猛发展。各国学者相继探索了许多种组织工程皮肤的构建方法，从根本上为临床解决皮肤缺损的修复提供了崭新的思路。但是，目前很多组织工程皮肤产品仍不成熟，存在着皮肤耐磨性差、自体种子细胞来源缺乏、异体种子细胞诱发免疫排斥反应、培养耗时长、治疗费用昂贵等缺点。因此，有必要探索一种具有良好临床应用前景的组织工程皮肤构建方法。研究目的探索脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)向表皮细胞定向分化的诱导培养方法，分析ADSCs诱导分化的表皮细胞是否具有干细胞的特性。观察人脱细胞真皮的超微结构特点，分析其做为组织工程皮肤支架材料的合理性。探索应用ADSCs源类表皮干细胞复合脱细胞真皮体外构建组织工程皮肤的方法，观察该组织工程皮肤的组织结构特点与超微结构特点。应用构建的组织工程皮肤修复实验动物皮肤缺损，观察治疗效果与成活后的组织结构特点和超微结构特点。研究方法1、采用贴壁分离方法从脂肪抽吸液中分离出脂肪干细胞，培养扩增。在表皮细胞诱导培养基中诱导ADSCs向表皮细胞定向分化。分别检测诱导前、后细胞的表面抗原表型，细胞周期与CK5、CK10、CK19表达情况，并绘制细胞增殖曲线。在成骨细胞诱导培养基中进一步诱导ADSCs源表皮细胞向成骨细胞定向分化，对诱导后的细胞进行ALP染色和Yon Kossa染色检查。2、扫描电镜下观察人脱细胞真皮的超微结构。应用人ADSCs源类表皮干细胞复合人脱细胞真皮体外构建组织工程皮肤，对其进行组织学观察与超微结构观察。3、应用组织工程皮肤和脱细胞真皮修复裸鼠皮肤缺损，术后观察皮肤缺损修复情况，对移植成活的组织工程皮肤进行基底膜糖原(PAS)染色检查和组织学观察，对DAPI标记的人ADSCs源类表皮干细胞进行示踪观察。4、应用实验猪自体ADSCs源类表皮干细胞复合猪脱细胞真皮构建组织工程皮肤，修复其背部正中线左侧皮肤缺损。以猪脱细胞真皮修复右侧皮肤缺损做为对照。术后观察皮肤缺损修复情况，对移植成活的组织工程皮肤进行组织学观察和超微结构观察。研究结果1、ADSCs向表皮细胞诱导分化，72小时后部分细胞由梭形变成圆形或椭圆形，7天后大部分细胞呈圆形或椭圆形，排列成铺路石状。诱导培养前、后的细胞增殖曲线均呈S型，但是诱导培养前ADSCs 7d时增殖达到顶峰，诱导培养后的细胞6d时增殖达到顶峰。诱导培养前87.42％的细胞处于G_0和G_1期，诱导培养后96.38％的细胞处于G_0和G_1期。诱导培养后，少数细胞CK5免疫荧光染色呈阳性，部分细胞CK19免疫荧光染色呈阳性，CK19在mRNA水平的表达呈阳性。诱导培养后传代10次的细胞CK10、CK19在mRNA水平的表达呈阳性。诱导培养后传代10次的细胞形态无明显改变，X-Gal染色呈阴性，细胞染色体数目2n=46，核型为女性正常核型(46，xx)。裸鼠皮下注射诱导培养后传代10次的细胞，2个月后无瘤体形成。ADSCs源表皮细胞向成骨细胞诱导分化后，ALP染色和Yon Kossa染色显示为阳性。2、人脱细胞真皮基底膜面与真皮面均为多孔结构，基底膜孔隙直径为31.03～82.76um(51.72±15.64um)，真皮孔隙直径为115.38～192.31um(143.27±23.95um)。对体外培养3天的组织工程皮肤进行扫描电镜观察，可见大量人ADSCs源类表皮干细胞粘附于脱细胞真皮基底膜上，细胞呈圆形、椭圆形，直径为75.62～107.86um(87.11±11.46um)，显着小于脱细胞真皮基底膜孔隙直径。组织学观察发现，体外培养2周的组织工程皮肤与正常皮肤的组织结构特征相似，仅缺少角质层。3、术后1个月，实验组裸鼠背部移植的组织工程皮肤成活良好，但表皮较薄弱，色泽与周围正常皮肤相似。PAS染色可见表皮层和真皮层之间有呈深红染色、呈波浪状连续存在的基底膜。术后2个月，光镜下可见组织工程皮肤的结构与正常皮肤相似，真皮内无表皮样囊肿。应用DAPI标记人ADSCs源类表皮干细胞进行示踪观察，术后1个月可见表皮深层有2～3层较强荧光显色的细胞，术后2个月可见表皮深层有5～6层较弱荧光显色的细胞。对照组裸鼠术后1个月时背部创面未愈合，仍覆盖薄层痂皮，创缘轻度收缩。4、术后1个月，实验猪背部正中线左侧移植的组织王程皮肤成活良好，表皮角化明显，色素缺失；正中线右侧移植的猪脱细胞真皮形成肉芽组织，局部结痂，创缘收缩明显。组织学观察可见，实验侧组织工程皮肤的结构与正常皮肤相似，真皮内无表皮样囊肿，表皮层与真皮层之间可见呈犬牙交错样相接的表皮突和真皮乳头；对照侧猪脱细胞真皮则转化为肉芽组织，其表面无表皮层覆盖。超微结构观察可见，在成活的组织工程皮肤基底膜与基底层细胞之间有半桥粒连接形成；表皮细胞的胞质中有角蛋白丝，成束状排列：相邻的表皮细胞之间形成桥粒连接。研究结论1、ADSCs具有易于获取，能够在体外大规模培养和扩增，性质稳定，多潜能分化，培养扩增不需要大量的血清等优点，是组织工程研究中良好的种子细胞来源。2、ADSCs在体外诱导培养体系中能够向表皮细胞分化，部分细胞具备了表皮干细胞的一些特征，我们将其暂时命名为“ADSCs源类表皮干细胞”。ADSCs源类表皮干细胞在实验动物体内能够复层生长，形成表皮样结构。3、本研究中，诱导ADSCs向表皮细胞分化的体外诱导培养体系具有安全性。4、脱细胞真皮基底膜具有良好的细胞粘附性。基底膜与真皮均为多孔结构，基底膜和真皮的孔隙直径接近于支架材料促进表皮组织和真皮组织再生的最佳孔隙直径。5、脱细胞真皮的结构特点有利于移植部位周围的成纤维细胞和血管内皮细胞移行进入并增殖，体外构建组织工程皮肤时不需在真皮层内复合成纤维细胞。这既降低了构建组织工程皮肤的复杂性和经济成本，同时还提高了安全性。6、本研究中构建的组织工程皮肤具有生物活性，移植于实验动物体内后能够转化为组织结构合理的皮肤组织，未观察到表皮样囊肿形成。7、本研究中构建的组织工程皮肤性状稳定，可以有效地修复实验动物皮肤缺损，具有良好的临床应用前景。
陈刚泉[9]2006年在《应用表皮干细胞及脱细胞真皮构建组织工程皮肤及其移植实验研究》文中提出创(烧)伤等多种原因造成的皮肤大面积缺损可导致严重的机体功能障碍甚至危及生命。目前修复皮肤缺损的方法主要是用自体皮肤移植。但在治疗大面积深度烧伤等皮肤缺损时，由于缺乏供皮区，皮源不足，往往给创面覆盖造成困难。为反复供皮的需要，目前临床应用的植皮术，诸如邮票状植皮术、网状皮肤植皮术、异体皮嵌植自体小皮片混合移植术、微粒皮移植术以及自体表皮细胞培养移植术等方法，均不同程度地缺乏真皮成分，因而不能满意解决愈后外观和功能问题。然而如果增加供皮的厚度，势必会影响供皮区的正常愈合。为解决这一难题，目前用组织工程学方法研制了许多皮肤代用品，但临床效果尚不稳定。因此，构建一种功能理想的永久性皮肤替代品具有很重要的临床意义和应用价值。 目的 利用组织工程学原理，我们期望通过体外分离扩增人表皮干细胞作为种子细胞，自行制备异种(猪)脱细胞真皮支架作为基质材料，探讨体外构建组织工程皮肤的可行性。并将该组织工程皮肤移植于动物创面，探讨该组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的可行性。 方法 通过酶消化法，分离小儿包皮的表皮与真皮层，表皮制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10~6／ml，接种于包被好Ⅳ型胶原的培养皿中快速粘附10～15min(37℃)，弃去未粘附细胞，保留快速粘附细胞继续培养。以高糖低钙的DMEM培养基，补充100g／L的干细胞培养专用胎牛血清(FBS)，0.05mmol／L CaCl_2，10ng／ml表皮生长因子，10~(-6)mol／L氢化可的松进行培养。对传代后拟接种的种子细胞进行流式细胞仪α_6、CD_(71)表型鉴定，角蛋白19免疫细胞化学染色鉴定以及形态学观察等。我们以NaCl-SDS-胰蛋白酶法制备脱细胞真皮，并进行组织学观察。将分离培养传代的表皮干细胞接种于铺好Ⅳ
马英智[10]2009年在《利用人表皮干细胞和人真皮成纤维细胞体外构建组织工程复合皮肤的研究》文中研究表明组织工程皮肤是组织工程研究中最成熟的技术之一,但目前应用于临床的组织工程皮肤的种子细胞均来自异体,难以成为永久性皮肤替代物。因此,本实验以人表皮干细胞(hKSCs)和人真皮成纤维细胞(hDFs)作为种子细胞,利用鼠尾胶原制备真皮支架材料,体外构建组织工程复合皮肤,为永久性皮肤替代物的研究进行有益的探索。应用联合酶消化、快速贴壁筛选和无血清培养法,自成人包皮中快速分离hKSCs;同时应用联合酶消化、差速贴壁法分离hDFs,通过显微镜观察、免疫细胞化学、间接免疫荧光、流式细胞术、RT-PCR及Western blot等方法,从形态学、分子标志物、细胞周期等方面对获得的hKSCs和hDFs的生物学特性进行检测。用醋酸溶解法制备鼠尾胶原凝胶,经真空冻干法制备真皮支架材料,利用显微镜观察、免疫荧光等方法对真皮支架材料的形态结构、稳定性、生物相容性等理化特性进行检测。分别将15代以内的hDFs及分离自同一成人包皮组织的hKSCs和hDFs接种于支架材料上,进行共培养及气液面培养,通过HE染色、免疫组织化学、双重免疫荧光及扫描电镜等对构建的组织工程皮肤进行观察。结果显示:1.获得的hKSCs、hDFs具有较高的纯度、较好的活力和良好的增殖能力,能够进行稳定的传代培养及冻存、复苏,为组织工程提供充足的种子细胞来源;2.制备的真皮支架材料具有多层孔隙结构,各孔隙互相交通,并具有良好的孔隙率、稳定性、生物可降解性、细胞相容性及安全性,能够诱导细胞长入及新生血管形成,是构建组织工程皮肤理想的支架材料;3. hDFs均匀分布于真皮支架中,不仅保持稳定的增殖能力,而且可能开始分泌细胞外基质成分,发挥着天然真皮中成纤维细胞的功能。hKSCs粘附于含有活的hDFs的真皮支架材料上,伸展良好,经气液面培养形成复层表皮结构,具备表皮层和真皮层。综上所述,我们建立了高效分离、纯化、培养及扩增hKSCs和hDFs的方法,制备了具有合理的空间结构及良好的稳定性、生物可降解性、细胞相容性和安全性的真皮支架材料,成功构建具有表皮层和真皮层的组织工程复合皮肤,为开展无免疫排斥的个性化治疗及永久性皮肤替代物的研究打下坚实的实验基础。
参考文献：
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[4]. 一氧化氮在烧伤后表皮干细胞离巢迁移中作用的实验研究[D]. 詹日兴. 第叁军医大学. 2012
[5]. 表皮干细胞建系及重建角膜缘干细胞缺损眼表研究[D]. 杨学义. 西北农林科技大学. 2004
[6]. 人胎儿皮脂腺细胞和汗腺细胞的体外分离培养和人胎儿表皮干细胞向毛囊、皮脂腺和汗腺诱导分化的初步研究[D]. 陶克. 第四军医大学. 2005
[7]. 组织工程化角膜上皮与内皮的构建和移植[D]. 屈雷. 西北农林科技大学. 2004
[8]. 应用脂肪干细胞与脱细胞真皮构建组织工程皮肤[D]. 闫迎军. 中国协和医科大学. 2007
[9]. 应用表皮干细胞及脱细胞真皮构建组织工程皮肤及其移植实验研究[D]. 陈刚泉. 南昌大学. 2006
[10]. 利用人表皮干细胞和人真皮成纤维细胞体外构建组织工程复合皮肤的研究[D]. 马英智. 吉林大学. 2009