导读:本文包含了马动脉炎病毒论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:病毒,动脉炎,含量,单克隆抗体,条形码,抗体,射线。
马动脉炎病毒论文文献综述
张满丰[1]（2018）在《动脉炎病毒核酸内切酶nsp11的结构与功能研究》一文中研究指出猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratoe syndrome virus,PRRSV)和马动脉炎病毒(Equine arterits virus,EAV)是套氏病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Arteriviridae)的重要成员,这两种病毒每年给畜牧业造成巨大经济损失。特异性识别尿嘧啶核糖核苷酸的核酸内切酶(Nidoviral endonuclease specific for U,NendoU)是套氏病毒进化上最保守的非结构蛋白(non-structuralprotein,nsp)之一,在 PRRSV 和 EAV 中为 nsp11。Nsp11 对于病毒基因组复制和亚基因组的合成是必需的,且涉及多个信号通路,如与分裂素和组蛋白相关的蛋白激酶信号通路、细胞周期及DNA复制相关过程。PRRSVnsp11除了 NendoU活力之外,还具有去泛素化酶(deubiquitinase,DUB)活力,并能通过这两种活力抑制宿主免疫相关因子的正常表达,在病毒免疫逃逸过程中发挥作用。另外,nsp11与其在冠状病毒中的同源蛋白nsp15存在较大差异。目前,关于nsp11还存在很多的问题,如:PRRSV nsp11在抑制宿主免疫系统过程中发挥NendoU活力还是DUB活力,EAV nsp11是否也具有DUB活力以及nsp11与冠状病毒nsp15功能差异的分子机制。为了解决上述问题,本研究采用蛋白质晶体学的方法,从结构出发,来阐明nsp11功能多样的分子基础。本研究首先筛选突变蛋白,解决PRRSV和EAV nsp11野生型蛋白表达量低的问题,随后经过高通量晶体筛选获得PRRSV和EAVnsp11多个活性中心突变蛋白晶体。利用重金属原子(Hg)浸泡法确定相位,系统性地解析了多个动脉炎病毒属nsp11家族蛋白结构。动脉炎病毒nsp11整体结构分为N端结构域和C端结构域两部分,核酸内切酶活性中心位于C端带有正电荷的沟壑处。多个突变蛋白结构表明,所进行的活性位点氨基酸残基突变不影响整体结构;而且同一家族动脉炎病毒NendoU的叁维结构、催化活性中心氨基酸残基位置非常保守。结构比较发现,nsp11活性中心非常灵活多变,具有多种构象;结构中分子间相互作用多样,PISA计算结果显示这些相互作用面积小。动脉炎病毒nsp11虽然缺乏类似冠状病毒nsp15介导六聚体形成的结构域,但本研究通过凝胶过滤层析、分析超速离心和X射线小角散射等实验证明PRRSV和EAV nsp11在溶液中同样存在多聚体形式,主要是叁聚体和四聚体形成的动态平衡,并具有浓度依赖性;突变蛋白聚集状态与野生型蛋白相同。后续通过结构分析以及相关生化实验证明PRRSV和EAV nsp11是一类具有特殊催化性质的NendoU,催化过程与冠状病毒nsp15差异较大,包括不同的底物识别方式,活性中心参与聚集体的形成,不能稳定结合Mn2+等性质。同时本研究证明nsp11不具备单独去泛素化活力。最后根据结构和生化数据,本研究推测nsp11以独特的方式形成四聚体来发挥催化活性,并提出nsp11发挥活力的机理,即nsp11不结合底物时,处于叁聚体形式的非活性状态,此时构象多样;当结合底物时,受底物诱导发生分子重排,形成规则的活性四聚体状态,并将底物结合到两个活性中心,底物水解完成催化过程;此外活性状态的四聚体能够通过两两结合的方式,形成更加高级的聚集形式来提高催化效率。综上所述,本研究解析了高分辨率的PRRSV和EAV nsp11多个突变蛋白晶体结构,结合相关生化实验证实,动脉炎病毒nsp11是一类具有特殊性质的NendoU,从而拓展了对套氏病毒NendoU的认识;从结构生物学的角度更加清晰、全面地阐释了 PRRSV和EAV nsp11催化功能多样性的分子基础,并为针对nsp11的药物开发提供详实的结构信息。(本文来源于《中国农业大学》期刊2018-05-01）
高丽[2]（2016）在《马动脉炎病毒非结构蛋白nsp4抑制IFN-β产生的分子机制研究》一文中研究指出马动脉炎病毒(equine arthritis virus,EAV)属于动脉炎病毒科,为单股正链RNA病毒,可以引起马的病毒性动脉炎。EAV基因组共编码8个结构蛋白和至少13个非结构蛋白。其中非结构蛋白nsp4是一种典型的3C样丝氨酸蛋白酶,具有切割活性。根据报道,nsp4的叁维结构有已知最小的胰凝乳蛋白酶样折迭,还有一个典型的叁联体催化中心(Ser-120,His-39和Asp-65)。I型干扰素是宿主细胞在病毒感染时产生的最主要的抗病毒细胞因子,之前的研究发现EAV可以抑制IFN-β的产生,但具体的作用机制尚不清楚。有文献报道,甲肝病毒和口蹄疫病毒的3C蛋白酶都可以通过其切割活性来抑制IFN-β的产生,那么EAV的3C样蛋白酶即nsp4是否也可以抑制IFN-β的产生呢?鉴于此,本论文以EAV nsp4为研究对象,初步探讨了其对IFN-β产生的影响,并进一步解释了其作用机制,主要研究内容如下:1.超表达EAV nsp4抑制IFN-β的产生及干扰素刺激基因的表达将构建的EAV nsp4的真核表达质粒转染HEK293-T细胞,分别用双荧光素酶报告系统和Real-time PCR检测超表达nsp4对SeV诱导的IFN-β产生的影响,结果表明EAV nsp4在启动子水平和mRNA水平均能够显着抑制IFN-β的产生。我们的研究还发现EAV nsp4可以显着抑制ISG15、ISG20、ISG54和ISG56等多种ISGs的表达。2.EAV nsp4通过抑制NF-κB和IRF3信号通路进而抑制IFN-β的产生干扰素调节因子3(IRF3)和核转录因子-κB(NF-κB)是调节IFN-β产生的两个重要转录因子,为了阐明EAV nsp4是通过哪个转录因子来抑制IFN-β的产生的,我们利用双荧光素酶报告系统和Western Blot实验检测超表达EAV nsp4对这两个转录因子的影响。双荧光素酶检测结果表明,nsp4可以在启动子水平显着抑制IRF3和NF-κB的活化,并且呈现一定的剂量依赖性;Western Blot结果表明nsp4可以抑制IRF3以及p65的磷酸化。这就说明EAV nsp4是通过抑制IRF3和NF-κB两个转录因子的活性进而抑制IFN-β的产生。3.EAV nsp4对IFN-β的抑制依赖其3C样丝氨酸蛋白酶活性EAV nsp4是一种典型的3C样丝氨酸蛋白酶。为了探究nsp4对IFN-β的抑制是否与其3C样蛋白酶酶活性是否有关,我们构建了EAV nsp4的3个酶活性位点突变体,即nsp4-H39A,nsp4-D65A和nsp4-S120A。双荧光素酶报告系统检测结果表明,与野生型的EAV nsp4相比,nsp4的酶活性位点突变体对IFN-β的抑制作用明显减弱,这就表明EAV nsp4对IFN-β的抑制依赖其3C样丝氨酸蛋白酶活性。4.EAV nsp4通过切割NEMO抑制IFN-β的产生RIG-I/MDA5信号通路是RNA病毒感染时宿主产生干扰素的一条重要信号通路。为了探究nsp4抑制IFN-β产生的作用靶标,我们将RIG-I、MDA5、IPS1和TBK1分别与nsp4共转染HEK293-T细胞,双荧光素酶实验发现EAV nsp4的作用靶标在TBK1的上游,进一步我们又将RIG-I、MDA5、IPS1和NEMO分别与nsp4共转染,Western Blot实验发现nsp4可以切割NEMO,而且表现出一定的剂量依赖性。这就表明EAV nsp4是通过切割NEMO来抑制IFN-β的产生。5.EAV nsp4对NEMO的切割依赖其3C样丝氨酸蛋白酶活性EAV nsp4是一种3C样丝氨酸蛋白酶,具有切割活性,因此我们想探究nsp4对NEMO的切割是否依赖其3C样蛋白酶活性,所以将NEMO分别与野生型的nsp4及其酶活性位点突变体共转染,结果发现nsp4的酶活性位点突变体不能切割NEMO,而野生型的nsp4可以切割NEMO,这就说明nsp4对NEMO的切割依赖其3C样丝氨酸蛋白酶活性。(本文来源于《华中农业大学》期刊2016-06-01）
郑小龙,徐彪,王群,朱来华,孙涛[3]（2016）在《马动脉炎病毒进化分析及DNA条形码的确定》一文中研究指出从GenBank数据库下载马动脉炎病毒所有基因组全序列和同属的其他病毒基因组序列,对其进行多重比对,绘制系统进化树,并根据序列比对筛选保守序列作为马动脉炎病毒的DNA条形码。结界发现马动脉炎病毒分为两个分枝,即欧洲型和美洲型,两者同源性在85%以上,而与同属其他病毒同源性低于40%,亲缘关系较远;对马动脉炎病毒基因组序列进行分析,筛选出9条基因序列作为马动脉炎病毒的DNA条形码,可用于马动脉炎病毒的鉴别诊断。(本文来源于《中国兽医学报》期刊2016年02期）
胡月[4]（2015）在《马动脉炎病毒核酸与蛋白定量检测方法的建立》一文中研究指出马病毒性动脉炎(Equine viral arteritis,EVA)是由马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)引起的一种马属动物的传染病。为了建立能够快速、定量检测EAV的病原学方法,本研究应用两株抗EAV N蛋白的单克隆抗体(2B3和2B9)建立了在蛋白水平定量检测EAV的抗原捕捉ELISA (AC-ELISA)方法。结果表明,该方法对EAV的最低检出限为3.86 TCID50,特异性良好,与马属动物常见病毒不发生交叉反应,3次重复试验测定表明该方法稳定性高。同时本研究通过对EAV (Bucyrus株)基因组ORF7设计一对特异性引物,应用新型染料Eva Green建立了能够在核酸水平定量检测EAV的RT-PCR方法,结果表明,当病毒载量在102～107拷贝/μL时,应用该方法测得的Ct值与EAV病毒含量具有良好的线性关系,该方法能够检测出的最低EAV滴度为101.5TCID50/mL,对标准质粒的检出限为10拷贝/μL,经叁次组内和组间重复试验测定,106、104、102拷贝/μL的标准质粒测得的Ct值的变异系数全部小于2%,表明该方法重复性良好。本研究建立的这两种检测方法为实验室开展EAV病原学研究奠定了良好的实验基础。(本文来源于《内蒙古农业大学》期刊2015-06-01）
胡月,戚亭,胡哲,关平原,王晓钧[5]（2014）在《马动脉炎病毒Eva Green荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用》一文中研究指出为建立马动脉炎病毒(EAV)的快速检测方法,本研究设计了一对针对EAV Bucyrus株ORF7基因序列的特异性引物,建立了检测EAV的Eva Green荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)方法。结果表明,该方法在102拷贝/μL~107拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;最低检出量为101.5TCID50/m L病毒,敏感性为常规RT-PCR的100倍,与其他马常见病毒无交叉反应;组内及组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有较好的重复性。此外,采用该方法测定了EAV Bucyrus株及其拯救病毒ic EAV感染RK-13细胞后的复制动态,并与TCID50方法进行了比较。结果显示ic EAV与其亲本病毒接种RK-13细胞后,0 h测定病毒TCID50及拷贝数分别为103.33TCID50/m L(104.65拷贝/2μL)和103.50TCID50/m L(104.70拷贝/2μL);60 h时,细胞病变达到100%,ic EAV及其亲本病毒的TCID50及拷贝数分别为105.67TCID50/m L(107.0拷贝/2μL)和105.57TCID50/m L(106.98拷贝/2μL),两株病毒在RK-13细胞内的复制效率相似。本研究建立的Eva Green q RT-PCR方法可以为细胞培养物中EAV的检测提供有效的技术手段。(本文来源于《中国预防兽医学报》期刊2014年12期）
胡月,戚亭,赵世华,关平原,王晓钧[6]（2014）在《马动脉炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立》一文中研究指出为建立马动脉炎病毒(EAV)的快速检测方法,本实验以EAV N蛋白单克隆抗体(MAb)2B9为捕获抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记的EAV N蛋白MAb 2B3(HRP-2B3)为检测抗体,建立EAV双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的最佳工作条件为:MAb 2B9的包被浓度为2μg/mL,HRP-2B3的工作浓度为2μg/mL,以OD450nm≥0.124为阳性判定标准。该方法对马传染性贫血病毒、马疱疹病毒I型和IV型、马流感病毒等均无交叉反应,特异性好;最低检出限为病毒标准品200倍稀释(103.2TCID50),敏感性高。3次重复试验建立的标准曲线的相关系数(R2)均大于0.997。本实验建立的EAV双抗体夹心ELISA方法具有特异性好、敏感性高等优点,适于EAV的快速检测。(本文来源于《中国预防兽医学报》期刊2014年08期）
Han,M,吴艳[7]（2014）在《非结构蛋白1(nsp1)及其介导的1型干扰素分子在动脉炎病毒中的生物合成》一文中研究指出Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)在宿主抗病毒中起重要作用,且研究发现猪动脉炎病毒属的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)能下调感染过程中IFNs的产生。PRRSV的非结构蛋白1(nsp1)被认为是病毒的一个IFN颉颃剂,且nsp1α亚单位能降解CREB结合蛋白(CBP)及抑制增强体的形成,从而导致IFN合成过程受到抑制。本试验对动脉炎病毒科其他病毒成员:马动脉炎病毒(EAV)、乳酸脱氢酶增高病毒(LDV)和猴出血热病毒(SHFV)进行研究。PRRSV-nsp1和LDV-nsp1可自动切割成nsp1α、nsp1β2个亚单位,而EAV-nsp1未发生切割。SHFV-nsp1最初被预测为可切割成nsp1α、nsp1β、nsp1γ3个亚单位,但实际上只有SHFVnsp1αβ和SHFV-nsp1γ2个亚单位形成。木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶(PLP)1α修饰在SHFV-nsp1α仍无效,且只有nsp1β的PLP1β修饰对生成SHFV-nsp1γ亚单位有效。nsp1的所有亚单位定位在细胞核和细胞浆中,但PRRSV-nsp1β、LDV-nsp1β、EAV-nsp1、SHFV-nsp1γ主要存在于细胞核中。nsp1的所有亚单位含有IFN抑制活性,抑制干扰素调控因子3(IRF3)和NF-κB介导的IFN启动子活性。与PRRSV-nsp1α相似,在表达LDV-nsp1α、SHFV-nsp1γ的细胞中CBP降解明显,但EAV-nsp1中降解不明显。即使CBP的降解,nsp1的所有亚单位仍能抑制IFN敏感反应元件(ISRE)启动子活性。本试验结果表明,nsp1介导的IFN调控对所有动脉炎病毒是一个共同策略,但不同病毒间的作用机制可能不同。(本文来源于《中国畜牧兽医》期刊2014年07期）
王宇,张晓文,王群,梁成珠,汪东风[8]（2014）在《含马动脉炎病毒N基因的病毒样颗粒的制备》一文中研究指出为了构建易于纯化且耐RNase酶的含有马动脉炎病毒N基因的病毒样颗粒,通过RT-RCR扩增马病毒性动脉炎病毒的N基因,将其克隆至含有组氨酸标签的pNH-MS2his载体中,构建重组原核表达载体pNH-MS2his-N。将重组质粒pNH-MS2his-N转化表达菌株大肠杆菌BL21(DE3),1 mmol/L IPTG诱导表达、纯化。对病毒样颗粒进行鉴定及稳定性实验。结果表明该病毒样颗粒含马病毒性动脉炎病毒N基因,并且稳定性良好,构建的病毒样颗粒可以作为RNA病毒检测时的标准品和质控品使用。(本文来源于《畜牧与兽医》期刊2014年06期）
邓增钦[9]（2014）在《格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌铁吸收调控蛋白Fur和马动脉炎病毒解旋酶nsp10的结构与功能研究》一文中研究指出铁对许多基本的生物反应过程都是必需的,例如DNA的合成、呼吸作用、叁羧酸循环等。虽然铁对生命过程是必需的,但是细胞内的铁浓度过高会引发Haber-Weiss反应而产生高活性的自由基,从而对细胞产生毒害作用。大部分细菌通过铁吸收调控蛋白(Ferric uptake regulator,Fur)来精细地调控细胞中的铁浓度。最近在格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense) MSR-1中发现并鉴定了fur基因。MSR-1 Fur直接调控参与铁转运和细胞氧代谢的关键基因的表达,同时在磁小体的合成中起重要作用。MSR-1 fur也能够回补E. coli的fur基因缺失的表型。本实验室解析了未被金属离子激活的MSR-1 Fur (apo-Fur)的结构,其由N端的DNA结合结构域(DBD)和C端的二聚化结构域(DD),以及连接两个结构域的铰链区(Hinge)组成。在晶体结构中,MSR-1 apo-Fur形成不依赖于金属离子的二聚体。在以上研究结果的基础上,本研究利用凝胶过滤层析和分析超速离心实验证明,溶液中MSR-1 apo-Fur也是形成不依赖于金属离子的二聚体。利用DNase Ⅰ足迹法证明MSR-1 Fur能够特异性地识别二价铁转运系统基因feoABl的启动子上一段25 bp的序列(feoAB1 operator),同时EMSA实验证明MSR-1 Fur只有在Fe2+存在的条件下才能结合feoABl operator和E. coli Fur box。本研究进一步解析了金属离子激活的MSR-1 Fur (holo-Fur)的结构,发现MSR-1 Fur含有两个金属离子结合位点,分别是位于DBD和DD之间的S1和位于DD内部的S2。两个位点都形成六配位的八面体,其中S1位点对于金属离子的结合能力强于S2。虽然在体外S2对DNA的结合不是必需的,但是在体内这两个金属离子结合位点对于MSR-1 Fur的功能都是必需的。金属离子结合MSR-1 Fur后诱导Fur发生构象变化,使DBD上识别DNA的α螺旋处于合适的位置,从而使MSR-1 Fur获得了结合DNA的能力。为了解释Fur识别DNA的分子机制,本研究还分别解析了MSR-1 Fur与feoABl operator以及MSR-1 Fur与E. coli Fur box的蛋白-DNA复合物结构,并结合生化分析和体内实验证明：MSR-1 Fur主要利用Arg57来特异性地识别碱基G,同时Lys15插入到一段宽度变窄、表面负电荷加强的DNA小沟中,形成增强的电荷作用；计算模拟发现这段DNA小沟的变窄是由DNA序列的内在性质决定的,即Lys15特异性地识别DNA小沟构象。通过与其它细菌的Fur结构比较发现,DBD上参与DNA互作的关键氨基酸残基很保守,并且空间结构上的位置相同,预示细菌中Fur识别DNA的机制很保守。以上研究结果为阐明细菌中Fur是如何被金属离子激活以及激活后的Fur是怎样特异性地识别目的DNA的分子机制提供了结构生物学证据。解旋酶是一类能够利用水解ATP产生的能量,沿着核酸移动并解开DNA或者RNA双链的酶,是生物体内分布最广的一类酶,在许多生物过程中起重要作用。所有的细胞生物和很多病毒都编码解旋酶。根据解旋酶的一级序列特征将其分为六个超家族(SFI-SF6)。目前对于SF1解旋酶的理解主要来自对细胞生物解旋酶的结构和功能研究。解旋酶是尼多病毒进化上最保守的两个非结构蛋白之一,对马动脉炎病毒(Equine arteritis virus, EAV)解旋酶nsp10的研究发现其属于SF1超家族。EAV nsp10对于病毒的基因组RNA和亚基因组RNA的合成是必需的,其N端含有独特的锌结合结构域ZBD (zinc binding domain),是尼多病毒所独有的,不存在于其它RNA病毒中。本研究通过体外生物化学的方法证明,大肠杆菌表达的重组EAV nsp10Δ(氨基酸残基第1-402位)依然具有和全长蛋白一样的ATP水解酶和解旋酶的活力；同时解析了nsp10Δ单体及其与poly(dT)的复合物结构。EAV nsp10Δ主要由N端的ZBD、C端的解旋酶核心区域1A和2A(HEL1)以及连接两者的1B结构域构成。ZBD螯合叁个锌离子,由RING-like模块和treble-clef锌指结构组成。结构和生化分析证明EAV nsp10对核酸的结合无序列依赖性,nsp10的酶活力依赖于ZBD和HEL1之间的相互作用网络。之前的研究中鉴定的一些ZBD位置上的突变,都是由于直接或间接地破坏了ZBD和HEL1之间的相互作用而使EAV nsp10的酶活力丧失。为了研究马动脉炎病毒属的解旋酶结构的保守性,本研究还解析了该属的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)的解旋酶nsp10的结构。比较两者的结构发现,动脉炎病毒解旋酶的叁维结构非常保守。通过对比目前解析的SF1解旋酶发现,EAVnsp10和人解旋酶Upfl的结构最相似。Upfl在细胞中的一个主要功能是参与无意义介导的mRNA质量控制,鉴于尼多病毒的具有很大的复制酶阅读框ORF1ab (9.5kb-21kb),本研究推测尼多病毒的解旋酶可能具有控制病毒mRNA质量的功能。综上所述,本论文的第二部分第一次解析了尼多病毒中一种主要的酶以及药物靶标(马动脉炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒解旋酶nsp10)的叁维结构。鉴于尼多病毒解旋酶序列的保守性,本研究解析的EAV nsp10和PRRSV nsp10的结构有利于将来研究其它尼多病毒(如冠状病毒)的解旋酶的结构和功能。EAV nsp10和Upfl的结构相似性将病毒和细胞解旋酶的研究联系起来,有助于理解这类重要的酶的进化和功能。(本文来源于《中国农业大学》期刊2014-05-01）
赵世华,戚亭,郭巍,田志革,朱超[10]（2013）在《抗马动脉炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及B细胞抗原表位的鉴定》一文中研究指出为鉴定马动脉炎病毒(EAV)N蛋白的抗原表位,利用原核表达系统表达N蛋白,用其免疫6周龄BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合获得杂交瘤细胞,通过以重组N蛋白为包被抗原的间接ELISA方法筛选出2株能稳定分泌抗N蛋白的单克隆抗体(MAb),分别将其命名为2B3和2B9,其重链属于IgG1,轻链属于κ链。Western-blot证明,2株MAbs均能识别重组N蛋白。间接免疫荧光(IFA)试验证明,2株MAbs均与EAV呈阳性反应。用肽扫描法将N基因截短为具有相互部分重迭的11段,表达带HIS标签的重组蛋白,与MAb 2B3和MAb 2B9进行Western-blot和ELISA反应后,针对表位序列11 ASFRNGRRRQPTSYND26,进一步通过合成短肽对2株MAbs进行精确定位;结果表明,2B3识别的抗原表位为18 RRQPTSYND26,2B9针对的抗原表位为18 RRQPTSYND26。本研究结果为建立EVA的血清学检测方法及研究N蛋白的结构和功能奠定了基础。(本文来源于《中国兽医科学》期刊2013年10期）
马动脉炎病毒论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
马动脉炎病毒(equine arthritis virus,EAV)属于动脉炎病毒科,为单股正链RNA病毒,可以引起马的病毒性动脉炎。EAV基因组共编码8个结构蛋白和至少13个非结构蛋白。其中非结构蛋白nsp4是一种典型的3C样丝氨酸蛋白酶,具有切割活性。根据报道,nsp4的叁维结构有已知最小的胰凝乳蛋白酶样折迭,还有一个典型的叁联体催化中心(Ser-120,His-39和Asp-65)。I型干扰素是宿主细胞在病毒感染时产生的最主要的抗病毒细胞因子,之前的研究发现EAV可以抑制IFN-β的产生,但具体的作用机制尚不清楚。有文献报道,甲肝病毒和口蹄疫病毒的3C蛋白酶都可以通过其切割活性来抑制IFN-β的产生,那么EAV的3C样蛋白酶即nsp4是否也可以抑制IFN-β的产生呢?鉴于此,本论文以EAV nsp4为研究对象,初步探讨了其对IFN-β产生的影响,并进一步解释了其作用机制,主要研究内容如下:1.超表达EAV nsp4抑制IFN-β的产生及干扰素刺激基因的表达将构建的EAV nsp4的真核表达质粒转染HEK293-T细胞,分别用双荧光素酶报告系统和Real-time PCR检测超表达nsp4对SeV诱导的IFN-β产生的影响,结果表明EAV nsp4在启动子水平和mRNA水平均能够显着抑制IFN-β的产生。我们的研究还发现EAV nsp4可以显着抑制ISG15、ISG20、ISG54和ISG56等多种ISGs的表达。2.EAV nsp4通过抑制NF-κB和IRF3信号通路进而抑制IFN-β的产生干扰素调节因子3(IRF3)和核转录因子-κB(NF-κB)是调节IFN-β产生的两个重要转录因子,为了阐明EAV nsp4是通过哪个转录因子来抑制IFN-β的产生的,我们利用双荧光素酶报告系统和Western Blot实验检测超表达EAV nsp4对这两个转录因子的影响。双荧光素酶检测结果表明,nsp4可以在启动子水平显着抑制IRF3和NF-κB的活化,并且呈现一定的剂量依赖性;Western Blot结果表明nsp4可以抑制IRF3以及p65的磷酸化。这就说明EAV nsp4是通过抑制IRF3和NF-κB两个转录因子的活性进而抑制IFN-β的产生。3.EAV nsp4对IFN-β的抑制依赖其3C样丝氨酸蛋白酶活性EAV nsp4是一种典型的3C样丝氨酸蛋白酶。为了探究nsp4对IFN-β的抑制是否与其3C样蛋白酶酶活性是否有关,我们构建了EAV nsp4的3个酶活性位点突变体,即nsp4-H39A,nsp4-D65A和nsp4-S120A。双荧光素酶报告系统检测结果表明,与野生型的EAV nsp4相比,nsp4的酶活性位点突变体对IFN-β的抑制作用明显减弱,这就表明EAV nsp4对IFN-β的抑制依赖其3C样丝氨酸蛋白酶活性。4.EAV nsp4通过切割NEMO抑制IFN-β的产生RIG-I/MDA5信号通路是RNA病毒感染时宿主产生干扰素的一条重要信号通路。为了探究nsp4抑制IFN-β产生的作用靶标,我们将RIG-I、MDA5、IPS1和TBK1分别与nsp4共转染HEK293-T细胞,双荧光素酶实验发现EAV nsp4的作用靶标在TBK1的上游,进一步我们又将RIG-I、MDA5、IPS1和NEMO分别与nsp4共转染,Western Blot实验发现nsp4可以切割NEMO,而且表现出一定的剂量依赖性。这就表明EAV nsp4是通过切割NEMO来抑制IFN-β的产生。5.EAV nsp4对NEMO的切割依赖其3C样丝氨酸蛋白酶活性EAV nsp4是一种3C样丝氨酸蛋白酶,具有切割活性,因此我们想探究nsp4对NEMO的切割是否依赖其3C样蛋白酶活性,所以将NEMO分别与野生型的nsp4及其酶活性位点突变体共转染,结果发现nsp4的酶活性位点突变体不能切割NEMO,而野生型的nsp4可以切割NEMO,这就说明nsp4对NEMO的切割依赖其3C样丝氨酸蛋白酶活性。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
马动脉炎病毒论文参考文献
[1].张满丰.动脉炎病毒核酸内切酶nsp11的结构与功能研究[D].中国农业大学.2018
[2].高丽.马动脉炎病毒非结构蛋白nsp4抑制IFN-β产生的分子机制研究[D].华中农业大学.2016
[3].郑小龙,徐彪,王群,朱来华,孙涛.马动脉炎病毒进化分析及DNA条形码的确定[J].中国兽医学报.2016
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[5].胡月,戚亭,胡哲,关平原,王晓钧.马动脉炎病毒EvaGreen荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国预防兽医学报.2014
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