黑曲霉生物合成赭曲霉毒素A途径中P450和bZIP基因的鉴定

论文摘要

近些年来发现,黑曲霉产生的赭曲霉毒素A（OTA）对人类的健康具有潜在的威胁。研究发现OTA的合成需要一系列的酶反应,而编码这些酶的基因成簇排列,形成基因簇。通过生物信息学分析,bZIP（Gene ID:4988390）和P450（Gene ID:4988391）基因很可能是黑曲霉OTA生物合成基因簇中的基因,与OTA合成相关。但还未验证其功能,故本研究以产OTA的黑曲霉A14为出发菌株,利用农杆菌介导转化法,构建基因敲除及过表达菌株,验证bZIP和P450基因在黑曲霉侵染和OTA合成中的作用,这将为有效地控制黑曲霉产毒污染及探究OTA代谢途径提供理论基础。本实验运用农杆菌介导侵染黑曲霉的方法成功筛选获得bZIP基因敲除菌株A14AbZIP、P450基因敲除菌株A14ΔP450。利用重测序方法测得A14AbZIP和A14ΔP450菌株中HYG基因插入序列位置为:An15AnigerCBS51388,染色体位置为1,857,026-1,859,864和1,859,284-1,862,245。插入方式均为反向插入,基因拷贝数均为1。通过稳定性验证,A14AbZIP和A14ΔP450菌株均具有良好的遗传稳定性。运用农杆菌介导侵染黑曲霉的方法成功筛选获得bZIP基因过表达菌株A14::bZIP。通过稳定性验证,A14::bZIP菌株具有良好的遗传稳定性。通过与原始菌株黑曲霉A14进行对比,发现A14AbZIP、A14AP450和A14::bZIP菌株,三株改造菌株对黑曲霉的菌落生长速率、菌落形态、分生孢子数目、菌丝干重并未产生明显影响。通过高效液相色谱法研究OTA及其代谢产物生物合成量,发现破坏bZIP基因后在9d培养期间完全没有OTβ,OTα和OTA产生,且过表达该基因OTβ,OTα和OTA的产量均不同程度的增加。该结果证实基因bZIP参与OTA的生物合成途径。破坏P450基因后,推迟并降低OTα和OTA的产生,但大大增加了 OTβ的产生。结果证实基因P450基因参与OTA的生物合成途径,可能催化苯丙氨酸和二氢异香豆素交联。采用qRT-PCR分析,结果表明bZIP基因的缺失导致pks、nrps和p450基因的表达量均不同程度降低,而bZIP基因过表达菌株相较于野生菌株pks、nrps、p450和hal基因表达量均有所升高。证明bZIP基因极有可能为OTA生物合成基因簇中簇内调节因子。

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摘要

ABSTRACT

1 前言

1.1 黑曲霉

1.2 赭曲霉毒素

1.3 OTA生物合成研究进展

1.3.1 OTA生物合成前体和代谢产物

1.3.2 OTA可能的生物合成途径和相关酶

1.3.3 OTA生物合成相关基因和基因簇

1.3.4 OTA生物合成调控机制

1.4 bZIP转录因子的概述

1.4.1 bZIP转录因子的结构

1.4.2 真菌中的bZIP转录因子

1.4.3 bZIP转录因子的调控作用

1.5 细胞色素P450

1.5.1 细胞色素P450的研究概况

1.5.2 细胞色素P450的性质

1.5.3 真菌中的细胞色素P450

1.6 本课题的研究意义、目的及研究内容

1.6.1 本论文的研究意义

1.6.2 主要研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株、质粒和引物

2.1.2 试剂

2.1.3 主要的仪器和设备

2.1.4 培养基和溶液

2.2 实验方法

2.2.1 黑曲霉基因组提取

2.2.2 bZIP基因的扩增及测序

2.2.3 P450基因的扩增及测序

2.2.4 敲除质粒p890的构建

2.2.5 敲除质粒p900的构建

2.2.6 过表达质粒p891的构建

2.2.7 大肠感受态的制备

2.2.8 农杆菌感受态的制备

2.2.9 黑曲霉A14对潮霉素的敏感性实验

2.2.10 敲除质粒p890、p900和过表达质粒p891分别电转化至农杆菌

2.2.11 农杆菌侵染实验

2.2.12 黑曲霉转化子的初筛

2.2.13 黑曲霉转化子的复筛

2.2.14 黑曲霉A14ΔbZIP转化子验证

2.2.15 黑曲霉A14ΔP450转化子验证

2.2.16 黑曲霉A14::bZIP转化子验证

2.2.17 基因敲除、过表达菌株的遗传稳定性试验

2.2.18 黑曲霉A14ΔbZIP和A14ΔP450中HYG插入位点及拷贝数分析

2.2.19 黑曲霉A14、A14ΔbZIP和A14ΔP450生长速率、菌落形态及菌丝干重

2.2.20 黑曲霉A14、A14ΔbZIP和A14ΔP450分生孢子计数

2.2.21 黑曲霉A14、A14ΔbZIP、A14ΔP450 OTA和A14::bZIP产量检测

2.2.22 黑曲霉RNA的提取及qRT-PCR

3 结果与讨论

3.1 黑曲霉基因组的提取

3.2 bZIP和P450基因的扩增及测序

3.3 黑曲霉中bZIP基因和P450基因的敲除及过表达质粒的构建

3.3.1 敲除质粒p890的构建

3.3.2 敲除质粒p900的构建

3.3.3 过表达质粒p891的构建

3.4 黑曲霉中A14对潮霉素的敏感性实验

3.5 黑曲霉中bZIP基因和P450基因的敲除及过表达菌株的构建

3.5.1 敲除质粒p890电转化农杆菌

3.5.2 敲除质粒p900电转化农杆菌

3.5.3 过表达质粒p891电转化农杆菌

3.5.4 农杆菌AGL-bZIP侵染黑曲霉A14的试验

3.5.5 农杆菌AGL-P450侵染黑曲霉A14的试验

3.5.6 农杆菌AGL-p891染黑曲霉A14的试验

3.5.7 基因改造菌株的遗传稳定性试验

3.6 黑曲霉A14ΔbZIP和A14ΔP450中HYG基因拷贝数分析

3.7 黑曲霉A14、ΔbZIP、A14ΔP450表型分析

3.7.1 菌落形态观察与生长速率对比

3.8 黑曲霉A14、A14ΔbZIP、A14ΔP450和A14::bZIP产物分析

3.9 bZIP基因对黑曲霉产OTA簇内基因的调控

4 结论

5 展望

6 参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

8 致谢

9 附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 徐瑞涛

导师: 张健

关键词: 黑曲霉,基因,基因敲除,赭曲霉毒素

来源: 天津科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 天津科技大学

基金: 国家自然科学基金

分类号: Q78

DOI: 10.27359/d.cnki.gtqgu.2019.000063

总页数: 86

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