山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

论文摘要

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21（DE3）,并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.

论文目录

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA第一链的合成

1.2.2 山葡萄C4H基因的克隆

1.2.3 山葡萄C4H基因cDNA序列及其编码蛋白氨基酸的序列分析

1.2.4 山葡萄果皮不同着色时期C4H的表达分析

1.2.5 原核表达载体的构建和表达

1.2.6 真核表达载体的构建与转化

1.3 拟南芥的遗传转化及筛选

1.3.1 拟南芥的遗传转化

1.3.2 转化体的筛选

1.4 拟南芥RNA 的提取及PCR检测

1.4.1 拟南芥基因组RNA的提取

1.4.2 cDNA的制备及PCR检测

1.5 测定拟南芥中花色素苷的质量浓度

2 结果与分析

2.1 RT-PCR合成山葡萄C4H基因cDNA 全长序列

2.2 cDNA全长序列生物信息学分析

2.2.1 基因编码蛋白质理化性状分析

2.2.2 VAmC4H蛋白保守区预测

2.2.3 VAmC4H蛋白的细胞定位

2.2.4 VAmC4H编码蛋白质的同源性

2.2.5 VAmC4H编码蛋白质的进化分析

2.2.6 VAmC4H蛋白二级结构和三级结构预测

2.3 VAmC4H基因在山葡萄果皮不同转色时期的表达分析

2.4 VAmC4H编码产物的原核表达

2.5 转化农杆菌

2.6 转基因植株PCR检测

2.7 转基因植株表型和花色素苷质量浓度

3 讨论与结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 陈蒙,刘海峰

关键词: 山葡萄,克隆,基因,原核表达,遗传转化

来源: 西南大学学报(自然科学版) 2019年10期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,园艺

单位: 延边大学农学院

基金: 国家自然科学基金项目(31260067),吉林省教育厅“十三五”科学技术研究规划项目(吉教科合字[2016]第255号)

分类号: S663.1;Q943.2

DOI: 10.13718/j.cnki.xdzk.2019.10.002

页码: 11-21

总页数: 11

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山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

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