一、肺癌患者血中癌细胞角蛋白20的检测（论文文献综述）
陈顺泰[1]（2021）在《桔梗皂苷D基于JNK/PUMA通路诱导非小细胞肺癌凋亡的机制研究》文中研究表明肺癌是临床最常见的肿瘤,在我国患病率和死亡率居所有恶性肿瘤的前列。其中,非小细胞肺癌占全部肺癌病人的80%。目前非小细胞肺癌的主要治疗方式包括手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等。在过去的三十年中,细胞凋亡一直是被研究的热点,并被认为是细胞发育和程序性死亡的主要机制。细胞凋亡的失调是肿瘤发生的主要原因之一,诱导或促进肿瘤细胞凋亡是目前肿瘤治疗的主要方向。因此,诱导肿瘤细胞凋亡,使机体内细胞的增殖与程序性死亡恢复平衡是治疗肿瘤的关键。JNKs可以通过对基因表达的影响,以及调节内源性和外源性凋亡途径调节诱导细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白是调节细胞凋亡的关键因子,PUMA是Bcl-2家族成员中BH3的亚组中最有效的杀手之一,激活PUMA能够恢复癌细胞的凋亡从而抑制肿瘤的生长,它可能是一个极好的肿瘤细胞治疗靶标。“全国名中医”朴炳奎教授依据多年的临床经验并且结合现代医学药物筛选结果研制了具有确切肺癌疗效的肺瘤平膏。将肺瘤平膏拆分为益气类药物,解毒类药物,活血类药物,化痰类药物,通过前期的拆方析因研究,解毒组主要发挥抑瘤作用,益气组主要可能通过调整机体免疫功能间接发挥抑瘤作用,益气类药物与解毒类药物合用可起到协同提高抑制肿瘤的作用。而理气化痰类的桔梗发挥的作用如何,有待于进一步研究。桔梗是全方化痰药物中的重要组成部分,具有宣肺平喘,化痰排脓的之功效。根据《中国药典》桔梗皂苷D是中草药桔梗的主要生物活性成分,研究发现,桔梗皂苷D具有抗炎镇痛、降脂降糖、抗肿瘤等多种活性作用。而有研究报道桔梗皂苷D可以抑制人胃癌细胞增殖,因此,我们推测桔梗皂苷D可能是肺瘤平膏化痰组的有效组分之一。研究目的通过观察肺瘤平膏（化痰组）含药血清对人非小细胞肺癌细胞以及其主要组分桔梗皂苷D对人非小细胞肺癌细胞荷瘤动物模型中肿瘤组织及非小细胞肺癌细胞株中JNK/PUMA蛋白表达的影响,从诱导凋亡的角度揭示肺瘤平膏（化痰组）及桔梗皂苷D防治肺癌的分子机制,旨在阐释肺瘤平膏防治肺癌的科学内涵,同时为进一步应用中医药治疗肺癌提供科学依据。研究方法（1）肺瘤平膏（化痰组）含药血清作用于H1299细胞后,CCK8检测H1299细胞增殖,Western blot检测相关分子JNK表达的影响;（2）桔梗皂苷D作用于H1299、H2030、A549细胞后,ATK发光法检测细胞活性,计算桔梗皂苷D对以上细胞的IC50值;（3）桔梗皂苷D干预H1299、H2030细胞后,流式细胞术检测细胞凋亡,western blot检测细胞凋亡相关分子表达;（4）桔梗皂苷D干预H1299、H2030细胞后,Western blot检测细胞JNK/PUMA信号通路相关蛋白分子表达,qPCR检测PUMA mRNA变化;（5）通过合成si-RNA、转染技术降低H1299细胞JNK1以及JNK2的表达,桔梗皂苷D干预后,qPCR验证干扰效率,Western blot检测JNK/PUMA信号通路相关蛋白表达;（6）桔梗皂苷D干预H1299细胞后,构建质粒通过双萤光素酶报告基因检测细胞转录因子AP-1的变化;（7）采用H1299细胞株,接种到NSG裸鼠的右侧腋下,建立H1299人非小细胞肺癌荷瘤动物模型,用生理盐水、低剂量桔梗皂苷D、高剂量桔梗皂苷D干预14天后,取材,测量瘤重,计算抑瘤率;（8）采用H1299细胞株,接种到NSG裸鼠的右侧腋下,建立H1299人非小细胞肺癌荷瘤动物模型,用生理盐水、低剂量桔梗皂苷D、高剂量桔梗皂苷D干预14天后,取材,用免疫组织化学法,检测肿瘤组织Ki-67与caspase-3的表达变化。研究结果（1）肺瘤平膏（化痰组）含药血清较空白血清在一定程度能够影响细胞的CCK8 OD值结果,肺瘤平膏（化痰组）在一定程度能够抑制H1299细胞的增殖;肺瘤平膏（化痰组）含药血清组干预H1299细胞48小时后,肺瘤平膏（化痰）组P-JNK表达量为1.17±0.11,对照组为0.07±0.02,肺瘤平膏（化痰）组较对照组明显上升,结果具有统计学意义（P<0.05）;肺瘤平膏（化痰）组PUMA表达量为1.46 ± 0.05,对照组为0.19±0.04,肺瘤平膏（化痰）组较对照组明显上升,结果具有统计学意义（P<0.05）;肺瘤平膏（化痰）组Cleaved caspase-3表达量为0.95±0.07,对照组为0.95±0.10,两组之间没有明显差异。（2）桔梗皂苷D对H1299细胞的IC50值为7.9 μmol/L;桔梗皂苷D对H2030细胞的IC50值为9.7 μmol/L;桔梗皂苷D对A549的IC50值为 10.3 μmol/L。（3）流式细胞技术结果显示,桔梗皂苷D组细胞凋亡的比例大于对照组,且差异具有明显的统计学意义（P<0.01）;Western Blot检测H1299细胞凋亡相关蛋白结果表明,5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L组细胞PARP表达量分别为0 μmol/L组的2.38±0.60、22.29±6.40、43.14±15.3倍,其中 10μmol/L、15μmol/L组较0μmol/L组差异具有明显的统计学意义（P<0.05）;5μmol/L、10μmol/L、15 μmol/L组细胞Cleaved caspase-3表达量分别为 0μmol/L 组的 1.87±0.40、19.86±7.22、74.61±6.88 倍,其中 10 μmol/L、15μmol/L组较0μmol/L比组差异具有明显的统计学意义（P<0.0001）;Western Blot检测H2030细胞凋亡相关蛋白结果表明,5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L组细胞PARP表达量分别为0μmol/L组的2.82±0.59、15.1±6.14、52.52± 15.95倍,其中10μmol/L、15 μmol/L组较0μmol/L组差异具有明显的统计学意义（P<0.01）;5μmol/L、10μmol/L、15 μmol/L组细胞Cleaved caspase-3表达量分别为0μmol/L组的2.24±0.75、29.08±13.62、115.6±13.8倍,其中10 μmol/L、15 μmol/L组较0 μmol/L组差异具有明显的统计学意义（P<0.0001）。（4）Western Blot检测H1299细胞,结果表明,桔梗皂苷D干预48小时之后,5 μmol/L、10 μmol/L、15μmol/L组H1299细胞P-JNK的蛋白表达水平分别是0 μmol/L组的2.80±0.45、17.96±0.27、29.5±1.82倍,其中10 μmol/L、15μmol/L 组较0μmol/L组明显上升,差异具有统计学意义（P<0.0001）;5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L组H1299细胞PUMA的蛋白表达水平分别是0 μmol/L组的1.24±0.1、7.97±3.07、12.08±3.86倍,其中15μmol/L组较0μmol/L组明显上升,差异具有统计学意义（P<0.05）。10μmol/L、15μmol/L组P-c-Jun、c-Jun的表达也较0 μmol/L有所上升。JNK的表达在不同浓度桔梗皂苷D干预后都变化不明显;Western Blot检测H2030细胞,结果表明,桔梗皂苷D干预48小时之后,5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L组H2030细胞P-JNK的蛋白表达水平分别是0μmol/L组的3.32±0.73、31.99±11.63、20.5±4.10倍,其中10μmol/L、15 μmol/L 组较0μmol/L组明显上升,差异具有统计学意义（P<0.05）;5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L组H2030细胞PUMA的蛋白表达水平分别是0μmol/L组的1.32±0.25、9.26±2.99、10.97±4.04倍,其中10μmol/L、15 μmol/L组较0μmol/L组明显上升,差异具有统计学意义（P<0.05）。10 μmol/L、15 μmol/L组P-c-Jun、c-Jun的表达也较0μmol/L有所上升。JNK的表达在不同浓度桔梗皂苷D干预后变化不明显;qPCR检测H1299细胞,干预48小时后,与对照组相比,桔梗皂苷D组H1299细胞PUMA mRNA表达量明显上升,且差异具有统计学意义（P<0.05）。（5）Western Blot检测结果显示,空白JNK1沉默组JNK、JNK1表达较空白阴性对照组明显下降,结果具有统计学意义（P<0.05）;空白JNK2沉默组JNK、JNK2表达较空白阴性对照组明显下降,结果具有统计学意义（P<0.05）;桔梗皂苷D JNK1沉默组JNK、JNK1、P-JNK、P-c-Jun、c-Jun、Cleavedcaspase-3、PUMA表达较桔梗皂苷D阴性对照组明显下降,结果具有统计学意义（P<0.05）;桔梗皂苷D JNK2沉默组JNK、JNK2、P-JNK、P-c-Jun、c-Jun、Cleavedcaspase-3表达较桔梗皂苷D阴性对照组有所下降,其中只有JNK、JNK2具有统计学意义（P<0.05）。（6）双萤光素酶报告基因实验结果显示,干预24小时以及48小时,两组结果比较均有差异,干预48小时比24小时两组差异更大。以上结果均具有统计学意义（P<0.01）。（7）不同浓度桔梗皂苷D干预14天后,低剂量与高剂量桔梗皂苷D组平均瘤重明显小于对照组,结果具有统计学意义。桔梗皂苷D低剂量组抑瘤率为36.87%,桔梗皂苷D高剂量组抑瘤率为52.49%。（8）干预14天后,桔梗皂苷D低剂量组与桔梗皂苷D高剂量组肿瘤组织中Ki-67的表达均明显低于对照组,分别为对照组Ki-67表达量的72±1%以及53±3%,结果具有统计学意义;干预14天后,桔梗皂苷D低剂量组与桔梗皂苷D高剂量组肿瘤组织中Cleaved caspase-3的表达均明显高于对照组,分别为对照组Cleavedcaspase-3表达量的2.66±0.17倍以及3.60±0.16倍,结果具有统计学意义。研究结论（1）在肺瘤平膏中,化痰类药物能激活肺癌细胞JNK/PUMA通路。（2）桔梗皂苷D通过调控JNK/PUMA通路诱导肺癌凋亡。（3）化痰法发挥抗肿瘤作用可通过调控细胞凋亡实现。
赵亚娟,杜帅格,路琳君,郭姝君[2]（2020）在《肺癌患者外周血CK20 mRNA LUNX mRNA表达与肺癌微转移的相关性》文中研究说明目的探讨肺癌患者外周血细胞角蛋白20 mRNA、肺特异性X蛋白mRNA表达与肺癌微转移的相关性。方法将55例肺癌患者设为肺癌组,55例肺部良性病变患者设为对照组,对其外周血细胞角蛋白20 mRNA、肺特异性X蛋白mRNA表达采用逆转录聚合酶链式反应进行检测分析。结果肺癌组外周血细胞角蛋白20 mRNA、肺特异性X蛋白mRNA表达显着高于对照组（P<0.01）。不同分化程度、临床分期及淋巴结转移情况肺癌患者外周血细胞角蛋白20mRNA、肺特异性X蛋白mRNA表达比较差异有统计学意义（P<0.01）,其中低分化程度患者高于中高分化患者,临床分期为Ⅲ期/Ⅳ期患者高于Ⅰ期/Ⅱ期患者,淋巴结转移患者高于无转移患者。肺癌患者外周血细胞角蛋白20 mRNA、肺特异性X蛋白mRNA表达与淋巴结转移、临床分期均呈显着正相关（P<0.01）,与分化程度均呈显着负相关（P<0.05）。结论肺癌患者外周血细胞角蛋白20 mRNA、肺特异性X蛋白mRNA呈高表达,与肺癌微转移、临床分期呈显着正相关,与分化程度呈显着负相关。
王佳妮[3]（2020）在《Cathelicidin依赖P2RX7受体抑制结肠癌转移的作用及分子机制》文中指出目的:结直肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤。转移在结直肠癌中较常见。大约20%的结直肠在初次诊断时已经发生远处转移。大约60%诊断为进展期结直肠癌的患者预测会在5年内发生远处转移。虽然手术和药物治疗的进步,但在过去的几十年里治愈率和长期生存率并没有明显改变。早期结肠癌患者的5年生存率可达80-90%,进展期降为40-60%,如果同时存在转移癌,患者5年生存率仅5-10%。所以进展期结直肠癌的低生存率和高比例放化疗抵抗推动了结直肠癌新药物治疗靶点和治疗方法的研究。Cathelicidin（人基因CAMP,人蛋白LL-37,鼠基因camp,鼠蛋白mCRAMP）是一种抗菌肽,对于炎症性肠病、艰难梭菌感染和肥胖有治疗作用。近期有研究表明Cathelicidin参与了恶性肿瘤的发生发展。在结肠癌、胃癌、肝癌和口腔鳞状细胞癌中LL-37的表达低于正常组织,说明LL-37可能参与了抗肿瘤作用。研究表明Cathelicidin和它的类似物FK-16在人结肠癌HCT116细胞中诱导p53依赖的凋亡。其他类似物（FF/CAP18和Ceragenin CSA13）体外实验发现并没有依赖p53机制抑制HCT116增殖。我们既往研究还发现Cathelicidin没有直接抑制结肠癌HT29细胞的活性,而是通过抑制EMT抑制肿瘤相关的成纤维细胞,并破坏细胞骨架结构,减少了结肠癌细胞的增殖。Cathelicidin的生物学功能受其受体调节。Cathelicidin的作用受体包括至少4个G蛋白偶联受体、3个受体酪氨酸激酶、1个配体门控离子通道和Toll样受体。研究表明FPRL1受体和P2RX7受体可以直接与Cathelicidin作用。转移的结肠癌细胞通常具有间充质特性,比如像βIII微球蛋白表达。微管是细胞骨架的主要成分,由α和β微球蛋白组成的二聚体结构聚合而成,β微球蛋白以多种同型异构体存在于不同的组织。TUBB3是肿瘤细胞抗凋亡、增强侵袭邻近组织和转移能力的促存活级联分子通路的重要成分。TUBB3过表达与肿瘤侵袭性、对化疗药物耐药和不良预后有关。基于以上研究说明Cathelicidin是结肠癌的潜在治疗靶点。然而,Cathelicidin对于结肠癌转移的研究还没有报道。故本研究选取人结肠癌细胞系SW620、HT29及结肠癌肝肺转移裸鼠模型,采用MTS和Body Chamber、RT-PCR、tubulin tracker等方法证实Cathelicidin通过其受体破坏结肠癌细胞骨架,从而降低结肠癌转移。研究方法:1.选取人结肠癌细胞系SW620,予不同浓度的LL-37（1μM,5μM,10μM）及对照组处理。采用MTS和Body Chamber Approach方法评价LL-37对结肠癌细胞活力、迁移及侵袭能力的影响。2.建立结肠癌肝肺转移裸鼠模型,经鼠尾静脉注射cathelicidin过表达的腺病毒,利用免疫组化、RT-PCR检测HA-AAV和mCRAMP在肝、肺的表达,证明造模成功。利用免疫组化、RT-PCR检测Cytokeratin18和Keratin20在肝、肺的表达,评价Cathelicidin是否可以抑制结肠癌转移。3.选取人结肠癌细胞系HT-29和SW620,予不同浓度的LL-37（1μM,5μM,10μM）及对照组处理。利用tubulin tracker染色和RT-PCR评价LL-37对TUBB3表达水平的影响。4.选取人结肠癌细胞系SW620,予5μM的LL-37及对照组处理,分别转染TUBB3过表达及对照组慢病毒,采用Boyden chamber和RT-PCR评价LL-37是否通过减少TUBB3抑制结肠癌细胞迁移。5.利用PCR Arrays检测正常人肠组织及各期结肠癌患者癌组织中CAMP m RNA、P2RX7 mRNA和FPRL1 mRNA的表达。6.选取人结肠癌细胞系HT-29和SW620,予5μM的LL-37及对照组处理,再分别予以P2RX7和FPRL1的拮抗剂KN62、WRW4及对照处理,采用Boyden chamber、RT-PCR和tubulin tracker染色探索LL-37通过P2RX7或FPRL1中的哪个受体抑制结肠癌细胞迁移。7.建立结肠癌肝肺转移裸鼠模型,经鼠尾静脉注射cathelicidin过表达的腺病毒,再分别予以P2RX7的拮抗剂KN62及对照组处理,利用免疫组化、RT-PCR检测Cytokeratin18和Keratin20在肝、肺的表达,评价Cathelicidin是否通过P2RX7受体抑制结肠癌转移。8.选取人结肠癌细胞系SW620,予5μM的LL-37及对照组处理,再分别转染P2RX7 shRNA及对照组,应用miRNA Arrays筛选相关microRNA,并分别再选取人结肠癌细胞系HT-29和SW620,应用RT-PCR方法进行验证。9.选取人结肠癌细胞系SW620,予5μM的LL-37及对照组处理,再分别予miR200c-3p抑制剂及对照组处理,应用RT-PCR、Boyden chamber和tubulin tracker染色,评价LL-37是否通过miR200c-3p调节TUBB3的表达,抑制结肠癌细胞迁移。结果:1.LL-37在5μM和10μM时抑制结肠癌细胞SW620迁移,但不影响其活力及侵袭性。2.将人结肠癌细胞系HT-29（1*106/L）于100ul HBSS溶液制备细胞混悬液,8周龄裸鼠尾部静脉注入注射相同细胞数的人结肠癌细胞系HT-29,建立结肠癌肝肺转移裸鼠模型。将裸鼠分2组,同天于鼠尾静脉分别注入HA-AAV和CAMP-HA-AAV(每100μL含4×1012基因拷贝数),第28天处死裸鼠,取肝、肺组织。CAMP-HA-AAV组肝、肺组织的CAMP mRNA表达明显高于对照组。两组HA-Tag染色基本一致,说明AAV载量基本相同。裸鼠的肝、肺组织均可见细胞角蛋白18表达阳性,CAMP-HA-AAV组肝、肺组织的细胞角蛋白18表达较对照组明显减少,且角蛋白20 mRNA水平明显降低。3.通过tubulin tracker染色可见LL-37在5μM和10μM时破坏结肠癌细胞骨架,并呈剂量依赖性。LL-37未影响TUBB1 mRNA水平在SW620和HT-29细胞的表达水平,LL-37在5μM明显抑制了TUBB3在SW620和HT-29细胞的表达水平。4.转染TUBB3过表达慢病毒组TUBB3 mRNA表达水平明显增加,无论是否暴露于LL-37转染TUBB3过表达慢病毒组明显增加了SW620细胞迁移性。5.Ⅱ期结肠癌组织表达Cathelicidin较正常肠组织中表达明显降低,其他各期组织间无明显差异。正常肠组织及各期结肠癌组织中均可见P2RX7 mRNA和FPRL1mRNA的表达,各组间表达无差异。6.P2RX7的拮抗剂KN62逆转了LL-37对SW620细胞迁移的抑制,但FPRL1的拮抗剂WRW4并不能逆转这种抑制,KN62还能减轻LL-37对SW620细胞骨架的破坏。瞬时转染P2RX7 shRNA明显减少P2RX7 mRNA,转染P2RX7 shRNA组可以使LL-37（5μM）降低的TUBB3mRNA表达水平再次升高。同样,P2RX7的拮抗剂KN62也可以阻止LL-37介导的TUBB3 mRNA表达水平的抑制。7.建立结肠癌肝肺转移裸鼠模型。将裸鼠分2组,同样方法于鼠尾静脉分别注入HA-AAV和CAMP-HA-AAV,每组再各分2组,同样方法于鼠尾静脉分别注入P2RX7的拮抗剂KN62及对照组。KN62逆转了Cathelicidin过表达组肝、肺组织的细胞角蛋白18和角蛋白20的减少,且KN62逆转了Cathelicidin过表达组肝、肺组织TUBB3mRNA的表达下降。8.LL-37可以增加miR200c-3p在SW620和HT-29细胞的表达。转染P2RX7 shRNA可以逆转LL-37介导的miR200c-3p增加。同样,KN62也可以抑制LL-37诱导miR200c-3p的表达。miR200c-3p抑制剂逆转LL-37介导的TUBB3的抑制,细胞骨架的破坏及细胞迁移。结论:1.Cathelicidin呈剂量依赖性抑制结肠癌细胞SW620迁移。2.Cathelicidin抑制结肠癌细胞转移。3.Cathelicidin抑制TUBB3 m RNA表达,破坏细胞骨架结构,抑制结肠癌细胞迁移及转移。4.Cathelicidin在正常人肠组织及各期结肠癌患者癌组织中均有表达,Ⅱ期结肠癌患者癌组织中Cathelicidin表达明显下降。5.P2RX7和FPRL1受体在正常人肠组织及各期结肠癌患者癌组织中均有表达,但各组间无明显差异。6.P2RX7的拮抗剂KN62,而不是FPRL1的拮抗剂WRW4逆转LL-37对结肠癌细胞迁移及TUBB3 mRNA表达的抑制作用。7.Cathelicidin通过P2RX7受体抑制结肠癌细胞转移8.Cathelicidin通过P2RX7受体增加miRNA200c-3p表达9.Cathelicidin通过miRNA200c-3p抑制微管蛋白表达,抑制结肠癌细胞迁移
杨轩璇[4]（2019）在《MicroRNA-613靶向ATOH1调控结肠癌生物学功能的机制研究》文中指出结直肠癌是全世界最常见的消化道恶性肿瘤之一,在全球发病率排第三,死亡率排第二。2018年全球约有180多万新发病例和88万死亡病例,约占癌症病例和死亡病例的十分之一。各国之间结直肠癌的发病率差异很大,发达国家的结直肠癌发病率约为发展中国家的三倍。这一疾病可被认为是社会经济发展的标志。随着国家人类发展指数（HDI）的增加,发病率也呈现出统一的上升趋势。评估最近十年结直肠癌发病率和死亡率的趋势,确定了与发展水平相关的3种不同的模式:发展中国家,如中国和巴西,随着生活习惯、饮食模式的改变和肥胖,结直肠癌的死亡率和发病率在上升;发达国家,如加拿大、英国、新加坡等,通过实施最佳的癌症治疗和管理模式,使结直肠癌的死亡率得到下降;而美国、日本、法国等国家,则通过早期检测和筛查,结直肠癌的死亡率和发病率都有下降趋势。但是结肠癌的发生发展机制仍不甚清楚,能够用于早期诊断、治疗和预测预后的生物标志物十分有限。因此,探究结肠癌的发生发展机制,寻找有效的生物靶标对于结肠癌的早诊断、早治疗、评估预后具有极其重要的意义。微小RNA（Micro RNAs,miRNA）是一种由内源基因（大约20个核苷酸长度）编码的单链非编码RNA,可通过与靶基因m RNA的部分互补位点结合而影响转录过程并影响细胞功能,起到促进癌症或抑制癌症的作用。此外,miRNA还可以通过降解m RNA来调节基因沉默。它具有复杂的调控网络,可以通过单个micro RNA调控多个靶基因的表达,也可以通过多个micro RNA的组合来精确调控某个基因表达。已经发现,多种miRNA在许多类型的肿瘤中有异常表达,这通常与患者的诊断,分期,进展,预后和临床疗效有关。ATOH1基因是果蝇基因Atonal的同源物,位于4q22号染色体上,可调节中枢神经系统和周围神经系统中神经细胞的功能。先前的研究发现,在结肠癌细胞中,可以通过上调ATOH1的表达来抑制细胞迁移和增殖从而延长G0/G1期。在本研究中,我们首先研究了miR-613在结肠癌中的作用,双荧光素酶报告证明了miR-613是ATOH1的上游miRNA。通过共转染miR-613和ATOH1证实ATOH1可逆转miR-613对结肠癌细胞的促进作用。然后通过Western Blot研究ATOH1调节的下游蛋白质,推测miR-613通过靶向下调ATOH1的表达,进而抑制JNK1通路,抑制抑癌蛋白MUC2的表达,最终导致结肠癌进展。因此,作为致癌基因,miR-613通过靶向ATOH1调控结肠癌的进展,并有希望成为临床治疗干预的靶标。第一部分结肠癌组织中miR-613的表达及生物学功能研究目的:初步分析miR-613在癌组织和癌旁组织中的差异,并通过体外试验探索分析miR-613对结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。研究方法:收集20例结肠癌患者的癌组织和癌旁组织,用qRT-PCR法检测结肠癌组织和癌旁组织中miR-613的表达。qRT-PCR法检测结肠癌细胞株中miR-613的表达。质粒转染构建下调miR-613和过表达miR-613的结肠癌细胞模型,qRT-PCR法检测结肠癌细胞株miR-613的表达。我们应用MTT法检测细胞增殖能力,应用划痕试验检测细胞迁移能力,应用Transwell试验检测细胞侵袭能力,阐明miR-613在结肠癌细胞中的生物学功能。研究结果:qRT-PCR检测结果表明结肠癌组织中miR-613表达上调。结肠癌细胞中miR-613的表达显着高于正常人结肠上皮细胞。MTT法检测证明,过表达miR-613能有效促进结肠癌细胞的增殖,而下调表达miR-613的结肠癌细胞增殖活性明显下降。Transwell试验证明,下调表达miR-613的结肠癌细胞株侵袭能力显着降低,而过表达miR-613的结肠癌细胞株的侵袭能力显着提高。划痕试验证明,下调表达miR-613的结肠癌细胞株迁移能力显着降低,而过表达miR-613的结肠癌细胞株的迁移能力显着提高。结论:miR-613在结肠癌组织中高表达,并能促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。第二部分miR-613靶向抑制ATOH1的表达及ATOH1对结肠癌预后价值的探究研究目的:通过体外试验分析miR-613的靶基因,并探寻miR-613对ATOH1的调控机制以及对结肠癌细胞的生物学行为的影响。研究方法:双荧光素酶检测报告证实ATOH1 m RNA与miR-613的结合位点。质粒转染构建下调miR-613和过表达miR-613的结肠癌细胞模型,qRT-PCR法检测结肠癌细胞株ATOH1 m RNA的表达,Western Blot法检测结肠癌细胞株中ATOH1蛋白的表达。免疫组化染色法评估结肠癌组织中ATOH1蛋白的表达并探究其与生存期的关系。qRT-PCR法测定结肠癌组织中ATOH1蛋白和ATOH1 m RNA的表达一致性。研究结果:双荧光素酶检测报告证实ATOH1是miR-613的靶基因。qRT-PCR的结果显示,下调miR-613的结肠癌细胞株中ATOH1 m RNA的表达水平显着升高,而过表达miR-613的结肠癌细胞中ATOH1 m RNA的表达水平显着降低。Western Blot法证实,下调miR-613能使ATOH1蛋白的表达水平显着升高,过表达miR-613组的ATOH1蛋白表达水平显着下降。免疫组化染色法证实,ATOH1在结肠癌组织和癌旁组织中都有阳性表达,在癌旁组织中表达高于癌组织,且在结肠癌组织中ATOH1高表达与较低分级和较低TNM分期显着相关。ATOH1表达阳性的患者总生存期更长。qRT-PCR法证实,结肠癌组织中的ATOH1 m RNA表达和ATOH1蛋白的表达方向一致。结论:ATOH1是miR-613的靶基因,miR-613能抑制ATOH1 m RNA和ATOH1蛋白的表达。ATOH1与结肠癌呈负相关,ATOH1表达阳性的患者总生存期更长。结肠癌组织中ATOH1 m RNA和ATOH1蛋白对肿瘤的影响是一致的。因此推断,能通过qRT-PCR法检测患者外周血中的miRNA-613的表达而早期诊断肿瘤并预测患者的预后。第三部分ATOH1抑制miR-613对结肠癌细胞的促进作用研究目的:回复实验验证ATOH1能逆转miR-613对结肠癌细胞生物学功能的促进作用。研究方法:将miR-613 mimic和/或ATOH1过表达质粒转染至HCT-116和Lovo结肠癌细胞,MTT法分别检测各组结肠癌细胞株的增殖能力,Transwell试验分别检测各组结肠癌细胞株的侵袭能力,划痕试验检测各组结肠癌细胞的迁移能力,Western Blot检测ATOH1下游标志蛋白的表达。研究结果:miR-613能促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,而ATOH1能显着抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在miR-613和3’UTR缺失型ATOH1共转染时,ATOH1可逆转miR-613对结肠癌细胞株的增殖、迁移和侵袭的抑制作用。Western Blot结果表明,ATOH1对总的JNK1蛋白表达无显着改变,但可以提高其活化形式p-JNK1的表达,此外miR-613能抑制抑癌蛋白MUC2的表达。结论:ATOH1高表达是结肠癌患者的良好预后因素。ATOH1能显着抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。miR-613通过靶向调控ATOH1促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,可能是通过抑制JNK1通路和抑制MUC2,最终导致结肠癌进展。第四部分体内试验验证miR-613靶向ATOH1对结肠癌生物学功能的影响研究目的:动物实验验证miR-613靶向调控ATOH1对结肠癌发生发展的影响。研究方法:将control、miR-613mimic、ATOH1、miR-613+ATOH1四组质粒转染的细胞分别接种于小鼠皮下构建成瘤模型,测量肿瘤体积,并称取肿瘤重量。研究结果:miR-613过表达的结肠癌细胞组,Balb/c Nod荷瘤小鼠体内的肿瘤形成能力明显高于空白对照组;ATOH1过表达组的Balb/c Nod荷瘤小鼠体内的肿瘤形成能力明显低于空白对照组,miR-613可靶向下调ATOH1对体内成瘤的抑制作用。结论:miR-613通过调控ATOH1表达可促进结肠癌在体内的发生和生长。
尤小兰[5]（2016）在《CK20在胃癌患者外周血、淋巴结中的表达及其对预后的预测价值》文中提出第一部分荧光定量PCR法检测胃癌微转移可行性研究目的：探讨荧光定量PCR法检测胃癌微转移的敏感性和特异性。方法：1.选取5种不同分化程度的胃癌细胞株作为研究对象,将高分化细胞株AGS的表达量设定为1.0,RT-PCR法检测不同胃癌细胞株CK20表达情况,挑选出适合建立体外胃癌微转移模型的胃癌细胞株。2.应用10倍稀释法和毛细管法分别将105、104、103、102、101、1个SGC-7901细胞株置入健康人108外周血单核细胞中,建成含不同SGC-7901细胞数的体外胃癌微转移模型。3.分别采集40例健康志愿者外周血各两管,每管5ml。应用荧光定量PCR法分别检测健康志愿者两管外周血中及体外胃癌微转移模型中CK20mRNA表达情况以确定其检测胃癌微转移敏感性和特异性。结果：1.CK20mRNA在不同分化胃癌细胞株中均有表达,其表达强度在各胃癌细胞株之间差异无统计学意义（t=1.734,P=0.181）,而在PBMN中未能检测到CK20mRNA有效表达。在各胃癌细胞株中,SGC-7901表达相对偏低,故体外模型验证中选择SGC-7901细胞。2.对SGC-7901体外微转移模型检测显示,荧光定量PCR检测CK20mRNA微转移敏感性为10-7。3.健康志愿者第一管血标本中,CK20荧光定量PCR检测9例为阳性,31例阴性,假阳性率为22.5%,而第二管血标本中,1例阳性,39例阴性,假阳性率2.5%。结论：1.CK20在不同分化胃癌细胞株中均有表达,而在PBMN中不表达。2.荧光定量PCR法检测胃癌外周血微转移的敏感性为10-7,特异性为97.5%,是检测胃癌微转移较好的检测方法。第二部分 胃癌组织中CK20的表达及意义目的：研究胃癌组织及正常胃粘膜组织中CK20表达情况,分析胃癌组织中CK20表达与患者预后关系。方法：1.应用免疫组化法检测了85例胃癌患者肿瘤组织及胃粘膜组织中CK20表达情况。2.对比CK20在胃癌组织及胃粘膜组织中表达差异。3.对胃癌组织及胃粘膜组织中CK20免疫组化积分进行ROC检验,获得CK20免疫组化积分的cut-off值。4.根据胃癌组织中CK20免疫组化积分及cut-off值将患者分为CK20高表达组和低表达组,以Kaplan-Meier生存函数分析胃癌组织中CK20表达与患者无复发生存及3年总生存的影响。结果：1.CK20在胃癌组织、胃粘膜组织均不同程度阳性表达。2.胃癌组织中CK20免疫组化积分与胃粘膜组织中CK20免疫组化积分差异无统计学意义（P=0.107）3.至本研究结束,所有患者随访3年,胃癌组织中CK20低表达者与高表达者两组OS及DFS差异无统计学意义（P>0.05）。结论：1.CK20在胃癌组织、胃粘膜组织均普遍阳性表达。2.CK20在胃癌组织及胃粘膜组织中表达无明显差异。3.胃癌组织中CK20表达水平对患者OS及DFS无影响。4.CK20可以作为检测胃癌外周血、胃周淋巴结微转移的标记物。第三部分 胃癌患者外周血中CK20mRNA检测及意义目的：探索应用荧光定量PCR法检测胃癌患者外周血中CK20mRNA表达的临床意义。方法：1.应用荧光定量PCR法分别检测了85例胃癌患者、40例良性肿瘤患者手术前及手术后外周血中CK20mRNA表达情况。2.分析胃癌患者外周血中CK20mRNA阳性表达与临床病理参数之间的关系以及手术前后检测结果之间差异。3.应用Kaplan-Meier生存函数,分析胃癌患者术后外周血中CK20mRNA表达对胃癌术后无复发生存及3年总生存的影响。结果：1.手术前对照组40例良性肿瘤患者外周血中CK20mRNA检测结果均为阴性；85例原发性胃癌患者中有35例（41.2%）外周血中CK20mRNA阳性；两组之间差异有显着性(x2=22.876,P=-1.72×10-6)。2.胃癌患者术前外周血微转移与患者年龄、性别、肿瘤位置无关（P>0.05）；与肿瘤分化程度相关（P<0.05）,与肿瘤大小、Borrmann分型、肿瘤浸润深度、淋巴结转移情况、外周血CEA、CA724、CA199值、脉管内有无癌栓等病理特征密切相关（P<0.01）。3.手术后第一天,对照组40例良性肿瘤患者外周血中CK20mRNA检测结果仍均为阴性；85例原发性胃癌患者中有49例（57.6%）外周血中CK20mRNA阳性,两组之间差异有显着性(x2=37.926,P=7.34×10-10)。胃癌患者手术后外周血中CK20mRNA表达与患者年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤分化程度无关（P>0.05）；与肿瘤大小、Borrmann分型、肿瘤浸润深度、胃周淋巴结转移情况、外周血CEA、CA724、CA199值、脉管内有无癌栓等病理特征密切相关（P<0.01）。4.手术后患者外周血CK20mRNA表达明显高于术前,两者差异有统计学意义（x2=4.612,P=0.032）。5.术后患者外周血CK20mRNA表达与患者术后OS、DFS相关（P<0.05）,阳性表达者的3年总生存时间及无复发生存时间均显着缩短。结论1.CK20mRNA在胃癌患者外周血中表达有较高的特异性。2.较多患者术前外周血存在微转移。3.胃癌患者术前外周血微转移与肿瘤体积大、分化差、Borrmann分型Ⅲ-Ⅳ型、浸润深度T3-T4、淋巴结转移N2-N3、术前外周血中CEA、CA724、CA199升高、肿瘤组织脉管内癌栓等因素相关。4.手术操作是促进胃癌微转移的一个重要因素。5.术后患者外周血中CK20表达可以评估患者预后。第四部分 CK20蛋白及基因在胃周淋巴结中的表达及其临床意义目的：通过对胃癌患者胃周淋巴结进行微转移检测,评价胃癌淋巴结微转移的检测方法,分析胃周淋巴结微转移危险因素以及微转移对患者预后的影响。方法：1.对胃癌患者胃周淋巴结进行HE常规检查、CK20免疫组化及CK20mRNA荧光定量PCR检测。2.应用Kaplan-Meier生存函数,分析各种检测方式证实的淋巴结转移对患者预后的影响。3.分析各临床病理参数与胃周淋巴结微转移之间关系。4.建立COX风险预测模型,分析基线资料及临床病理资料对胃癌患者预后的影响。结果：1.HE染色转移阳性淋巴结行免疫组化及荧光定量PCR检测均为阳性。2.HE染色阴性淋巴结行CK20免疫组化法检测发现有28枚/16例阳性；CK20mRNA荧光定量PCR检测发现有137枚/34例胃周淋巴结阳性,并且免疫组化检测呈阳性的荧光定量PCR法检测同时均为阳性。在胃周淋巴结微转移检测中,荧光定量PCR法灵敏度更高,与HE染色法比较采用x2检验,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.经免疫组化法和荧光定量PCR发现有137枚/34例胃周淋巴结存在微转移现象,导致22例患者的临床病理分期发生相应改变,使得胃癌临床病理分期更趋准确。4.胃周淋巴结微转移与患者年龄、性别、肿瘤位置、HE检查淋巴结转移情况无关（P>0.05）；与肿瘤大小、Borrmann分型、外周血CEA、CA724、CA199值、外周血微转移情况相关（P<0.05）；与肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度、肿瘤脉管内有无癌栓等临床病理参数密切相关（P<0.01）。5.存在胃周淋巴结转移和微转移的患者3年总生存时间及无复发生存时间明显低于无微转移的患者（P<0.05）。6.COX模型统计分析显示肿瘤分化、Bormann分型、浸润深度、脉管内癌栓、淋巴结转移及微转移、外周血微转移是影响胃癌预后的危险因素。结论：1.荧光定量PCR检测CK20mRNA表达,是发现胃癌胃周淋巴结微转移的灵敏检测方法。2.通过胃周淋巴微转移检测可以整体提高胃癌患者淋巴结转移的检出率,为患者提供更准确的术后病理分期。3.胃周淋巴结微转移与患者预后有明显相关性,微转移阳性的患者具有比较高的转移复发机率和死亡率。4.胃周淋巴结微转移是胃癌预后的危险因素,是评估胃癌预后比较独立的检测指标。
娄颖博[6]（2016）在《细胞角蛋白在结直肠癌浸润与转移的临床研究》文中指出目的:探究CK7、CK19、CK20与结直肠癌浸润与转移的临床意义。方法:采用反转录酶-聚合酶链锁反应（RT-PCR）检测40例健康体检者（健康组）、80例肠道良性病患者（良性疾病组）及120例结直肠癌患者（CRC组）手术前1天、手术后10天、手术后半年复查时外周血CK7、CK19、CK20表达情况,并进行相关数据统计分析。结果CRC组术前外周血中CK7、CK19、CK20阳性表达率分别为7.50%（9/120）、23.3%（28/120）、37.50%（45/120）,CRC组术后10天时外周血中CK7、CK19、CK20阳性表达率分别为9.20%（11/120）、22.50%（26/120）、39.20%（47/120）;CRC组术后半年时外周血CK7、CK19、CK20阳性表达率分别为11.7%（14/120）、35.00%（42/120）、58.3%（70/120）;其阳性表达率均高于健康组外周血CK7、CK19、CK20阳性表达率分别为0%（0/40）、2.50%（1/40）、5.00%（2/40）和良性疾病组外周血中CK7、CK19、CK20阳性表达率分别为2.50%（2/80）、15.0%（12/80）、21.5%（17/80）,差异有统计学意义（P<0.05）。结论CK7在健康组无阳性表达,而在良性疾病组与CRC组中低度阳性表达,其与结直肠息肉由良性向恶性转变有一定相关性;CK19、CK20在CRC组中阳性表达率较健康组和良性疾病组明显升高,其与肿瘤的TNM分期、分化程度、淋巴结转移有一定相关性;术后半年时CRC组CK19、CK20阳性表达率升高与在结直肠癌的发生浸润与转移存在一定的相关性。
龚学军[7]（2010）在《CEA及CK20的不同检测方法对结直肠癌诊断及预后评估的初步探讨》文中指出背景结直肠癌是最常见的消化道肿瘤之一,结直肠癌患者实行了根治性手术后,仍会有相当一部分的患者不可避免的出现复发,术后5年生存率一直徘徊在45%-55%之间。细胞角蛋白20 （cytokertin20,CK20）是分布于外胚层起源细胞中的中间纤维丝,为细胞骨架的组成部分之一。CK20具有更为严格的上皮组织特异性。正常组织中,CK20见于肠粘膜细胞,胃粘膜及幽门腺体细胞,十二指肠粘膜细胞,泌尿系伞状细胞,表皮M erkel细胞,而其它组织均为阴性。CK20在细胞发生化生、恶变、肿瘤转移、体外培养等异常时,这种表达持续存在。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）是一种重要的肿瘤相关抗原和国际公认的肿瘤标记物,相对分子质量为180,000的胚胎性癌蛋自,广泛地存在于上皮源性恶性肿瘤组织中,在90%的胃肠道癌,60%的胰腺癌、50%的乳腺癌,70%的非小细胞肺癌中有较高的表达。目的对CEA和CK20在结直肠癌不同组织的表达及它们之间的关系做出初步研究,探讨两者与结直肠癌临床和病理之间的关系。方法采用免疫组织化学法分别检测CEA和CK20蛋白在结直肠癌患者的癌组织、癌旁组织、肠系膜淋巴结组织及正常肠粘膜组织中的表达。结果CEA和CK20蛋白在组织中的表达定位于细胞浆和细胞膜。除正常对照组为阴性外其余各组CEA蛋白均呈不同程度的表达。CEA在癌组织中的总阳性表达率为92.86%；癌旁组织组CEA的表达高于肠系膜淋巴结组。包括正常对照组在内各组CK20蛋白均有不同程度的表达,癌组织组CK20的表达高于癌旁组织组,癌旁组织组的表达高于正常对照组的表达,正常对照组的表达高于肠系膜淋巴结组。结论1、CEA在各种不同结直肠癌组织中均有不同程度的表达,正常结肠粘膜无表达。其在癌组织中的表达与肿瘤的Dukes分期有关。2、CK20在正常结肠粘膜及结直肠癌组织中均有不同程度的表达,其在癌组织中的表达与有无淋巴结转移有关。背景结直肠癌出现转移和复发与肿瘤的隐性微转移（occult micrometastases）及循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCS）密切相关,目前常用检测CTCS的技术有免疫细胞化学法、逆转录聚合酶链反应、流式细胞术等方法。由于这些方法或较费时、或程序复杂、或检查结果假阳性率高,难以推广应用于临床。已经出现一些新的方法,如实时荧光定量PCR、蛋白指纹图谱技术等。但以上的方法实验成本较高,目前还难以适应临床的实际需要,近年来,免疫传感器分析法由于其灵敏度高、选择性好和结构简单等特点而得到了越来越广泛的重视。免疫传感器是基于检测抗原-抗体结合的一种高选择性生物传感器。本实验首次采用免疫传感器分析法检测结直肠癌患者血清中CEA、CK20的表达。目的初步探讨准确性、特异性高且简便实用的CEA、CK20检测方法以期改善结直肠癌诊断及预后评估。方法分别采用酶联免疫法、实时荧光定量PCR及免疫传感器分析法序列性联合检测结直肠癌患者不同组织及外周血中CEA及CK20的表达,以探讨其在结直肠癌的诊断及预后评估中的价值。结果实时荧光定量PCR技术结合免疫传感器及ELISA等方法对结直肠癌患者外周血CEA、CK20及不同组织CEAmRNA、CK20mRNA进行检测发现：采用灵敏度较高的realtime-PCR有利于提高基因检测阳性率,尤其是外周血CEAmRNA的阳性率从57.14%提高到89.28%；Dukes A, B期的15例患者中,通过CK20的免疫组化染色发现有3例患者（74个淋巴结）有微转移,进一步检测CK20mRNA的拷贝表达发现有9例患者（155个淋巴结）有微转移；CEA和CK20免疫传感器应用于临床标本的检测结果与ELISA法比较无显着性差异,尽管灵敏度和准确性不及realtime-PCR,但特异性要强于realtime-PCR,且其阳性率还高于ELISA法,CEA和CK20免疫传感器能用于血清CEA的定量检测。结论一、改进检测方法能提高结直肠癌患者外周血CEA、CK20的阳性率,能为诊断及预后评估提供帮助。二、realtime-PCR检测肠系膜淋巴结CK20mRNA的表达对确定结直肠癌患者的分期有重要的价值,对预后的评估也有一定意义。三、首次成功建立CEA、CK20的多巴胺化学氧化原位包埋法免疫传感器,并应用于检测结直肠癌患者外周血CEA、CK20。背景决定结直肠癌患者预后的最重要指标是肿瘤的浸润深度与淋巴结转移的程度。但是,在部分实施了根治性手术的结直肠癌患者中,经病理学常规检查未发现淋巴结转移者仍会发生转移和复发,有研究认为该现象与结直肠癌淋巴结微转移有关。1992年UICC将隐匿性转移（occult metastasis）或微转移（micrometastasis, MM）限定为单个转移肿瘤细胞或转移肿瘤细胞团直径<2 mm。多数文献报告将常规组织学检查未发现转移灶而经免疫组化或分子生物学技术检测发现的淋巴结转移灶定义为淋巴结微转移。因此,淋巴结微转移目前尚无统一的标准。本研究的前面两部分实验已经证明采用免疫组化、ELISA、免疫传感器、realtime-PCR等方法检测结直肠癌患者外周血及肠系膜淋巴结中CEA、CK20及CEAmRNA、CK20mRNA,结果发现循环血液微转移灶及淋巴结微转移灶。目的探讨CEA、CK20以及CEAmRNA和CK20mRNA与微转移的关系,了解其能否成为结直肠癌分期及预后评估的有效方法。方法通过临床随访及临床应用统计学方法对两组测定值进行比较分析。结果影响预后的指标有：外周血CK20阳性率、淋巴结CK20mRNA阳性率、淋巴结CEAmRNA阳性率、术前合并梗阻或穿孔、糖尿病、肿瘤浸润深度、下切缘与肿瘤距离、送检淋巴结数目、有无淋巴结转移、术后有无化疗（p<0.05）。其中淋巴结CK20mRNA阳性率、淋巴结CEAmRNA阳性率、术前合并梗阻或穿孔、肿瘤浸润深度、下切缘与肿瘤距离是影响结直肠癌预后的独立因素,而外周血CK20阳性率、术后有无化疗、糖尿病、送检淋巴结数目则未能进入Cox多因素模型。结论采用realtime-PCR的方法检测肠系膜淋巴结的CK20mRNA表达在结直肠癌诊断及预后评估中有一定的意义和价值。
凤敏华[8]（2010）在《细胞角蛋白-20单克隆抗体制备及在大肠癌检测中的初步应用研究》文中认为目的:制备抗细胞角蛋白-20单克隆抗体,应用该抗体研究检测临床大肠癌患者外周血标本中细胞角蛋白-20的表达情况,对临床大肠癌的辅助诊断提供科学依据。方法:通过逆转录方法获得人细胞角蛋白-20的cDNA,基因扩增后将其插入原核表达载体pET28a,经酶切、测序鉴定、获得正确克隆后,将重组质粒转化BL21（DE3）细菌。在一定温度和一定浓度IPTG的诱导条件下,表达细胞角蛋白-20,用NTA-Ni柱纯化,获得细胞角蛋白-20。用细胞角蛋白-20免疫Balb/c小鼠,加强免疫后检测免疫效果,进行脾脏细胞和骨髓瘤细胞融合,筛选克隆,制备抗细胞角蛋白-20的单克隆抗体。采用ELISA和Western Blot方法对获得的单抗进行鉴定,获得特异性单抗后,用抗细胞角蛋白-20的单克隆抗体制备简易细胞角蛋白-20酶联免疫检测试剂盒。对10份正常人及40份大肠癌患者的临床血液标本进行了检测。结果:获得pET28a-CK20重组质粒,表达纯化了细胞角蛋白-20,获得了3株特异性抗细胞角蛋白-20的单克隆抗体,成功制备了简易检测细胞角蛋白-20的酶联免疫试剂盒。对10份正常人及40份大肠癌患者的临床血液标本的检测结果提示:正常人的标本呈阴性,大肠癌患者标本中有19例呈阳性,检出率为47.5%,并且均属于Dukes分级的B、C、D期,三期中的检出率分别为25%、41.7%、84.6%（3/12、5/12、11/13）。40例大肠癌患者标本组与正常对照组相比有显着的统计学差异（P<0.05）。Dukes C期、D期和A期、B期相比具有统计学差异（P<0.05）。结论:本研究在原核表达系统中成功表达和纯化了细胞角蛋白-20,成功制备了抗细胞角蛋白-20的单克隆抗体,获得3株高效价的单克隆抗体,制备了简易的检测细胞角蛋白-20酶联免疫检测试剂盒。用自制的细胞角蛋白-20酶联免疫检测试剂盒对10份正常人及40份大肠癌患者的临床血液标本进行了检测。结果提示,细胞角蛋白-20可作为除CEA肿瘤标志物外的另一个参考指标,通过检测患者外周血中的细胞角蛋白-20,可以快速检测及识别高危患者,有助于监测肿瘤发展及预后。
张波[9]（2009）在《肺癌患者血中癌细胞角蛋白20的检测》文中进行了进一步梳理目的以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测外周血肺癌细胞,以监测其血路转移情况。方法应用RT-PCR方法检测50例肺癌手术患者和70例肺癌化疗前患者外周血中细胞角蛋白20（CK20）,并以肺癌组织和非肿瘤患者外周血为对照。结果非肿瘤患者外周血中基本上无CK20检出,肺癌手术时肺动脉血中CK20检出明显升高,阳性率达54%（26/50）。晚期肺癌患者CK20表达亦较高,阳性率达40%（20/50）。结论CK20可能作为肿瘤标志物,检测外周血中的肺癌细胞及用于预测肿瘤转移复发。
熊兵红[10]（2007）在《腹腔镜结直肠癌根治术对肿瘤细胞血循环转移影响的研究》文中进行了进一步梳理第一部分腹腔镜结直肠癌根治术对血循环微转移的影响目的:检测腹腔镜结直肠癌根治术患者外周静脉血CK20mRNA的表达,探讨腹腔镜结直肠癌根治术对术后肿瘤细胞血循环微转移的影响,并探讨其临床意义。方法:应用FQ-PCR方法检测24例行腹腔镜辅助下结直肠癌根治术和31例传统开腹结直肠癌根治术患者外周静脉血的CK20mRNA,并用免疫组化（IHC）SP法测定术后组织标本的CK20和CD44 v6的表达水平。结果:TNM分期Ⅲ期结直肠癌患者外周静脉血的CK20 mRNA阳性表达率显着高于Ⅰ期+Ⅱ期患者（P<0.05）。腹腔镜辅助下结直肠癌根治术患者CK20手术开始时阳性率为29.16%（7/24）,手术结束时阳性率为37.50%（9/24）,两组之间无显着性差异（P>0.05）,手术前后和开腹组比较,无显着差异（P>0.05）。CK20mRNA阳性表达患者结直肠癌组织中CK20（57.14%）和CD44 v6（71.43%）阳性表达率明显高于CK20mRNA阴性表达患者的CK20（35.29%）和CD44 v6（47.06 %）阳性表达率（P<0.05）。结论:结直肠癌患者外周静脉血CK20mRNA的水平和组织学分级、TNM分期、淋巴结转移有关,腹腔镜结直肠癌根治术和传统开腹手术一样,并不增加外周静脉血CK20mRNA的阳性率,不增加术后肿瘤血行微转移的危险性。第二部分腹腔镜结直肠癌根治术对血循环中黏附分子的影响目的:探讨腹腔镜术对结直肠癌患者血清sCD44v6、sICAM-1和sVCAM-1各类黏附分子手术前后表达的影响及这些黏附分子水平对肿瘤细胞血行转移的影响,并探讨其在结直肠癌诊断及预后判断中的作用和临床意义。方法:采用双抗体夹心ELISA法对24例腹腔镜辅助下结直肠癌术患者和31例开腹结直肠癌术患者血清中sCD44v6、sICAM-1和sVCAM-1进行测定,比较两组结直肠癌患者手术前后sCD44v6、sICAM-1和sVCAM-1的水平变化。结果:结直肠癌患者血清中sCD44v6、sICAM-1和sVCAM-1含量明显高于正常对照组（P<0.05）。结直肠癌低分化组sCD44v6、sICAM-1和sVCAM-1含量与高中分化组无明显差异（P>0.05）。淋巴结转移组sCD44v6、sICAM-1和sVCAM-1含量比淋巴结未转移组增加,有显着性意义（P<0.05）。Ⅲ期的sCD44v6、sICAM-1和sVCAM-1含量均明显高于Ⅰ期+Ⅱ期（P<0.05）。腹腔镜结直肠癌组中,sCD44v6、sICAM-1和sVCAM-1含量在手术前后均无明显差异（P>0.05）,和开腹组手术前后比较,也无明显差异（P>0.05）。结论: sCD44v6、sICAM-1和sVCAM-1含量与结直肠癌的分化程度无关,但与TNM分期、有无区域淋巴结转移及远处转移等有关。sCD44v6、sICAM-1和sVCAM-1在结直肠癌的发病过程中具有重要作用,并可以作为结直肠癌诊断、预后判断、病情变化的监测指标之一。腹腔镜结直肠癌手术不促进肿瘤细胞黏附分子的表达,不增加结直肠癌细胞转移的趋势。
二、肺癌患者血中癌细胞角蛋白20的检测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肺癌患者血中癌细胞角蛋白20的检测（论文提纲范文）
（1）桔梗皂苷D基于JNK/PUMA通路诱导非小细胞肺癌凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 化痰法在肺癌治疗中的研究及应用 |
| 1 中医理论中“痰”的概念 |
| 2 痰与肺癌的关系 |
| 3 化痰法的理论内涵 |
| 4 化痰法在肺癌治疗中的应用 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 JNK/PUMA在调控肺癌细胞凋亡方面的研究进展 |
| 1 细胞凋亡的机制 |
| 2 JNK信号通路 |
| 3 PUMA与凋亡 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一: 肺瘤平膏(化痰组)含药血清对非小细胞肺癌细胞H1299的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二: 桔梗皂苷D对非小细胞肺癌细胞H1299、H2030、A549杀伤能力的研究 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三: 桔梗皂苷D对非小细胞肺癌凋亡的调节作用 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四:桔梗皂苷D对非小细胞肺癌JNK/PUMA通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验五:桔梗皂苷D通过作用于JNK1调控H1299细胞JNK/PUMA通路 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验六:桔梗皂苷D通过转录因子AP-1调控H1299细胞凋亡 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验七:桔梗皂苷D对非小细胞肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验八:桔梗皂苷D对非小细胞肺癌荷瘤小鼠肿瘤增殖与凋亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（3）Cathelicidin依赖P2RX7受体抑制结肠癌转移的作用及分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :Cathelicidin抑制结肠癌肝、肺转移的作用研究 |
| 1前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养与传代 |
| 2.2.2 人结肠癌细胞HT-29、SW620的冻存 |
| 2.2.3 细胞计数方法 |
| 2.2.4 细胞活性实验 |
| 2.2.5 细胞迁移和侵袭实验 |
| 2.2.6 Trizol法提RNA |
| 2.2.7 探针法q RT-PCR |
| 2.2.8 免疫组化 |
| 2.2.9 微管蛋白绿色荧光染色 |
| 2.2.10 慢病毒转染 |
| 2.2.11 酶联免疫反应 |
| 2.2.12 裸鼠结肠癌转移瘤模型建立 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 Cathelicidin抑制结肠癌细胞迁移 |
| 3.2 Cathelicidin过表达降低裸鼠肝、肺组织内Cytokeratin18的表达 |
| 3.3 Cathelicidin过表达降低裸鼠肝、肺组织内Keratin20 m RNA的表达 |
| 3.4 Cathelicidin破坏细胞骨架 |
| 3.5 Cathelicidin抑制微管蛋白TUBB3 m RNA表达 |
| 3.6 TUBB3过表达逆转Cathelicidin对细胞迁移的抑制作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :Cathelicidin抑制结肠癌转移的机制研究 |
| 1前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养与传代 |
| 2.2.2 细胞冻存 |
| 2.2.3 细胞计数方法 |
| 2.2.4 细胞活性实验 |
| 2.2.5 细胞迁移实验 |
| 2.2.6 Trizol法提RNA |
| 2.2.7 探针法q RT-PCR |
| 2.2.8 免疫组化 |
| 2.2.9 微管蛋白绿色荧光染色 |
| 2.2.10 细胞转染 |
| 2.2.11 裸鼠结肠癌转移瘤模型建立 |
| 2.2.12 结肠癌TNM分期标准 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 FPRL1和P2RX7受体在正常肠组织及结肠癌组织表达 |
| 3.2 P2RX7受体拮抗剂KN62逆转LL-37对细胞迁移的抑制 |
| 3.3 P2RX7受体拮抗剂KN62逆转Cathelicidin对细胞骨架微管蛋白的破坏 |
| 3.4 Cathelicidin通过P2RX7受体抑制TUBB3的表达 |
| 3.5 Cathelicidin通过P2RX7受体抑制结肠癌转移 |
| 3.6 Cathelicidin通过P2RX7抑制微管蛋白表达,抑制结肠癌转移 |
| 3.7 Cathelicidin通过P2RX7受体抑制结肠癌生长 |
| 3.8 Cathelicidin通过P2RX7受体增加结肠癌细胞mi R200c-3p的表达 |
| 3.9 Cathelicidin通过mi R200c-3p抑制微管蛋白表达,抑制结肠癌细胞迁移 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究的创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）MicroRNA-613靶向ATOH1调控结肠癌生物学功能的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 结肠癌组织中miR-613的表达及生物学功能 |
| 一 研究背景 |
| 二 研究方法 |
| 三 研究结果 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 miR-613 靶向抑制ATOH1 的表达及ATOH1 对结肠癌预后价值的探究 |
| 一 研究背景 |
| 二 研究方法 |
| 三 研究结果 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ATOH1 抑制miR-613 对结肠癌细胞的促进作用 |
| 一 研究方法 |
| 二 研究结果 |
| 三 讨论 |
| 四 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 体内试验验证miR-613 靶向ATOH1 对结肠癌进展的影响 |
| 一、研究方法 |
| 二 研究结果 |
| 三 讨论 |
| 四 结论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 综述 MicroRNA在结直肠癌诊断和治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 缩略词表 |
| 附件 |
| 致谢 |
（5）CK20在胃癌患者外周血、淋巴结中的表达及其对预后的预测价值（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 荧光定量PCR法检测胃癌微转移可行性研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 胃癌组织中CK20的表达及意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 荧光定量PCR检测胃癌患者外周血中CK20表达及其临床意义 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 CK20蛋白及基因在胃周淋巴结中的表达及其临床意义 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 胃癌微转移的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间公开发表的论文及科研成果 |
| 致谢 |
（6）细胞角蛋白在结直肠癌浸润与转移的临床研究（论文提纲范文）
| 缩略词中英文对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 试剂药品 |
| 1.2 PCR扩增引物序列 |
| 1.3 主要实验设备与仪器 |
| 1.4 实验对象选择及标本收集 |
| 1.5 RT-PCR实验 |
| 2 研究内容 |
| 3 数据统计分析方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（7）CEA及CK20的不同检测方法对结直肠癌诊断及预后评估的初步探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 免疫组化法测CEA及CK20在结直肠癌组织中的表达及其意义 |
| 第一章 材料与方法 |
| 第二章 结果 |
| 第三章 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 ELISA、realtime-PCR及免疫传感器检测CEA、CK20在结直肠癌的表达及其意义 |
| 第一章 酶联免疫法和实时荧光定量PCR检测CEA、CK20在结直肠癌患者血清及癌组织中的表达 |
| 第二章 多巴胺化学氧化原位包埋法免疫传感器检测结直肠癌患者上周血CEA、CK20 |
| 第三章 结论 |
| 第三部分 CEA、CK20与结直肠癌的诊断及预后评估的临床研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要研究成果 |
（8）细胞角蛋白-20单克隆抗体制备及在大肠癌检测中的初步应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 pET28a-CK20 重组质粒的构建及CK20 蛋白表达 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 抗CK20 单克隆抗体的制备 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 抗CK20 单克隆抗体在大肠癌检测中的应用 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 细胞角蛋白 20 在大肠癌检测中的应用 |
| 攻读硕士学位期间公开发表的论文 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（9）肺癌患者血中癌细胞角蛋白20的检测（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 1.1 样本来源 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物合成 |
| 2.2 样本处理 |
| 2.3 应用巢式PCR扩增CK20 |
| 3 结果 |
| 3.1 CK20在肺癌组织和非肿瘤患者外周血中RT-PCR扩增 |
| 3.2 肺癌患者肺动脉及外周血中CK20的表达 |
| 3.2.1 50例肺癌手术中肺动脉血标本中CK20阳性26例, 占52%。 |
| 3.2.2 在70例肺癌患者外周血标本中CK20阳性有24例, 占34%。 |
| 4 讨论 |
（10）腹腔镜结直肠癌根治术对肿瘤细胞血循环转移影响的研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文：腹腔镜结直肠癌根治术对肿瘤细胞血循环转移影响的研究 |
| 前言 |
| 第一部分：腹腔镜结直肠癌根治术对血循环微转移的影响 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分：腹腔镜结直肠癌根治术对血循环中黏附分子的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表文章及参与科研情况 |
四、肺癌患者血中癌细胞角蛋白20的检测（论文参考文献）
- [1]桔梗皂苷D基于JNK/PUMA通路诱导非小细胞肺癌凋亡的机制研究[D]. 陈顺泰. 北京中医药大学, 2021(01)
- [2]肺癌患者外周血CK20 mRNA LUNX mRNA表达与肺癌微转移的相关性[J]. 赵亚娟,杜帅格,路琳君,郭姝君. 临床心身疾病杂志, 2020(03)
- [3]Cathelicidin依赖P2RX7受体抑制结肠癌转移的作用及分子机制[D]. 王佳妮. 中国医科大学, 2020(01)
- [4]MicroRNA-613靶向ATOH1调控结肠癌生物学功能的机制研究[D]. 杨轩璇. 苏州大学, 2019(06)
- [5]CK20在胃癌患者外周血、淋巴结中的表达及其对预后的预测价值[D]. 尤小兰. 苏州大学, 2016(05)
- [6]细胞角蛋白在结直肠癌浸润与转移的临床研究[D]. 娄颖博. 安徽医科大学, 2016(10)
- [7]CEA及CK20的不同检测方法对结直肠癌诊断及预后评估的初步探讨[D]. 龚学军. 中南大学, 2010(11)
- [8]细胞角蛋白-20单克隆抗体制备及在大肠癌检测中的初步应用研究[D]. 凤敏华. 苏州大学, 2010(01)
- [9]肺癌患者血中癌细胞角蛋白20的检测[J]. 张波. 中国现代药物应用, 2009(22)
- [10]腹腔镜结直肠癌根治术对肿瘤细胞血循环转移影响的研究[D]. 熊兵红. 重庆医科大学, 2007(02)