羊种布鲁氏菌wzt基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

论文摘要

为建立检测血清中布鲁氏菌抗体的间接ELISA方法,本试验采用PCR技术从羊种布鲁氏菌QY1菌株中扩增得到wzt基因片段,连接到pET-30a载体上,构建质粒pET-30a-wzt,将鉴定正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,经原核表达系统对其进行表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析后,用亲和层析镍柱纯化wzt重组蛋白备用。以wzt重组蛋白为检测抗原,逐步优化条件后建立布鲁氏菌间接ELISA检测方法。结果显示,试验成功构建了pET-30a-wzt原核表达载体,并在BL21（DE3）宿主菌中表达;SDS-PAGE和Western blotting结果表明,重组蛋白约为35 ku,表达形式为上清,条带单一、无杂带,有很好的反应原性和特异性。ELISA优化试验确定了最佳包被浓度为15μg/mL,血清最佳稀释度为1∶80,酶标抗体的最佳稀释度为1∶5 000;通过检测24份阴性样品确定临界值,当样品D450 nm值≥0.30为阳性,样品D450 nm值<0.30时为阴性;特异性试验表明,该方法不与小肠耶尔森菌、大肠杆菌发生交叉反应;批内及批间变异系数均<10%;用该方法对120份血清样本进行检测,并与虎红凝集试验进行相符性验证,符合率为96%。本试验建立的间接ELISA方法为布鲁氏菌病的检测提供了可靠的技术手段。

论文目录

1 材料与方法

1.1 菌株、血清及其他试剂

1.2 wzt基因的原核表达

1.2.1 引物设计与合成

1.2.2 wzt基因的扩增

1.2.3 重组表达质粒的构建

1.2.4 重组蛋白的表达与纯化

1.3 Western blotting鉴定

1.4 间接ELISA检测方法的建立

1.4.1 包被抗原最佳稀释度的确定

1.4.2 血清最佳稀释度的确定

1.4.3 酶标抗体最佳稀释度

1.4.4 ELISA判断标准的确定

1.4.5 敏感性试验

1.4.6 特异性试验

1.4.7 重复性试验

1.4.8 符合率试验

2 结果

2.1 目的基因PCR扩增及重组克隆质粒的鉴定

2.2 重组蛋白的表达与纯化

2.3 表达产物的Western blotting鉴定

2.4 间接ELISA方法的建立

2.4.1 包被抗原最佳稀释度的确定

2.4.2 血清最佳稀释度的确定

2.4.3 酶标抗体最佳稀释度的确定

2.4.4 间接ELISA判断标准的确定

2.4.5 敏感性试验

2.4.6 特异性试验结果

2.4.7 重复性试验

2.5 临床样本的检测结果

3 讨论

4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 赵鹭,葛志毅,刘永生,李学瑞,曹小安

关键词: 布鲁氏菌,基因,原核表达,间接

来源: 中国畜牧兽医 2019年12期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室

基金: “十三五”国家重点研发计划项目(2018YFD0500905)

分类号: S852.614

DOI: 10.16431/j.cnki.1671-7236.2019.12.030

页码: 3707-3714

总页数: 8

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羊种布鲁氏菌wzt基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

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