苏红曾四海李志黄可君(广州血液中心广东广州510095)
【摘要】目的通过分析离心法和虹吸法制备冷沉淀(同批次制备)的质量,选择更加优化的冷沉淀制备方法。方法取同一制备日期的冷沉淀原料血浆,分别采用冷藏融化离心法、水浴融化离心法(两种温度条件)、水浴融化虹吸法制备冷沉淀,分别按照机械抽样法抽样样品,检测冷沉淀中FⅧ含量并进行统计分析。结果4℃冷藏融化离心法的FⅧ含量为65.17±27.39(IU/袋),合格率为40%(8/20);4℃水浴融化离心法的FⅧ含量为89.67±39.96(IU/袋),合格率为60%(12/20);2℃水浴融化离心法的FⅧ含量为84.33±30.57(IU/袋),合格率为:55%(11/20);4℃水浴融化虹吸法FⅧ含量为108.85±42.41(IU/袋),合格率为83.3%(25/30)。经单因素方差分析,4℃水浴融化虹吸法的质量水平明显优于其他三种方法。结论水浴融化虹吸法制备冷沉淀操作简便、快捷,FⅧ合格率高,明显优于冷藏融化离心法和水浴融化离心法,值得推广应用。
【关键词】冷沉淀凝血因子Ⅷ【中图分类号】R197.38【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2013)36-0061-02冷沉淀是采用特定的方法将保存期内的新鲜冰冻血浆(freshfrozenplasma,FFP)在1℃~6℃融化后,分离出大部分的血浆,并将剩余的冷不溶解物质在1小时内速冻成固态的成分血[1]。根据冷沉淀在低温条件下不融化的特性,可制定不同的制备方法,目前血站常用的制备方法主要有:离心法,原料血浆放置于4±2℃冰箱或在4±2℃恒温水浴箱中融化,待基本融化后,在4±2℃重离心,分离出上层血浆,剩下少量血浆和沉淀物,制成冷沉淀;虹吸法,在4±2℃恒温循环解冻箱中放入原料血浆,转移空袋置于箱体外低位,松开止血夹,启动循环水流和震荡摇摆,血浆融化过程中,随时被虹吸至转移空袋中,当融化至剩下约少量血浆与沉淀物时,闭合导管,阻断虹吸,定量,制成冷沉淀[2]。
本文旨在利用同一批原料血浆使用不同的制备方法制备冷沉淀,通过分析凝血因子Ⅷ的质量水平,选择更高效的冷沉淀制备方法。
1.材料与方法1.1冷沉淀原料血浆本中心体检采血科采集的400ml四联袋全血,要求在采血后6小时之内制备并冻结成固态且各项检测合格的新鲜冰冻血浆。
1.2仪器设备美国SORVALLRC-12BP大容量冷冻离心机,费森尤斯CompomatG4血液分离机,低温操作台,-20℃低温冰箱,4℃贮血冰箱,恒温循环解冻箱,MBF21平板速冻机1.3制备冷沉淀的方法1.3.1冷藏融化离心法(A组)将40份原料血浆置于4℃贮血冰箱中过夜(10-l2h),待其融化到剩下少量冰碴时取出,在已预温的离心机中离心(4℃、4000g、8min),分离出上层血浆,下层剩下约30ml带小量冰碴或絮状物的糊状液体,定量,热合封口后将冷沉淀迅速置于平板速冻机内冻结成固态。
1.3.2水浴融化离心法(B组、C组)将血浆轻放入已预热的恒温循环解冻箱中(温度分别设定为2℃及4℃),血浆按照错位排列的方式放入,每个恒温循环解冻箱中放入30袋,启动循环水流和震荡摇摆,盖上箱盖。待其融化到剩下少量冰碴时取出并尽快装杯并配平,在已预降温的离心机中离心(4℃、4000g、8min),分离出上层血浆,下层剩下约30ml带小量冰碴或絮状物的糊状液体,定量,热合封口后将冷沉淀迅速置于平板速冻机内冻结成固态。血浆融化需时100-110min(2℃水温)或75-80min(4℃水温)。
1.3.3水浴融化虹吸法(D组、D1组、D2组)将血浆轻放入已预热的恒温循环解冻箱中(温度设定为4℃),血浆按照错位排列的方式放入,每个恒温循环解冻箱中放入30袋,转移空袋置于箱体外低位,松开止血夹,启动循环水流和震荡摇摆,盖上箱盖。血浆融化过程中,随时被虹吸至转移空袋中。当融化至剩下约30ml血浆与沉淀物时,闭合导管,阻断虹吸,定量,热合封口后将冷沉淀迅速置于平板速冻机内冻结成固态。血浆融化需时50-60min。
1.3.4质量标准由200mlFFP制备的冷沉淀:FⅧ含量≥80IU/袋[1]。
1.4抽样采用机械抽样法,在成品中取得A组、B组、C组(各20份)和D组、D1组、D2组(各10份)样品。
1.5凝血因子Ⅷ检测采用BECKMANCOULTER血凝仪(ACL7000)检测。
1.6统计学处理采用SPSS18.0对数据进行单因素方差分析及t检验处理。
2.结果2.14种方法制备冷沉淀的FⅧ含量见表1。
表14种方法制备冷沉淀FⅧ含量(IU/袋)
2.1.1将相关数据录入SPSS18.0中,并进行单因素方差分析(显著性水平为0.05)。方差齐性检验:ρ=0.265(>0.05),各组实验值通过方差齐性检验,即可以认为各实验组的数据来源于相同方差的不同总体,满足方差分析的前提。
2.1.2单因素方差分析:F=6.126(>ρ=0.01),可以认为不同实验组结果间存在显著差异。
2.1.3采用LSD检验(最少显著性差异法),用T检验完成各组间的配对比较:结果表明,在均值差的显著性水平为0.05时,D组的数据与A组、B组、C组有显著性差异,ρ值分别为0.000、0.016、0.006,均小于0.05,D组的实验结果明显优于其他三组。
2.2不同批次虹吸法制备冷沉淀的FⅧ含量见表2表2不同批次虹吸法制备冷沉淀FⅧ含量(IU/袋)
三组数据间不存在显著性差异,证明虹吸法制备冷沉淀的工艺是稳定、可靠的,制备结果是可重现的。
3.讨论成分输血已广泛应用于临床,冷沉淀是临床常用的成分血,其中含有丰富的的凝血因子,主要含有5种成分:丰富的FⅧ、丰富的Fg、血管性血友病因子、因子Ⅻ、纤维结合蛋白(纤维粘连蛋白)。输注后具有显著的止血和促进创伤组织修复的功能。目前冷沉淀在临床的应用越来越广泛,用于治疗儿童和成人血友病甲,补充纤维蛋白原,治疗血管性血友病,治疗因子缺乏症和补充纤维结合蛋白等[3]。还常用于促进创伤烧伤愈合、防止伤口感染和阻止DIC扩展,以及用于恶性肿瘤手术和腹腔镜等手术,以减少出血、促进愈合和防止黏连[4,5]。因此优质高效的冷沉淀,对保证其临床疗效、充分地发挥其重要功能。
FFP内含有全部的凝血因子,包括不稳定FⅧ。FⅧ在体外的半衰期较短,多为8-12h,其活性易丧失[6]。FFP融化后,FⅧ活性随着时间的延长而有明显的降低,其活性衰减了41.17%[7]。我们的检测结果表明,水浴融化虹吸法制备的冷沉淀FⅧ的含量和合格率均高于冷藏融化离心法和水浴融化离心法,这是因为冷藏融化离心法(需在4℃冰箱中经过14-18h缓慢融化)和水浴融化离心法制作冷沉淀,均需再经离心分离,耗时均比水浴融化虹吸法长,FⅧ衰减较多,且离心时不可避免的温度上升,均导致FⅧ一定程度的丧失[7]。而水浴融化虹吸法制备的冷沉淀只需约1h即可完成整个制备过程,需时较少,从而获得较高的FⅧ含量和合格率,且具有操作简便、制备时间短、制备温度恒定等优点,制备的冷沉淀质量明显优于冷藏融化离心法和水浴融化离心法。
参考文献[1]陈小伍,于新发,田兆嵩.输血治疗学.北京:科学出版社,2012:188[2]中华人民共和国卫生部.血站技术操作规程(2012版).2012-01[3]江朝富,崔徐江,汪传喜.现代成分输血与临床.天津:天津科学技术出版社,2003:254[4]陈小伍,于新发,田兆嵩.输血治疗学.北京:科学出版社,2012:194-196[5]杨孝顺,安梅,阮光萍,等.冷沉淀在临床外科手术中的应用.中国输血杂志,2005,18(3):255-257[6]杨江存,李芒会,于青,等.新鲜冰冻血浆融化后不同放置时间凝血因子的变化.中国输血杂志,2005,18(3):2l1-2l2[7]李静旗,张丽,宫本兰,等.冷链对新鲜冰冻血浆FW活性的影响.临床输血检验,2003,5(3):192-193