导读:本文包含了卷枝毛霉论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:脂质,番茄,脂肪,性质,红素,激酶,丝状。
卷枝毛霉论文文献综述
张瑶,杨红,王璐,王艳霞,宋元达[1]（2019）在《卷枝毛霉脂肪酶的基因克隆、表达及定性》一文中研究指出脂肪酶(Lipase, EC3.1.1.3)作为一种多功能水解酶,广泛应用于生物能源、油脂工业、食品加工等诸多领域。卷枝毛霉是γ-亚麻酸的重要生产菌株,该菌株也富含大量的油脂生产的关键酶—脂肪酶。前期本课题组对自主筛选的卷枝毛霉(Mucor circinelloides)WJ11进行全基因组测序,根据基因组信息分析,有47个潜在的脂肪酶编码基因。然而对于这些脂肪酶的结构、性质与功能等还尚未研究。本研究以M. circinelloides WJ11的总RNA为模板,通过RT-PCR获得脂肪酶WJ_23的c DNA,并在毕赤酵母(Picha pastoris)GS115中表达,同时对重组P.pastoris生产脂肪酶的发酵条件和重组酶的酶学性质进行研究。主要研究结果如下:1)以M. circinelloides WJ11的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到全长为1109 bp的脂肪酶cDNA,并将其克隆到P. pastoris表达载体pPIC9K上,Sac I酶切线性化后转入P. pastoris菌株GS115,经MD、YPD/G418平板筛选获得重组菌株GS115/pPIC9K-lipase。摇瓶发酵条件下诱导120 h,重组菌发酵上清液中的pNPP水解酶活为3.72 U/mL。2)考察基因工程菌GS115/pPIC9K-lipase的摇瓶发酵情况,确定适宜的发酵条件为:诱导阶段初始菌浓OD600为50,诱导pH 5,诱导温度28°C,每24 h添加1.5%(v/v)甲醇,诱导表达周期120 h,酶活可达6.85 U/mL,是初始菌株产酶量的1.84倍。3)将重组酵母发酵上清液经过超滤、乙醇沉淀、Ni柱层析后得到纯化的重组脂肪酶。SDS-PAGE电泳表明重组酶的分子量为35 kDa。重组脂肪酶的最适温度为30°C,在50°C具有良好的热稳定性;最适pH为9.0,pH稳定范围为pH 6.0-10.0。以pNPP为底物,测得的动力学参数为Vmax和Km分别为94.34 U/mg和6.37 mmoL/L。大多数金属离子如Mn~(2+)、Fe~(3+)、Mg~(2+)等对重组脂肪酶有一定的激活作用。重组脂肪酶优先利用中链长度底物,并对多种有机溶剂能耐性较强。(本文来源于《第十二届中国酶工程学术研讨会论文摘要集》期刊2019-08-08）
昝新艺[2]（2019）在《卷枝毛霉脂肪酶及其调控脂质代谢的机制》一文中研究指出产油微生物可以合成大量甘油叁酯(占细胞干重20-80%,w/w)。其中丝状真菌和微藻可以合成长链多不饱和脂肪酸,这些具有生物活性的脂肪酸是重要的营养食品资源。其他产油微生物,如酵母,合成的常见脂肪酸可以转化成生物柴油,是化石能源的重要替代品。产油丝状真菌卷枝毛霉,因其高产γ-亚麻酸而备受关注。大量研究从基因组、蛋白组、代谢流分布和关键酶活性方面报道了卷枝毛霉的脂质积累机制,并证明了定位于细胞溶胶中的NADP~+依赖的苹果酸酶和磷酸戊糖途径是其脂肪酸合成NADPH的主要来源。但是,目前对于卷枝毛霉脂质分解代谢的研究,尤其是调控脂质分解代谢的脂肪酶,仍是空白。本论文通过基因注释和多种生物信息学工具系统研究了卷枝毛霉高产脂菌株WJ11和低产脂菌株CBS 277.49中脂肪酶的基因特性;结合转录分析找出四个关键脂肪酶基因,通过基因过表达初步研究了它们的功能;通过定点突变和酶活分析研究了脂肪酶Lip6和Lip10在脂质代谢中的双重角色;还研究了卷枝毛霉在不同葡萄糖-油脂混合培养基中脂质积累和脂肪酶活性的情况。本文主要研究内容和实验结果如下:通过分析卷枝毛霉高产脂菌株WJ11和低产脂菌株CBS 277.49的基因组注释和脂肪酶保守序列特征,初步检索到高产脂菌株WJ11中存在47个潜在的脂肪酶基因,低产脂菌株CBS 277.49基因组中存在30个,这些脂肪酶共分为4类:α/β-hydrolase_1、α/β-hydrolase_3、class_3和GDSL。卷枝毛霉WJ11中的25个脂肪酶和CBS 277.49中的16个脂肪酶,不仅拥有典型的脂肪酶活性motif序列GXSXG,而且拥有乙酰转移酶活性motif序列H-(X)_4-D。亚细胞定位、信号肽和基因转录水平分析发现,WJ11中的5个脂肪酶WJ_16、29、39、40和43与CBS 277.49中的脂肪酶116027、106404和170034具有信号肽且基因转录在整个脂质积累过程中受到抑制,表明它们是潜在的分泌型/胞外脂肪酶。通过转录分析发现,在CBS 277.49中,两个脂肪酶基因161426和115761(No.6和10)的转录水平在脂质积累过程中持续上调(上调倍数>1.5),而另外两个基因143450和107413(No.19和24)的转录水平在脂质积累过程中不断下调,这四个脂肪酶可能与CBS 277.49的脂质积累密切相关。通过研究3种常见油脂,大豆油、大豆磷脂和植物甾醇酯,对卷枝毛霉WJ11和CBS277.49细胞生长、脂质积累和脂肪酶活性的影响,发现CBS 277.49在葡萄糖-大豆油混合培养基上的细胞干重最高达21.2 g/L,而WJ11生长在葡萄糖-大豆磷脂混合培养基上的最大细胞干重为18.9 g/L。CBS 277.49在葡萄糖-植物甾醇酯混合培养基上合成的脂质最多达50%(w/w),而WJ11在葡萄糖-大豆磷脂混合培养基上合成的脂质最高为65%(w/w)。卷枝毛霉更偏好吸收利用外源油脂中的棕榈酸、硬脂酸和α-亚麻酸来合成胞内的甘油叁酯。大豆磷脂和植物甾醇酯比大豆油更有利于卷枝毛霉的胞内脂肪酶合成。CBS 277.49生长在含植物甾醇酯培养基上时,它分泌的脂肪酶活性最高(2200 U/g protein),而WJ11在含大豆磷脂培养基上分泌的脂肪酶活性最高(2000 U/g protein)。尽管卷枝毛霉生长在葡萄糖-油脂混合培养基上时它的脂肪酶基因的转录水平剧烈上调,但是它的胞外脂肪酶活性却一直维持在较低水平(4-210 U/g protein)。结合生物信息学和转录分析,推测脂肪酶Lip6、Lip10、Lip19和Lip24可能影响卷枝毛霉CBS 277.49的脂质积累。虽然过表达Lip6和Lip10没有显着增加脂质含量,只是轻微增加细胞干重。但是,过表达Lip6使脂质中C18:3的含量提高了17%,而过表达lip10使C18:0含量下降了16%,同时轻微增加了C18:1、C18:2和C18:3的含量。在重组菌株Mc-Lip6和Mc-Lip10中,脂肪酶基因Lip6和Lip10的转录水平虽然显着上调,但是脂质降解并没有发生。然而,过表达Lip19和Lip24使卷枝毛霉细胞干重下降了9-19%,使脂质含量下降了38-41%,而且显着改变了胞内脂质的脂肪酸组成。脂肪酶Lip6和Lip10的氨基酸序列中同时包含脂肪酶活性motif序列GXSXG和乙酰转移酶活性motif序列HXXXXD。脂肪酶Lip6和Lip10与卷枝毛霉CBS 277.49中溶血磷脂乙酰转移酶及酿酒酵母脂肪酶Tgl3p、Tgl4p和Tgl5p间同源性较低,提示脂肪酶Lip6和Lip10在卷枝毛霉脂质代谢中的功能可能与酿酒酵母脂肪酶Tgl3p、Tgl4p和Tgl5p不同。这些结果提示Lip6和Lip10在卷枝毛霉中可能主要通过发挥乙酰转移酶活性来调控甘油叁酯的脂肪酸组成,而Lip19和Lip24主要通过发挥脂肪酶活性调控甘油叁酯的降解。通过对Lip6和Lip10的脂肪酶活性motif序列和乙酰转移酶活性motif序列进行定点突变,构建了过表达脂肪酶Lip6和Lip10不同突变体基因的重组菌株,分析它们的脂质积累和相关酶活,发现过表达仅含有乙酰转移酶活性motif序列的Lip6和Lip10基因,能增加卷枝毛霉的细胞干重和脂质产量。但是,过表达仅含有脂肪酶活性motif序列的Lip6和Lip10基因,会造成脂质降解。通过研究纯化的脂肪酶Lip6和Lip10突变体的脂肪酶和磷脂酰二酰甘油转移酶(PDAT)活性,发现Lip6和Lip10,在体外表现出微弱的脂肪酶活性和强烈的PDAT活性,其中Lip6对磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸(PS)两种底物的偏好性强于磷脂酰胆碱(PC),而Lip10能利用更多的PS合成甘油叁酯(TAG)。过表达Lip6和Lip10突变体的卷枝毛霉重组菌株的胞内PDAT活性分析与磷脂合成途径关键基因转录分析表明,Lip6和Lip10的乙酰转移酶活性使卷枝毛霉可以更多地利用PS和PE提供的酰基合成TAG。(本文来源于《江南大学》期刊2019-01-01）
何文胜,陈清霞,邹丽梅,曹晓,祁峰[3]（2017）在《卷枝毛霉△6-脂肪酸脱饱和酶基因的敲除及功能研究》一文中研究指出γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid,GLA)是人体所必需且具有多种生理功能的一种重要多不饱和脂肪酸。研究表明,卷枝毛霉等GLA生产菌株中△6-脂肪酸脱饱和酶(△6-Fatty acid desaturase,FAD6)是合成γ-亚麻酸的关键和限速酶,然而GLA是否惟一通过△6-脂肪酸脱饱和酶途径合成则目前还没有报道。作者以卷枝毛霉Mucor circinelloides EIM10 sp.为研究对象,以其FAD6基因的5'端启动子和3'端终止子为同源臂,潮霉素B抗性基因为筛选标记,构建了M.circinelloides EIM10 sp.△6-脂肪酸脱饱和酶FAD6的敲除载体p UMCD6-Hm B,转化进入制备好的原生质体中成功地敲除了FAD6基因,发现FAD6基因缺陷菌株GLA质量浓度比野生型对照菌株降低了50%以上,但GLA并没有完全消失,说明卷枝毛霉生物体内还有其他代谢途径可以将碳源转化为GLA。(本文来源于《食品与生物技术学报》期刊2017年06期）
储林芳[4]（2017）在《木糖代谢在卷枝毛霉脂质积累中的作用机制》一文中研究指出木质纤维素是天然的可再生原料,来源广泛、价格低廉,将其作为原料生产脂质可以显着降低生产成本。木质纤维素水解液中含量最高的单糖是葡萄糖,其次是木糖,如何提高木糖利用率是工业化利用木质纤维素的关键问题。卷枝毛霉(Mucor circinelloides)是研究脂质积累机制的模式生物,曾用于生产γ-亚麻酸。分析卷枝毛霉的基因组信息发现,它可能具有木糖异构酶(xylose isomerase,XI)代谢路径,但迄今未见报道。为进一步提升卷枝毛霉作为产脂工业菌株的潜力,本文研究了卷枝毛霉的木糖代谢过程以及木糖代谢对其脂质合成的影响,主要内容如下:对比分析卷枝毛霉菌株CBS 277.49、CBS 108.16和WJ11的生长和脂质积累情况,以木糖或葡萄糖为唯一碳源,结果表明卷枝毛霉通过XI路径代谢木糖,且与葡萄糖代谢相比,木糖代谢对其生长和脂质积累没有影响。以卷枝毛霉CBS 277.49的cDNA为模板,分别克隆得到编码XI的基因xylA和编码木酮糖激酶(xylulosekinase,XK)的基因XKS1,通过同源重组的方法连接到质粒pMAT1552上得到表达载体pMAT1552-xylA和pMAT1552-XKS1。随后将表达载体通过电击转化的方法转入尿嘧啶缺陷的卷枝毛霉菌株p LEU-MU402,得到重组菌株Mc-XI和Mc-XK。pMAT1552也被转入菌株pLEU-MU402,得到重组菌株Mc-1552,作为对照菌株。在单一碳源条件下培养重组菌株Mc-XI和Mc-XK,Mc-1552作为对照。结果表明过表达XI和XK均能显着提高木糖的代谢速率和脂质的产量,对脂肪酸组成没有影响。在脂质积累阶段,菌株Mc-XI和Mc-XK中XI和XK的转录水平和酶活性均高于对照组,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphatedehydrogenase,G6PDH)和6-磷酸葡糖糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH)的活性也显着高于对照组菌株。采用葡萄糖(33 g/L)与木糖(17 g/L)质量比约为2:1的混合碳源培养Mc-1552、Mc-XI和Mc-XK,结果表明过表达XI和XK有助于缓解葡萄糖抑制效应。与Mc-1552相比,重组菌株的木糖代谢速率分别提升了37%和25%,总脂肪含量提高了8%和28%。此外,转录水平和酶活分析发现葡萄糖的存在,在一定程度上抑制了XK的转录,重组菌株的XI和XK酶活均高于对照组,转录水平与酶活性变化的趋势基本相同。构建xylA和XKS1基因的融合表达载体pMAT1552-xylA+XKS1,经电击转化获得融合表达XI和XK的重组菌株Mc-OL。在木糖或混糖为碳源的情况下,Mc-OL与Mc-1552相比能够显着提高木糖代谢速率,但是脂质产量几乎没有增长,这可能是因为融合表达后重组菌株中积累了大量的D-木酮糖五磷酸,造成流向脂质合成的碳流量发生流失;同时重组菌株中XK酶活的提高,会导致胞内的ATP过度消耗,同样不利于脂质积累。(本文来源于《江南大学》期刊2017-06-01）
张映曈[5]（2016）在《卷枝毛霉生物合成番茄红素的研究》一文中研究指出番茄红素是异戊二烯类化合物,属于类胡萝卜素的一种,是自然界最强的抗氧化剂之一,具有抗癌防癌、防治心血管疾病等多种生理功能。为了满足番茄红素在医药及营养领域的应用需求,通过生物技术大量生产高纯度、安全的番茄红素成为番茄红素合成技术的发展趋势。本论文在以类胡萝卜素为主要次级代谢产物的丝状真菌卷枝毛霉(Mucor circinelloides)基础上,挑选产量较高的突变株为出发菌株,从改造番茄红素合成途径及调控路径两方面着手,通过分子生物学等手段获得了一株番茄红素高产菌株,并对其发酵条件进行初探,进一步提高了番茄红素产量。论文的主要研究结果如下:(1)解除卷枝毛霉类胡萝卜素合成途径的负调控因子crg A,提高卷枝毛霉类胡萝卜素合成:通过敲除卷枝毛霉MU206和MU218中限制类胡萝卜素合成的调控基因crg A,共获得了5株Δcrg A菌株,类胡萝卜素的主要成分(β-胡萝卜素)含量提高了4.8~47.6倍。相较于MU206,以MU218为背景构建的Δcrg A菌株类胡萝卜素产量提高更为显着,其中含量最高的是MU606,其β-胡萝卜素含量在黑暗和光照条件下分别达到3.00 mg/g和4.01 mg/g,是初始菌株MU218的47.6倍和5.4倍,是用于构建卷枝毛霉番茄红素高产菌株的潜力菌株;同时对卷枝毛霉MU206和MU218中潜在的类胡萝卜素调控机理进行了初步探索,发现MU218中存在类似于Crg A途径的新调控路径。(2)阻断番茄红素环化为β-胡萝卜素的反应,构建番茄红素生产菌株:在上述重组菌株MU606基础上,同时采用定点突变和化学诱变两种方式使番茄红素环化酶失活,最终获得叁株红色突变株。测序结果显示叁株突变株中编码番茄红素环化酶的car RP基因均发生了突变。突变导致MUt1和MUt2番茄红素环化酶活力部分丧失,而突变株MUt3的番茄红素环化酶则完全失活,其番茄红素含量在黑暗与光照条件下分别达到1.90 mg/g和3.64 mg/g,与MU606相比提高了30.6倍和21.4倍。根据不同突变株的类胡萝卜组成及含量对卷枝毛霉番茄红素环化酶的催化机制进行了研究:其蛋白结构中两个重复的R domain结构域分别负责γ-胡萝卜素到β-胡萝卜素和番茄红素到γ-胡萝卜素的反应,且第1个R domain的功能依赖于第2个R domain的作用。此外,发现番茄红素含量较高的菌株中存在反馈抑制效应。(3)强化番茄红素合成途径限速步骤,增加目的产物代谢流:首先通过转录组分析推测HMG-Co A还原酶(HMGr)是番茄红素合成途径的限速酶,在突变株MUt3基础上成功同源过量表达编码HMGr的叁个拷贝(hmgr1,hmgr2,hmgr3),揭示了HMGr在卷枝毛霉番茄红素合成过程中的作用:其中hmgr2、hmgr3的过量表达使番茄红素含量提高了2倍左右,说明其编码的HMGr是番茄红素合成途径的限速酶;而hmgr1的过表达并未造成番茄红素含量的变化,暗示其编码的HMGr可能参与了其他萜类物质的合成。本章获得了一株高产番茄红素的卷枝毛霉菌株MUhr3-1,在黑暗和光照条件下番茄红素含量分别达到3.75 mg/g和7.16 mg/g,是对照菌株的2倍。(4)抑制竞争代谢途径(脂肪酸合成途径),为番茄红素合成增加底物:首先通过氮限制培养基考察了卷枝毛霉中脂肪酸和类胡萝卜素积累的关系:脂肪酸和类胡萝卜素的合成均受氮源的调控,积累同步,存在竞争关系;并通过转录组分析发现在类胡萝卜素产量较高的卷枝毛霉菌株中,编码脂肪酸合酶和乙酰辅酶A羧化酶(FAS和ACC)的基因转录水平较低,进一步证明脂肪酸与类胡萝卜素合成的竞争关系;最后在MUhr3-1基础上分别构建了FAS和ACC的RNAi菌株,通过下调FAS和ACC的表达水平使番茄红素的含量分别提高了14%~43%和13%~46%,然而菌体生长受到影响;为避免抑制FAS和ACC的表达导致的菌体生长受阻,在菌体积累完成后添加FAS和ACC抑制剂(浅蓝菌素、棕榈油、红花籽油和橄榄油),进一步提高了番茄红素的含量。其中添加浅蓝菌素和棕榈油最高可使番茄红素含量提升至11.10和11.55 mg/g。(5)优化番茄红素合成发酵培养基碳源、氮源,提高番茄红素产量:以重组卷枝毛霉MUhr3-1为研究对象,考察碳源浓度、氮源的种类和浓度对番茄红素产量的影响,结果表明葡萄糖浓度为80 g/L、以大豆豆粕为氮源且浓度为25 g/L时番茄红素产量最高,与初始发酵条件相比提高了2.5倍。在发酵罐中进行扩大培养,发酵过程中添加棕榈油作为ACC抑制剂,发酵至120 h时番茄红素含量达到12.77±1.79 mg/g,与出发菌株MU218相比提高了386倍。同时番茄红素单位体积产量达到261.28±9.62 mg/L,是迄今为止报道的卷枝毛霉番茄红素最高产量的5倍。成功实现了在卷枝毛霉中番茄红素的高效合成。(本文来源于《江南大学》期刊2016-12-01）
顾琼,金文标,陈远清,郭仕达,万超凡[6]（2017）在《利用卷枝毛霉成球特性高效收获微藻》一文中研究指出利用卷枝毛霉孢子悬液与小球藻共培养,用过滤含藻菌球的方式来收获微藻.以人工配水为培养基,收获效率为指标,通过单因子试验和正交试验得到最佳收获条件为:pH=6.0,葡萄糖质量浓度为1.25 g·L~(-1),菌藻比为1∶250,收获效率为91.08%.对培养前后培养液中多糖质量浓度进行测定,发现小球藻在培养48 h后多糖质量浓度较培养前增加了约0.047g·L~(-1),而菌藻共培养后的混合液中多糖质量浓度为0.019 g·L~(-1).由此可知在菌藻共培养过程中,小球藻会向外分泌某些水溶性多糖物质供卷枝毛霉利用,二者有一定的共生作用.对小球藻和卷枝毛霉细胞表面Zeta电位进行测量发现,小球藻细胞表面的Zeta电位值随着藻液pH值变化波动不大;而卷枝毛霉细胞表面的Zeta电位值,随着pH值的变小,电位值可由原先最低的-37.7 m V升至-9.87 m V.由此推定菌藻相互吸附的主要机制为电中和吸附.(本文来源于《环境科学》期刊2017年02期）
赵利娜[7]（2016）在《卷枝毛霉脂质积累机制的碳代谢流分析及关键基因改造》一文中研究指出微生物油脂富含高价值的多不饱和脂肪酸,如花生四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、伽马亚麻酸等,且微生物油脂可以作为生产生物柴油的原料,因此,近年来微生物油脂受到人们的高度关注。产油丝状真菌卷枝毛霉是全球首次商业化生产微生物油脂的菌株,其生产的油脂富含多不饱和脂肪酸γ-亚麻酸(GLA)。卷枝毛霉CBS277.49的基因组序列已经公布,且具有较为成熟的转化系统,已经成为研究产油丝状真菌脂质积累机制的模式生物。产油酵母脂质积累的机制已有大量文献报道,但是产油丝状真菌卷枝毛霉脂质积累的机制还没有系统地分析和研究。本论文通过13C标记的代谢流量分析方法对产油丝状真菌卷枝毛霉脂质积累的碳代谢调控机制进行研究,并对影响其脂质积累的关键基因进行遗传改造。论文的主要研究内容和实验结果如下:卷枝毛霉CBS 277.49可以积累不超过自身细胞干重15%的油脂,而卷枝毛霉WJ11的总脂肪酸含量高达36%,为了研究卷枝毛霉不同菌株之间脂质含量差别巨大的分子机制,采用13C标记的代谢流量分析方法对两株卷枝毛霉在两种培养条件下脂质合成过程代谢反应网络中代谢流量的分布进行了研究。实验结果表明,与低产脂菌株CBS 277.49相比较,高产脂菌株WJ11中,磷酸戊糖途径和乙醛酸循环的流量显着增加,叁羧酸循环流量降低;与高氮培养条件相比,低氮培养基培养卷枝毛霉WJ11和CBS 277.49时,其磷酸戊糖途径流量增强,叁羧酸循环流量降低,乙醛酸循环流量亦有所增加;在高产脂菌株中,苹果酸酶和磷酸戊糖途径流量的增加能为其脂肪酸的合成提供更多的还原力NADPH,结果显示苹果酸酶和磷酸戊糖途径可能在卷枝毛霉的脂肪酸合成中占据重要的作用;同时ATP:柠檬酸裂解酶的活力亦有所增加,能为其脂肪酸的合成提供更多的底物乙酰辅酶A。将来自于磷酸戊糖途径中编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因在卷枝毛霉中分别过表达。在卷枝毛霉过表达重组菌株中,其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的酶活力显着提高,且相应基因的转录水平也有所提高。与对照菌株相比较,高的酶活力及高的转录水平,使得卷枝毛霉过表达重组菌株的总脂肪酸含量提高了22-37%。实验结果表明,磷酸戊糖途径中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶在卷枝毛霉的脂肪酸合成中具有重要的作用,是其脂肪酸合成所需还原力NADPH的重要提供者。为了研究苹果酸酶在卷枝毛霉脂肪酸合成中的作用,将定位于细胞质的两个苹果酸酶基因分别在卷枝毛霉中过表达。与对照菌株相比较,在过表达重组菌株中,尽管苹果酸酶的活力和苹果酸酶基因的转录水平有所提高,但是其脂肪酸含量并没有变化。实验结果表明,在卷枝毛霉的脂肪酸合成中,苹果酸酶可能并不是其限制性因素。为了研究苹果酸转运蛋白在卷枝毛霉脂肪酸合成中的作用,分别将卷枝毛霉中的苹果酸转运蛋白基因进行过表达和敲除。在苹果酸转运蛋白过表达重组菌株中,与对照菌株相比较,其总脂肪酸含量提高了70%,而敲除菌株的总脂肪酸含量降低了27%。在过表达重组菌株中,其细胞外的苹果酸浓度有所降低,而在敲除重组菌株中,其细胞外的苹果酸浓度有所增加。实验结果表明,苹果酸转运蛋白能够将细胞溶胶中的苹果酸转运至线粒体,进而可能增加线粒体内柠檬酸合成前体及提高柠檬酸的转运速率,从而促进卷枝毛霉脂肪酸的合成,苹果酸转运蛋白在卷枝毛霉的脂肪酸合成中占据重要的位置。(本文来源于《江南大学》期刊2016-06-01）
张映曈,陈海琴,宋元达,张灏,陈永泉[8]（2016）在《卷枝毛霉pyrG基因缺陷突变株的诱变筛选与鉴定》一文中研究指出为制备新的遗传筛选标记用于构建高产番茄红素的工程菌株,实验运用化学诱变的手段,以N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍为诱变剂,以番茄红素生产菌株卷枝毛霉MU616为出发菌株,诱变获得5株尿嘧啶缺陷型突变株,突变株在基本培养基中培养5天后仍不能生长。通过同源转化带有pyr G基因(编码乳清酸核苷-磷酸盐脱羧酶)的质粒p EPM1确定突变株Mt1、Mt4和Mt5为pyr G基因缺陷突变株。随之对pyr G突变株进行生长特性的研究和产番茄红素性能的检测,结果表明,其中突变株Mt4的生物量为(9.0±0.6)g/L,番茄红素产量在黑暗和光照条件下分别为(1 648±185)μg/g和(3 234±281)μg/g,均与出发菌株相似,适宜作为进行卷枝毛霉转化的带有遗传标记的受体菌。pyr G基因缺陷突变菌株的获得对构建高产番茄红素的卷枝毛霉工程菌具有重要的意义。(本文来源于《中国生物工程杂志》期刊2016年03期）
张映曈,陈海琴,宋元达,张灏,陈永泉[9]（2016）在《卷枝毛霉中苹果酸酶同工酶V的酶学性质》一文中研究指出【目的】探讨卷枝毛霉中苹果酸酶同工酶V的性质。【方法】克隆卷枝毛霉中编码苹果酸酶同工酶V的mel基因并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用His标签纯化获得了高纯度的重组酶BLME1,并进行酶学性质分析。【结果】该重组酶最适pH为8.0,最适温度为33℃,在此条件下酶活达到92.8 U/mg,对底物L-苹果酸和NADP~+的米氏常数K_m值为0.74960±0.06129 mmol/L和0.22070±0.01810 mmol/L,最大反应速度V_(max)分别为72.820±1.077 U/mg和86.110±1.665 U/mg。金属离子Mg~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)、Ni~(2+)可以激活BLME1的活性,而Ca~(2+)、Cu~(2+)对BLME1活性则有抑制作用,中间代谢产物草酰乙酸和α-酮戊二酸也会抑制BLME1的活性,但琥珀酸却对BLME1有激活作用。【结论】本实验调查了卷枝毛霉苹果酸酶同工酶V的最适反应温度和pH、动力学参数,以及各种金属离子和中间代谢产物对酶活力的影响,这为以后深入研究该苹果酸酶的功能提供了理论依据和参考。(本文来源于《微生物学报》期刊2016年02期）
唐鑫[10]（2015）在《产油真菌卷枝毛霉WJ11高产脂质的分子机制》一文中研究指出产油微生物能够在细胞内积累大量脂肪酸并以甘油叁酯的形式储存,是传统动植物油脂的重要替代资源。某些微生物积累的油脂还富含高价值的多不饱和脂肪酸,具有重要的应用价值和商业价值。在产油微生物中,不同物种的微生物油脂产量相差巨大,其油脂积累量从细胞干重的20%到80%以上不等。由于不同物种间生理生化特征差异较大,导致不同微生物之间脂质积累差异的机制难于解析,而对同一物种产脂差异显着的不同菌株的研究能够很好地解决这一问题。本文通过基因组学、蛋白质组学以及关键酶的活性分析系统研究了卷枝毛霉高产脂菌株WJ11和低产脂菌株CBS 277.49在脂质代谢调控上的差异;结合转录分析找出了一些关键调控基因;通过基因工程过表达这些关键基因,有效提高了脂肪酸的积累;还研究了氨基酸氮源对卷枝毛霉γ-亚麻酸(GLA)产量的影响。论文的主要研究内容和实验结果如下:通过对卷枝毛霉WJ11和CBS 277.49生长和产脂的分析,发现WJ11脂肪酸含量高达36%,而CBS 277.49则不超过15%。WJ11全基因组的测序结果显示其基因组大小为35.4 Mb,包含827个scaffold,由2530个contig组成,GC含量为39.7%,有10973个预测的基因和177个t RNA基因。通过比较WJ11(本实验室测序)和CBS 277.49(美国联合基因研究所测序)的基因组发现,两株菌的基因组特征总体相似度较高,MAUVE分析显示两株菌的基因组序列拥有很多的同源区域,MUMmer分析也表明两株菌的基因组整体共线性良好。根据基因组信息,构建了WJ11和CBS 277.49中心碳代谢和脂代谢网络,包括葡萄糖的代谢,脂肪酸的合成,甘油叁酯、磷脂、类固醇和类胡萝卜素的合成以及脂肪的β氧化。通过比较两株菌中编码这些代谢途径中相关酶的基因个数,发现基因个数的差异可能对两株菌的脂质积累产生影响。另外,通过Ortho MCL聚类分析找出了WJ11和CBS 277.49之间的特异基因,这些特异基因可能与两株菌的细胞生长和脂肪积累差异相关。利用蛋白质组学分析了高产脂菌株WJ11在脂质积累期(氮缺乏)和生长平衡期全蛋白的表达差异情况,结果发现氮缺乏促进了氮的同化,减缓了氨基酸的代谢;上调了糖酵解相关蛋白的表达并下调了叁羧酸循环相关蛋白的表达,使更多的碳流向脂肪酸合成;氮缺乏提高了磷酸戊糖途径相关蛋白的表达,为脂肪酸合成提供更多的还原力NADPH;在氮缺乏时,蛋白质和核酸的代谢受到抑制,细胞主要进行脂质合成和积累;氮缺乏还上调了一些与能量代谢、信号传导、分子伴侣和氧化还原相关蛋白的表达,以应对氮限制这种环境压力。另一方面,通过比较高产脂菌株WJ11和低产脂菌株CBS277.49在脂质快速积累期全蛋白的表达差异,发现WJ11中与支链氨基酸代谢相关蛋白的表达显着上调,这可能为脂肪酸合成提供更多的底物乙酰辅酶A;与CBS 277.49相比,WJ11中糖酵解相关蛋白的表达量更高,而叁羧酸循环相关蛋白的表达量则较低,这表明WJ11中碳更多流向脂肪酸的合成,而非参与叁羧酸循环;WJ11中磷酸戊糖途径相关蛋白的表达量也较CBS 277.49要高,这表明WJ11中会产生更多的还原力NADPH。通过对卷枝毛霉WJ11和CBS 277.49脂质合成关键酶的活力测定发现,与CBS277.49相比,WJ11中果糖磷酸激酶(PFK)的酶活较低,而磷酸戊糖途径中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)的酶活较高,这将导致更多的碳流向磷酸戊糖途径,从而为脂肪酸合成提供更多的还原力NADPH;对于脂质合成过程中还原力的重要提供者苹果酸酶(ME),其在WJ11脂质积累初期的酶活也略微高出CBS 277.49;WJ11中调控叁羧酸循环的异柠檬酸脱氢酶(ICDH)的酶活显着低于CBS 277.49,这表明WJ11中叁羧酸循环更为缓慢,将会有更多的柠檬酸转运到线粒体外;同时WJ11中ATP:柠檬酸裂解酶(ACL)的酶活相比较CBS 277.49又有所提高,这将增加脂肪酸合成的前体乙酰辅酶A的供应;WJ11中脂肪酸合酶(FAS)的活力也明显高于CBS 277.49。这些酶活差异较为清晰地解析了WJ11高产脂质的调控机制。针对脂质合成中的关键酶以及蛋白质组分析得到的重要差异蛋白,利用RT-q PCR研究它们基因的转录水平,结果显示转录分析数据能够与酶活及蛋白质组数据较好的对应;并发现与生长平衡期相比,WJ11中的g6pdh1和g6pdh2基因的表达在脂质积累期提高幅度较大,推测这两个基因可能与脂质积累密切相关;同时还发现脂质积累期WJ11中与支链氨基酸代谢相关基因(如leu B)的转录水平下调幅度要显着小于CBS 277.49,这些基因也可能通过某种机制参与卷枝毛霉脂质合成的调控。基因组、蛋白质组、酶活以及转录分析的数据显示,WJ11中g6pdh1、g6pdh2及leu B基因可能对脂质积累有重要的调控作用。通过在卷枝毛霉CBS 277.49缺陷型菌株中过表达WJ11中的g6pdh1、g6pdh2及leu B基因,发现这些基因对卷枝毛霉的生长没有明显影响,但均显着提高了脂肪酸的积累:其中过表达g6pdh1的重组菌株脂肪酸含量提高了23~28%,过表达g6pdh2的重组菌株脂肪酸含量提高了41~47%,这表明g6pdh1和g6pdh2均能够调控卷枝毛霉的脂质积累,且g6pdh2的效果更为显着;另外,leu B基因的过表达使重组菌株脂肪酸含量提高了67~73%,表明leu B基因在脂肪酸积累过程中起到重要的调控作用。针对氨基酸对于脂肪酸积累可能的调控作用,分别以二十种标准氨基酸为氮源培养卷枝毛霉,分析其细胞生长、脂质积累及GLA产量。首先比较本实验室叁株卷枝毛霉(WJ11、CBS 108.16和CBS 277.49)GLA的积累能力,发现WJ11总脂肪酸含量最高,但由于脂肪酸组分中GLA比例较低,使GLA产量显着小于CBS 108.16,因此选取CBS108.16作为研究菌株。利用不同氨基酸为氮源培养卷枝毛霉CBS 108.16,发现其菌体生长、脂肪酸积累以及GLA产量会有显着差别,其中,酪氨酸为最适合生长和脂质积累的氮源,且GLA产量也最高(0.81 g/L)。通过对脂肪酸合成相关酶活力的测定,发现酪氨酸显着提高了G6PDH和6PGDH的活力,为脂肪酸合成提供更多的还原力;酪氨酸也提高了ACL的活力,为脂肪酸合成提供更多的乙酰辅酶A,同时,ICDH活力的下调也可能减缓了叁羧酸循环,促进脂肪酸的合成。这与蛋白质组学及WJ11与CBS 277.49脂质合成相关酶的活力分析结果相一致。(本文来源于《江南大学》期刊2015-12-01）
卷枝毛霉论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
产油微生物可以合成大量甘油叁酯(占细胞干重20-80%,w/w)。其中丝状真菌和微藻可以合成长链多不饱和脂肪酸,这些具有生物活性的脂肪酸是重要的营养食品资源。其他产油微生物,如酵母,合成的常见脂肪酸可以转化成生物柴油,是化石能源的重要替代品。产油丝状真菌卷枝毛霉,因其高产γ-亚麻酸而备受关注。大量研究从基因组、蛋白组、代谢流分布和关键酶活性方面报道了卷枝毛霉的脂质积累机制,并证明了定位于细胞溶胶中的NADP~+依赖的苹果酸酶和磷酸戊糖途径是其脂肪酸合成NADPH的主要来源。但是,目前对于卷枝毛霉脂质分解代谢的研究,尤其是调控脂质分解代谢的脂肪酶,仍是空白。本论文通过基因注释和多种生物信息学工具系统研究了卷枝毛霉高产脂菌株WJ11和低产脂菌株CBS 277.49中脂肪酶的基因特性;结合转录分析找出四个关键脂肪酶基因,通过基因过表达初步研究了它们的功能;通过定点突变和酶活分析研究了脂肪酶Lip6和Lip10在脂质代谢中的双重角色;还研究了卷枝毛霉在不同葡萄糖-油脂混合培养基中脂质积累和脂肪酶活性的情况。本文主要研究内容和实验结果如下:通过分析卷枝毛霉高产脂菌株WJ11和低产脂菌株CBS 277.49的基因组注释和脂肪酶保守序列特征,初步检索到高产脂菌株WJ11中存在47个潜在的脂肪酶基因,低产脂菌株CBS 277.49基因组中存在30个,这些脂肪酶共分为4类:α/β-hydrolase_1、α/β-hydrolase_3、class_3和GDSL。卷枝毛霉WJ11中的25个脂肪酶和CBS 277.49中的16个脂肪酶,不仅拥有典型的脂肪酶活性motif序列GXSXG,而且拥有乙酰转移酶活性motif序列H-(X)_4-D。亚细胞定位、信号肽和基因转录水平分析发现,WJ11中的5个脂肪酶WJ_16、29、39、40和43与CBS 277.49中的脂肪酶116027、106404和170034具有信号肽且基因转录在整个脂质积累过程中受到抑制,表明它们是潜在的分泌型/胞外脂肪酶。通过转录分析发现,在CBS 277.49中,两个脂肪酶基因161426和115761(No.6和10)的转录水平在脂质积累过程中持续上调(上调倍数>1.5),而另外两个基因143450和107413(No.19和24)的转录水平在脂质积累过程中不断下调,这四个脂肪酶可能与CBS 277.49的脂质积累密切相关。通过研究3种常见油脂,大豆油、大豆磷脂和植物甾醇酯,对卷枝毛霉WJ11和CBS277.49细胞生长、脂质积累和脂肪酶活性的影响,发现CBS 277.49在葡萄糖-大豆油混合培养基上的细胞干重最高达21.2 g/L,而WJ11生长在葡萄糖-大豆磷脂混合培养基上的最大细胞干重为18.9 g/L。CBS 277.49在葡萄糖-植物甾醇酯混合培养基上合成的脂质最多达50%(w/w),而WJ11在葡萄糖-大豆磷脂混合培养基上合成的脂质最高为65%(w/w)。卷枝毛霉更偏好吸收利用外源油脂中的棕榈酸、硬脂酸和α-亚麻酸来合成胞内的甘油叁酯。大豆磷脂和植物甾醇酯比大豆油更有利于卷枝毛霉的胞内脂肪酶合成。CBS 277.49生长在含植物甾醇酯培养基上时,它分泌的脂肪酶活性最高(2200 U/g protein),而WJ11在含大豆磷脂培养基上分泌的脂肪酶活性最高(2000 U/g protein)。尽管卷枝毛霉生长在葡萄糖-油脂混合培养基上时它的脂肪酶基因的转录水平剧烈上调,但是它的胞外脂肪酶活性却一直维持在较低水平(4-210 U/g protein)。结合生物信息学和转录分析,推测脂肪酶Lip6、Lip10、Lip19和Lip24可能影响卷枝毛霉CBS 277.49的脂质积累。虽然过表达Lip6和Lip10没有显着增加脂质含量,只是轻微增加细胞干重。但是,过表达Lip6使脂质中C18:3的含量提高了17%,而过表达lip10使C18:0含量下降了16%,同时轻微增加了C18:1、C18:2和C18:3的含量。在重组菌株Mc-Lip6和Mc-Lip10中,脂肪酶基因Lip6和Lip10的转录水平虽然显着上调,但是脂质降解并没有发生。然而,过表达Lip19和Lip24使卷枝毛霉细胞干重下降了9-19%,使脂质含量下降了38-41%,而且显着改变了胞内脂质的脂肪酸组成。脂肪酶Lip6和Lip10的氨基酸序列中同时包含脂肪酶活性motif序列GXSXG和乙酰转移酶活性motif序列HXXXXD。脂肪酶Lip6和Lip10与卷枝毛霉CBS 277.49中溶血磷脂乙酰转移酶及酿酒酵母脂肪酶Tgl3p、Tgl4p和Tgl5p间同源性较低,提示脂肪酶Lip6和Lip10在卷枝毛霉脂质代谢中的功能可能与酿酒酵母脂肪酶Tgl3p、Tgl4p和Tgl5p不同。这些结果提示Lip6和Lip10在卷枝毛霉中可能主要通过发挥乙酰转移酶活性来调控甘油叁酯的脂肪酸组成,而Lip19和Lip24主要通过发挥脂肪酶活性调控甘油叁酯的降解。通过对Lip6和Lip10的脂肪酶活性motif序列和乙酰转移酶活性motif序列进行定点突变,构建了过表达脂肪酶Lip6和Lip10不同突变体基因的重组菌株,分析它们的脂质积累和相关酶活,发现过表达仅含有乙酰转移酶活性motif序列的Lip6和Lip10基因,能增加卷枝毛霉的细胞干重和脂质产量。但是,过表达仅含有脂肪酶活性motif序列的Lip6和Lip10基因,会造成脂质降解。通过研究纯化的脂肪酶Lip6和Lip10突变体的脂肪酶和磷脂酰二酰甘油转移酶(PDAT)活性,发现Lip6和Lip10,在体外表现出微弱的脂肪酶活性和强烈的PDAT活性,其中Lip6对磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸(PS)两种底物的偏好性强于磷脂酰胆碱(PC),而Lip10能利用更多的PS合成甘油叁酯(TAG)。过表达Lip6和Lip10突变体的卷枝毛霉重组菌株的胞内PDAT活性分析与磷脂合成途径关键基因转录分析表明,Lip6和Lip10的乙酰转移酶活性使卷枝毛霉可以更多地利用PS和PE提供的酰基合成TAG。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
卷枝毛霉论文参考文献
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