程大庆陈宗祐周儒(上海华山医院200032)
【摘要】大肠癌转移是一个复杂的过程,也是患者死亡的主要原因,预测肿瘤转移的风险对于判断预后及指导综合治疗具有重要意义,近年来,大量基础及临床研究提示C4.4A基因的筛查可作为大肠癌转移潜能的早期生物学指标。
【关键词】C4.4A大肠癌转移
【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）02-0390-03
大肠癌包括结肠癌和直肠癌，是常见恶性肿瘤之一。近年的流行病学资料显示，大肠癌已上升为全球第三位最常见的癌症[1]，2008年全世界有120万人患大肠癌，这其中超过60万人最终死于大肠癌。转移是恶性肿瘤的基本特性之一[2]，它是一个多步骤、多阶段的复杂过程，每一阶段都受着许多基因的调控。对转移相关基因进行克隆和功能分析，不仅有利于阐述大肠癌转移的分子机理，而且还有望为临床诊治、药物筛选和预后判断寻找新的靶点。近年来研究发现C4.4A基因是潜在的大肠癌转移的早期诊断的生物学指标，现综述如下。
1结构及生物学特性
C4.4蛋白最早是在zoler[4]及工作组利用探索转移和非转移小鼠胰腺肿瘤亚克隆细胞株的抗原性中检测出来的，因其被特异性的单克隆抗体C4.4特异性识别，故名C4.4A。人类与小鼠同源的基因定位于19q13.1-q13.2，该片段是肿瘤相关基因突变相当活跃部位，C4.4A的表达在非转化组织中严格限制。
在人类C4.4mRNA仅出现于胎盘皮肤，食道及外周血白细胞，而不存在于其他部位[4]。在肿瘤组织中，已发现的有恶性黑色素瘤，大肠癌，乳腺癌，肺癌，尿道上皮癌[5-9]，但其生理作用大多未明，C4.4A在人类慢性损伤基底层上皮细胞表达升高，佛波唐诱导的小鼠皮肤增生的基底膜上多层角质细胞亦可见其表达的明显诱导增加，其表达上调参与创伤愈合及角化上皮及尿道上皮的前迁徙[7,8]。
C4.4A的cDNA序列已被克隆，全长1637b，编码352个氨基酸的糖基磷酯酰肌醇锚链分子，其分子量在94-98KD之间不等，基因组结构分析显示其与尿激酶受体（uPAR）结构相似，相似度达46.9%[4],因此他的作用一开始被定义为转移相关蛋白
c4.4a结构包含2个ly-6/Upar/α-神经毒素模序，该模序含有较多的半胱氨酸残段，依靠二硫键形成3个锌指结构，该结构为ly-6家族特有，其他成员仅含有1个模序，uPAR含有3个[10,11]。C4.4A翻译后多次糖基化，其N端约有5-6个糖基，主要位于或接近于第二个ly-6/uPAR/α-神经毒素模序的O端有大约15个糖基，C4.4a有个疏水端的COOH末端与GPI-锚链蛋白，其蛋白分析其有两个较保守信号域：一个85氨基酸的TGF受体和一个100氨基酸的两个串联半胱氨酸环域，后一种识别蛋白作为ly-6家族成员的一部分表达C4.4A经常表达与肿瘤细胞，并在肿瘤转移时表达上调，而在非转化的上皮细胞中很少表达，但当上皮细胞参与组织修复时，表达会再次升高[12],说明一种严格的表达机制调控着他的转录表达，通过两种同系但不同转移潜能的细胞的研究，发现虽然c4.4A存在于两种细胞基因中，但只有高度转移潜能的细胞有mRNA的表达和转录，寡TATA盒，GC密集核心启动子的激活不足以启动转录，其转录还需要临近的反应元件（-71-88BP），并可以被更远的反应元件（-89-133同前）加强表达，SP3的绑定可促进c4.4A的转录，潜在的SP1绑定位点却是无效的，c4.4A的表达需要C/EBPβ绑定于一个TRE/CCAAT复合元件（-71-88BP）c4.4A的表达可被JunD或C-Ju等共转染所加强，这种加强可使的c4.4A表达于原先表达阴性的细胞中，C/EBPβ的上调在肿瘤细胞及创伤修复中提供c4.4A表达的一个足够的条件[13]。
2C4.4与肿瘤转移
C4.4A与大肠癌转移的机制
C4.4一开始被认为是uPAR的受体，所以人们认为其与uPAR有相似的功能，而uPA-uPAR作用是激活基质蛋白酶，从而进一步促进肿瘤转移。pet[2]等人认为C4.4可以与uPA作用，例如通过激活基质降解酶，但这种说法有争议，并且被Hansen[9]等人否认。与uPAR相似，C4.4A是被GPI锚定的，但C4.4A缺失了一些其他uPAR分子通常都有的特性，如它不能被六碳糖溶解。与其他uPAR不同，C4.4A的交联对C4.4A阳性的肿瘤细胞的增殖作用影响很小，C4.4A也不像其他uPAR一样连接于磷酸激酶[2]，C4.4A与金属基质蛋白酶有关，一些带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶（ADAMTS）,整合素样金属蛋白酶ADAM或MMP的活性不仅与降解细胞外基质有关，并参与细胞信号传导和转移，从而与肿瘤进展有关，通过研究这些基质蛋白酶的降解基质可以研究抑制这些基质蛋白酶在抑制肿瘤进展中的作用，Esselens等人通过SILAS（稳定蛋白酶标）技术确定C4.4A为ADAM10和17的降解基质，ADAM10和17通过降解C4.4A促进肿瘤的转移[14]。
免疫组化染色显示C4.4A的染色很特别，肿瘤表面及中间的部分没有或很少染色，这些表达大多在细胞质，但在肿瘤侵犯的前端却有高表达，值得注意的是只有那些面向新鲜基质组织的肿瘤细胞高表达C4.4A蛋白，转移淋巴结及肺转移灶也是如此。C4.4a这种表达方式的具体机制不明，C4.4A转染阳性的非转移肿瘤细胞可以穿透基底膜，这种过程可被C4.4完全阻止[2]，Paret认为其连接LN5借此支持肿瘤细胞的迁徙，LN5连与胶原蛋白2，因此提出C4.4A可能参与肿瘤细胞与胶原蛋白基质的锚链[15]，LN是基底膜上粘附糖蛋白，15种异构体已经被分离出来，每种异构体表达有其组织特异性[16]细胞粘附于LNs在维持正常的组织形态中起重要作用，LNs促进组织细胞的转移与粘附，免疫组化显示C4.4A在覆层扁平上皮基底膜上表达。这种表达类型与LNs重叠并在基底上皮上互补表达，转染C4.4ACDNA的BSp73AS肿瘤细胞促进LN1及LN5的绑定，这种绑定促进细胞的扩散，板状伪足形成及迁徙。C4.4A同样与乳胶凝集素3有关，其余乳胶凝集素3的链接影响其与LN的粘附，但具体机制不明，乳胶凝集素与α3β1竞争LN1等结合位点，这种竞争被C4.4A很好的抵消。角质细胞的迁移产生LN5作为临时基质[17]，LN5的分泌可作为恶性肿瘤侵袭转移的标志[18]。
3C4.4A与大肠癌诊断
目前大多数肿瘤转移还不能早期诊断，虽然一些免疫相关分子在少数肿瘤复发转移的诊断起到较好作用，但在大肠癌至今未发现有意义的早期肿瘤转移标志物，近端大肠癌较远端大肠癌术后分期更差、预后也更差[20-22]。这除了与肿瘤生物学特性有关外，很大程度与肿瘤早期诊断有关。
3.1C4.4与大肠癌的诊断
C4.4A的严格表达于非转化细胞以及在某些肿瘤中表达上调提示其潜在的肿瘤诊断标志物可能。Paret早先就提出C4.4是一个候选的标志物用于大肠癌的诊断[8]，他发现C4.4A表达于80%以上的原发性结肠癌细胞及肝转移灶，而发炎的大肠粘膜细胞、肿瘤旁边细胞及正常肝脏细胞不表达，与Epcam及CO-029相比，这两种分子是较为可靠地诊断大肠癌的分子[26-28]，虽敏感性差于后两者，但特异性好于Epcam及CO-029，而且表达的密度及频率在原发灶和肝转移灶、肿瘤分级及分期无明显的统计学差异，这点与KenKonishi的研究不符，因此认为其诱导表达于肿瘤形成及保持稳定阶段，但不排除肿瘤转移时出现表达上调，造成观点不符合的原因可能为1.免疫组化为一半定量实验2.4.4A以低聚物的形式出现在高表达时，这种低聚状态不能被抗体识别3.抗体可能不能识别高糖基化的C4.4A分子，同时Paret等人还发现肿瘤细胞分泌C4.4A分子，部分肿瘤细胞释放方式是囊泡样释放，这种释放方式在许多正常组织中出现，但加速囊泡样脱落更多在肿瘤细胞中存在[29]，绝大多数释放的分子是不含GPI锚基的，片段长度与rrC4.4A的降解片段相似，有趣的是，可溶性的uPAR分子及其片段存在于多种实体肿瘤中，而uPAR作为肿瘤进展的标志物，在乳腺癌中，在体的囊泡样释放与离体肿瘤囊泡样释放相似，并且这种释放方式可能为肿瘤标志物分子在血液中转运提供载体[30]，这进一步提示其潜在的诊断价值。
3.2C4.4A与大肠癌转移的早期诊断
进年来的研究表明，C4.4A与大肠癌转移有关，在高表达和低表达C4.4AmRNA的患者中，存在明显的五年总生存率差异，高表达C4.4AmRNA的患者5年总生存期明显少于低表达者，KenKonishi等人用定量RT-PCR技术检测大肠癌组织中C4.4A蛋白表达，免疫组化显示非常强的C4.4A抗原膜染色，C4.4A在转移前端和淋巴结及肺转移病灶的前端膜染色的强度与浸润的深度及血管侵犯有关，并是一个重要的独立预后因素（包括5年生存率及无病生存率）。在Ⅱ期及Ⅲ期结肠癌中C4.4A的表达与无肝转移生存率、无肺转移生存率及血行转移生存率的降低有关[19]。
C4,4A最早于高度转移特性的鼠胰腺癌细胞株中发现，这种蛋白不在局部生长的鼠肿瘤中表达[24-25]，该发现提示其与肿瘤转移特性相关，KenKonishi等人在研究结肠癌患者尿中是否有蛋白升高，他们发现C4.4A分子的某个片段在病人排泄物中升高，因为尿是体内分子降解的产物，该发现提示患者血液中可能存在游离状态下的C4.4A分子，通过相关临床数据研究他们发现C4.4AmRNA表达与大肠癌低的5年生存率相关，这些提示C4.4A分子高表达提示大肠癌早期转移的可能，与此同时，其他的研究显示其在非小细胞癌提示预后不良，并在食管癌中C4.4A在肿瘤侵犯前端表达，在结肠癌这种现象同样存在，这种前端表达的特性为C4.4A所特有，并作为一种提示不良预后的生物学标志，这些研究提示C4.4A为潜在大肠癌转移早期诊断标志物。
讨论
肿瘤标志物是大肠癌诊断的重要措施，临床肿瘤标志物特异性较差，现有研究认为C4.4A与大肠癌的转移密切相关，其为大肠癌诊断及治疗提供了一个新思路，C4.4A用于大肠癌诊断有其优点，其诊断大肠癌特异性好，表达率高、稳定表达，并且在离体组织中表达[8]，而且C4.4A分子多以低聚物形似存在、糖基化程度变异很大，这种特性便于利用其制造单克隆抗体以降低血液中C4.4A分子水平从而用于相关治疗等。大肠癌早期发生时其分子诱导表达并保持稳定，当大肠癌患者病情出现变化时，如出现转移情况时，C4.4A表达会再次升高，说明其与大肠癌的病情进展有关，以该分子为靶向基因的治疗的临床是否有效仍未可知，另外现有研究没有涉及大肠癌的癌前病变如大肠腺瘤中是否有表达升高，以及该分子是否与其他转移相关机制如肿瘤微血管密度关系等肿瘤转移热点机制相关仍待进一步研究。
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