肠道菌群介导乳杆菌T3L抑制高脂膳食小鼠骨量减少的研究

论文摘要

乳酸杆菌作为安全无毒的益生菌制剂,被广泛用于食品和健康领域。研究发现,长期食用发酵乳制品可以降低肠道炎性反应,有益于肠道健康,增加骨密度,防止骨流失。其作用效果可以通过益生菌本身及其代谢产物发挥作用。然而,益生菌与肠道免疫系统以及与骨骼健康之间的特定关系还有待进一步研究。前期研究发现从西藏牧民传统牦牛发酵乳中分离出的棒状乳杆菌Tibet L.coryniformis（T3L）具有益生功能,并且可以抑制高脂膳食引起的小鼠骨量减少,我们推测T3L可能是通过肠道菌群而实现其骨保护作用。因此,本研究将T3L处理的小鼠的粪便中定植菌群移植至高脂膳食小鼠体内,菌粪移植共进行10周。探讨移植后小鼠肠道菌群的改变及其对相关的肠道免疫、破骨分化,骨性能的改善作用。结果表明,T3L菌粪移植干预有效降低体重,体脂率,血清甘油三酯和总胆固醇水平。同时,从小鼠股骨力学、形态学进行分析,T3L菌粪移植保护高脂膳食小鼠免于骨质流失和骨吸收。对股骨组织中骨相关表达因子进行qPCR分析,显示经T3L菌粪移植干预RANKL/OPG比值显著降低,破骨细胞分化特征酶CTSK明显下降。粪便中肠道细菌的高通量测序结果显示:T3L诱导小鼠整体肠道微生物群结构发生显著变化,改善了高脂膳食诱导的结构失衡并增强了产短链脂肪酸菌属的丰度。对结肠中组蛋白乙酰化相关表达因子进行qPCR分析,发现T3L菌粪移植干预后短链脂肪酸受体Ffar2表达量上调,组蛋白去乙酰化酶相关基因HDAC2,HDAC7的表达显著降低,组蛋白乙酰化酶相关基因P300,CREBBP和PCAF表达明显上调,表明组氨酸乙酰转移酶受短链脂肪酸的影响。肠道中IL-10、TGF-β、Foxp3结肠免疫组化和基因表达结果表明益生菌可能影响免疫系统。脾T淋巴细胞可通过分泌IL-10、TGF-β起到对破骨细胞分化的抑制作用。综上表明,T3L菌粪移植可改变肠道菌群的多样性和宿主的免疫状态,从而减少了高脂膳食诱导的高脂膳食小鼠肥胖和骨质流失。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第1章绪论

1.1 课题背景及研究的目的和意义

1.2 肠道菌群与骨质疏松症的关系

1.2.1 肠道菌群

1.2.2 益生菌与骨质疏松症的关系

1.3 短链脂肪酸与免疫调节的关系

1.3.1 短链脂肪酸

1.3.2 组蛋白修饰

1.3.3 组蛋白去乙酰化酶

1.3.4 组蛋白乙酰化酶

1.4 淋巴T细胞对破骨细胞分化的调控作用

1.4.1 破骨细胞

1.4.2 淋巴T细胞与破骨细胞的关系

1.5 国内外文献简析

1.6 主要研究内容及研究方案

1.6.1 菌粪移植对高脂膳食小鼠肠道菌群的影响

1.6.2 菌粪移植对高脂膳食小鼠骨性能的影响

1.6.3 全身免疫系统对破骨细胞调控机制的研究

1.6.4 研究方案

第2章材料和方法

2.1 实验材料及仪器

2.1.1 实验材料

2.1.2 主要试剂与仪器

2.2 灌胃材料与饲料

2.2.1 菌株准备

2.2.2 菌粪准备

2.2.3 动物饲料

2.3 肥胖模型小鼠的建立和分组

2.4 小鼠肥胖相关指标的测定

2.4.1 体重与体脂率及脏器指数的测定

2.4.2 血清甘油三酯及总胆固醇含量的测定

2.4.3 肝组织HE染色

2.5 菌粪移植对高脂膳食小鼠骨性能的影响

2.5.1 小鼠血清ALP及 TRAP含量的测定

2.5.2 小鼠血清RANKL含量的测定

2.5.3 骨组织参数扫描分析

2.5.4 骨钙磷含量的测定

2.5.5 股骨生物力学参数测定

2.5.6 骨组织形态学染色

2.6 荧光定量检测组织中相关基因的表达

2.6.1 提取组织总RNA

2.6.2 测定RNA浓度及纯度

2.6.3 合成cDNA

2.6.4 引物设计

2.6.5 扩增反应

2.7 小鼠肠道菌群的高通量测序分析

2.8 结肠免疫组化

2.9 脾T淋巴细胞对小鼠破骨细胞的影响

2.9.1 分离小鼠脾T淋巴细胞

2.9.2 巨噬细胞增殖培养

2.9.3 脾T淋巴细胞与巨噬细胞共培养

2.9.4 抗酒石酸酸性磷酸酶染色

2.9.5 细胞上清液中IL-10和TGF-β含量的测定

2.10 粪便中短链脂肪酸含量检测

2.11 数据统计与分析

第3章菌粪移植对高脂膳食小鼠肠道菌群的影响

3.1 引言

3.2 菌粪移植对高脂膳食小鼠肥胖相关指标的影响

3.2.1 菌粪移植对高脂膳食小鼠体重的影响

3.2.2 菌粪移植对高脂膳食小鼠Lee’s指数的影响

3.2.3 菌粪移植对高脂膳食小鼠体脂率的影响

3.2.4 菌粪移植对高脂膳食小鼠脏器指数的影响

3.2.5 菌粪移植对高脂膳食小鼠血清甘油三酯和总胆固醇含量的影响

3.2.6 菌粪移植对高脂膳食小鼠肝脏脂肪性病变的影响

3.3 小鼠肠道菌群分析

3.3.1 肠道菌群OTU分析与物种相对丰度累积曲线

3.3.2 肠道菌群Alpha多样性分析

3.3.3 肠道菌群Beta多样性分析

3.3.4 肠道菌群物种丰度与多样性分析

3.3.5 肠道内产短链脂肪酸菌属的变化

3.4 粪便中短链脂肪含量的测定

3.5 结肠中短链脂肪酸受体相关基因的表达

3.6 本章小结

第4章菌粪移植对高脂膳食小鼠骨性能的影响

4.1 引言

4.2 菌粪移植对高脂膳食小鼠血清ALP及 TRAP含量的影响

4.3 菌粪移植对高脂膳食小鼠血清RANKL含量的影响

4.4 菌粪移植对高脂膳食小鼠骨组织参数的影响

4.5 菌粪移植对高脂膳食小鼠股骨钙磷含量的影响

4.6 菌粪移植对高脂膳食小鼠股骨生物力学的影响

4.7 菌粪移植对高脂膳食小鼠骨组织形态学的影响

4.7.1 股骨组织HE染色

4.7.2 股骨组织甲苯胺蓝染色

4.7.3 股骨组织Masson三色染色

4.8 菌粪移植对高脂膳食小鼠股骨相关基因表达的影响

4.9 本章小结

第5章全身免疫对破骨细胞调控机制研究

5.1 引言

5.2 菌粪移植对高脂膳食小鼠结肠免疫的影响

5.2.1 结肠免疫组化

5.2.2 全身免疫系统中免疫因子相关基因的表达

5.3 菌粪移植对紧密连接蛋白相关基因表达的影响

5.4 菌粪移植对组蛋白修饰相关基因表达的影响

5.4.1 去乙酰化酶相关基因的表达

5.4.2 乙酰化酶相关基因的表达

5.5 益生菌处理的高脂膳食小鼠脾T淋巴细胞对破骨细胞分化的影响

5.5.1 细胞准备

5.5.2 破骨细胞分化情况观察

5.5.3 细胞上清液中IL-10和TGF-β含量的检测

5.5.4 破骨细胞相关基因的表达

5.6 本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 白钰莹

导师: 宋微

关键词: 高脂膳食,肠道菌群,免疫调节,破骨细胞

来源: 哈尔滨工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 哈尔滨工业大学

分类号: TS201.3

DOI: 10.27061/d.cnki.ghgdu.2019.004129

总页数: 84

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肠道菌群介导乳杆菌T3L抑制高脂膳食小鼠骨量减少的研究

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