天津医科大学宝坻临床学院心脏科301800
【摘要】目的通过细胞毒性试验和溶血性试验来筛选符合生物相容性要求的心室辅助装置材料。方法五种受试聚氨酯材料，制成60cm2三份，每份加入生理盐水注射液。取3支试管，每管加入生理盐水注射液作为阴性对照。取3支试管，每管加入蒸馏水作为阳性对照。全部试管置恒温水浴中保温，每只试管中加入稀释兔血，继续保温，吸出管内液体，离心后取上清液，测定其吸光度。上述材料灭菌后制备其浸提液，在含L-929细胞的培养皿的琼脂表面放置滴有材料浸提液的无菌滤纸片，培养箱避光培养后染色，最后在倒置相差显微镜下观测。结果先接枝聚氨酯（APCU），聚碳酸聚氨酯（PCU），聚氨酯（PU）三种材料溶血率为0.3％，1.4％，0％，而先磺化聚氨酯（SPCU）及肝素化聚氨酯（HPU）溶血率为23.6％，12.1％.先接枝聚氨酯及聚碳酸聚氨酯毒性分级为0.6级和0.2级，而先磺化聚氨酯，肝素化聚氨酯及聚氨酯毒性分级为1.5级，1.5级和1.2级。结论先接枝聚氨酯，聚碳酸聚氨酯和聚氨酯三种材料符合医用材料的溶血试验要求，先接枝聚氨酯及聚碳酸聚氨酯符合材料细胞毒性试验要求。
【关键词】聚氨酯浸提液生物相容性溶血试验细胞毒性试验琼脂覆盖法
CytotoxicityandHemolysistestonmodificationmaterialsofventricularassisteddevices
ObjectiveToselectthebiocompatiblerequirementsmaterialsoftheventricularassisteddevicebycytotoxicitytestandhemolysistest.MethodsFivekindofmaterialsofpolyurethanewerepidedinto3groups，eachof60cm2.Eachofmaterialswasaddedsodiumchlorideinjection.Fromthreetest-tubes，eachoftubeswasaddedsodiumchlorideinjectionasnegativecontrol.Fromthreetest-tubes，eachoftubeswasaddeddistilledwateraspositivecontrol.Allthetest-tubeswerelayedinConstanttemperaturewater.Addedtoeachtest-tubewithdilutionofrabbitblood，andcontinuedtoheat，tooktheliquid.Tooktheclearliquidaftercentrifugation，determinatedtheopticaldensity.PreparedfortheextractofthematerialsaftertheSterilization.TheSterilefilterpaperofthematerialextractionwaslayedontheagarsurface，whichhadL-929cells，dyedafterlighttraininginincubator，andobservedbyinvertedphasecontrastmicroscope.ResultsAPCU，PCUandPUhemolyticratewere0.3％，1.4％，0％.ButSPCUandHPCUhemolyticratewere23.6％，12.1％.ThetoxicitygradesofAPCUandPCUwas0.6and0.2.butSPCU，HPUandPUwere1.5，1.5and1.2.ConclusionAPCU，PCUandPUweremeettherequirementsofmedicalmaterialsbyhemolysistest.APCUandPCUweremeettherequirementsofmedicalmaterialsbycytotoxicitytest.
【Keywords】polyurethaneextractliquidBiocompatiblityhemolysistestcytotoxicitytestAgaroverlaytest
【中图分类号】R556.6【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）-08-100-02
近年来，心血管疾病的发病率呈上升趋势，死亡率已高居总人口死亡率第一位。终末期心脏病的发病率的增加已成为心脏疾病中主要的医疗问题。终末期心脏病治疗最有效的方法是心脏移植，但是由于器官来源不足，使得许多心脏病患者丧失治疗机会而失去生命。心室辅助装置（人工心脏）作为药物和外科治疗无效的心力衰竭和心脏移植前的过渡支持，在欧美发达国家已经成为治疗严重心力衰竭患者的一种有效方法，心室辅助装置作为过渡性循环支持系统也成为挽救终末期心脏患者的途径之一。
本试验通过对改性的聚氨酯材料进行细胞毒性及溶血性试验，筛选符合生物相容性要求的材料，力争形成拥有自主知识产权的心室辅助装置材料的制备技术，为心室辅助装置的研究打下基础。
一材料
1受试材料：材料1先磺化聚氨酯（SPCU），材料2先接枝聚氨酯（APCU），材料3聚碳酸聚氨酯（PCU），材料4肝素化聚氨酯（HPU），材料5聚氨酯（PU）。（由天津大学制备并提供）。
2动物和细胞：健康成年家兔一只，购自天津医科大学第二医院。小鼠肺成纤维细胞（L-929细胞），试验采用传代48h---72h生长旺盛的细胞。
3试剂：胎牛血清，琼脂，RPMI1640培养液，苯酚，草酸钾，生理盐水注射液等。
二方法
1细胞毒性试验
1．1溶液配置培养基：RPMI1640培养液10g，NaHCO32.0g，加三蒸水500ml定容，再加入青霉素和链霉素使其浓度为200U/ml，配成2×培养基，使用前加入小牛血清。取500ml用三蒸水稀释一倍成1×培养基。使用前加入小牛血清；消化液：配置0.25%的胰酶溶液，过滤灭菌，4℃保存；活体染色液：配制1%水溶液中性红存储液，称取中性红1.0g置入棕色瓶内，加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS液）100ml，溶解后过滤；琼脂培养基：配置2%琼脂，与2倍培养基1：1比例混合。
1．2试验分组：受试材料样品浸提液组取上述受试材料各180cm2，制成60cm2三份，用紫外线照射正面及反面各30min灭菌，参照美国ASTM标准和浸提液制备方法，在清洁环境下将1mm厚度的五种聚氨酯材料，分别放入3支试管作平行式样，每管加入生理盐水注射液10ml，60℃浸提8h，然后用分析滤纸过滤浸提液，高压蒸汽灭菌（115℃，30min），无菌条件下保存备用。阴性对照材料样品采用经确认过的不产生细胞毒性反应的材料，例如高密度聚乙烯。阳性对照材料样品采用经确认过的可重现细胞毒性反应的材料，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯。
1．3试验方法细胞接种：取对数生长期的L929细胞制成3×105个/ml细胞悬液，取10ml接种于直径90mm的培养皿内，每种材料设置3个平皿，于37℃，5%CO2培养箱培养24h取出。倒掉培养液，将琼脂培养基以适当温度注入原培养皿。试样放置：每片无菌滤纸片上滴加0.1ml的不同材料浸提液，每个培养皿的琼脂表面放置阴性对照、阳性对照各一片及二个试验材料，材料边缘距培养皿边缘15mm。37℃，5%CO2培养箱避光培养24h。染色：将培养皿内的滤纸片全部取出，以PBS配置1%中性红染液，每个平皿加入10ml，染色30min后倒置相差显微镜下观测。
1．4结果评价（1）试验结果为0或1级，反应为合格。（2）试验结果为2级，应结合细胞形态分析，综合评价。（3）试验结果为3-级的，反应为不合格。
2溶血性试验
2.1样品组浸提液的制备：参照美国ASTM标准和浸提液制备方法，在清洁环境下将1mm厚度的五种聚氨酯材料切成60cm2三份，分别放入3支试管作平行式样，每管加入生理盐水注射液10ml，60℃浸提8h，然后用分析滤纸过滤浸提液，高压蒸汽灭菌（115℃，30min），无菌条件下保存备用；阴性对照组：取3支试管，每管加入生理盐水注射液10ml；阳性对照组：取3支试管，每管加入蒸馏水10ml。
2.2制备新鲜的稀释抗凝兔血：健康家兔耳缘静脉采血20ml，加入2%草酸钾溶液1ml，即得新鲜的抗凝兔血。再取新鲜抗凝兔血8ml加入生理盐水注射液10ml稀释，即得新鲜的稀释抗凝兔血。
2.3试验方法：样品组按上述方法制备，阴性对照组加入10mL生理盐水，阳性对照组加入10mL蒸馏水，每组平行操作3管。全部试管置37±1℃恒温水浴中保温30min后，每只试管中加入0.2mL稀释兔血，轻轻摇匀，置37±1℃恒温水浴中继续保温60min。吸出管内液体，离心1500rpm，10min，若上清液尚未清亮则再重复离心一次。取上清液移入比色皿，于分光度计545nm波长处测定吸光度（opticaldensity，OD），并记录结果。
2．4数据处理：分别取样品组和对照组3个试样OD的均值OD。依下式计算样品的溶血率。
溶血率%=×100%
式中：
A——样品OD；
B——阴性对照组OD；
C——阳性对照组OD。
3结果
材料细胞毒性的大小（见表1）用“细胞反应”来评定，包含褪色指数和细胞溶解指数二个参数。
（1）褪色指数评分:0为未发现褪色；1为只在试样下方有褪色；2为褪色区边缘距试样边缘<5.0mm；3为褪色区边缘距试样边缘在5.0～10.0mm；4为褪色区边缘距试样边缘>10.0mm；5为整个培养区褪色。
（2）细胞溶解指数评分:0为未观察到细胞溶解现象；1为细胞溶解小于20%；2为细胞溶解在20%～40%；3为细胞溶解40%～60%；4为细胞溶解在60%～80%；5为细胞溶解大于80%。
细胞反应=褪色指数/细胞溶解指数[1]。
R=Z/L
R细胞反应
Z褪色指数
L细胞溶解指数
溶血试验结果（见表2）判定：若材料的溶血率<5%，则说明材料符合医用材料的溶血试验要求，若溶血率>5%，则预示材料有溶血作用，不符合标准要求。
受试材料细胞毒性试验结果见表1
4讨论
在进行生物学评价试验时，一般是先进行体外试验，后进行动物试验如果体外试验通不过，就不必做动物试验[2]。体外试验包括溶血试验和细胞毒性试验。特别是溶血试验具有很高的灵敏度。另外与血液直接或间接接触的生物材料要求必须评价它的血液相溶性。
国际标准化组织（ISO）将“生物医用材料”定义为：用于和活组织接触以形成功能的无生命材料，包括那些具有生物相容性和生物降解性的材料[3]。生物医用材料必须符合医用级标准，即满足无毒、无热源反应、不致畸、不致癌、不引起过敏反应、具有良好的组织相容性和血液相容性。所以对于一种材料的评价是多方面的，主要包括:（1）植入物对组织有无损害作用（血液相溶性）；（2）生物材料的力学特性和良好的保持功能特性（功能度）；（3）在生理环境中的抗磨损和抗腐蚀能力（指非生物降解材料）以及易于消毒和制造[4]。血液相容性是指材料与血液触时不引起溶血和凝血，反应材料与血液之间的相互适应程度；组织相容性是指材料与活体组织接触时，活体组织不发生炎症、排拒等反应，表现材料与除血液以外的其他组织之间相互容纳的能力。不同的材料根据其临床应用的不同和材料自身的特点，有其特定的生物相容性评价方法，总体上可分为体外试验、动物体内模型试验、临床应用三部分。本实验依据目前国际上公认的生物医用材料评定方法和我国医疗器械生物学评价标准，对改性聚氨酯材料进行临床前期生物安全性评价，因本实验只涉及对材料安全性进行评价，所以试验仅涉及生物医用材料安全性评价的基本评价部分，对于凝血试验、致癌和致畸试验等补充试验未进行检测。
生物相容性包括两大原则：一是生物安全性原则，二是生物功能性原则（或称为机体功能的促进作用）[5，6]。生物材料和医疗器械的生物安全性评价的概念主要是指将预期应用于人体的材料（天然的或人工合成的）或器械在进入临床前先进行模拟体内的体外生物学试验、动物体内植入试验以及综合信息和资料分析等安全性的评估，以对该生物材料或器械最终应用于人体的风险性作出评价。评价的意义即在于预测生物材料或医疗器械在与人体接触使用过程中的潜在危害性，保证生物材料的应用安全性。
材料的血液相容性评价是材料生物学评价的重要组成部分，在众多的血液相容性试验中，溶血试验是国内外各实验室开展比较多的一项试验，是最常用的粗筛试验，也被认为是细胞毒性评价的一个补充试验。我国常使用的标准方法有ASTMF756-00[7]以及GB/T16175-1996[8]中规定的溶血试验可参照方案。
5结论
本研究结果表明，先接枝聚氨酯（APCU）及聚碳酸聚氨酯（PCU）通过了医用生物材料的细胞毒性及溶血性试验检测，已达到生物安全性初级检测、第一阶段试验的要求，具有良好的生物相容性，可作为下一阶段试验的可靠基础。
参考文献：
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