Marc-145细胞的低血清驯化及感染猪繁殖与呼吸综合征病毒后细胞自噬特性评价

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）为高致死性传染病,自2006年在我国爆发至今,已持续对我国养猪业造成巨大成经济冲击。作为提倡强制疫苗免疫的国家,我国每年对PRRS疫苗的需求量十分巨大。为优化PRRS疫苗的生产工艺,降低生产成本,本研究对Marc-145细胞的低血清培养工艺进行了探索,对在低血清培养环境下猪繁殖与呼吸综合征病毒（RPRSV）增殖情况、感染PRRSV后细胞自噬进行探究。采用逐步降血清法对Marc-145细胞进行低血清培养的驯化,以血清添加量为变量,设置浓度:10%、8%、6%、4%、2%、1%、0%,对Marc-145细胞进行低血清培养驯化。经过连续18次传代,发现Marc-145细胞能适应的最低血清添加量为1%。通过测定细胞活率、计算细胞倍增比,发现1%血清添加量下的Marc-145细胞状态良好,至此成功得到了能稳定传代的血清添加量为1%的Marc-145细胞。为探究低血清条件下Marc-145细胞内PRRSV增殖质量,进行了PRRSV接种,通过实时荧光定量PCR方法对病毒增殖进行测定,绘制病毒生长曲线;测定PRRSV的TCID50,查看低血清培养下病毒毒力情况。利用电子显微镜对感染PRRSV后Marc-145细胞内自噬小体进行观察,对不同培养环境下细胞自噬情况进行初步判断;而后通过荧光定量PCR方法对关键的自噬相关基因Beclin1、ATG5、ATG12转录量进行测定,进一步探究细胞自噬水平情况。结果发现,感染PRRSV后,低血清培养下的Marc-145细胞维持时间更长,病毒含量更高,增殖峰较常规血清培养下提前约12h,但病毒滴度变化不明显。在感染PRRSV后的36h时,不同培养条件下的Marc-145细胞内均观察到明显的自噬小体,说明在感染PRRSV后细胞均发生了自噬。在对Beclin1、ATG5、ATG12自噬基因的转录水平测定时发现低血清培养的Marc-145细胞较常规血清培养而言自噬相关基因的转录量均升高,提示低血清环境下PRRSV感染后细胞自噬加强,但这种自噬进程并不影响病毒增殖,反而对复制有利。本研究对Marc-145细胞的培养条件进行了探究,实现了细胞的低血清培养,阐明了低血清环境下PRRSV的培养特性及细胞自噬情况,为PRRSV疫苗的生产和研发、PRRSV与细胞自噬相关研究提供参考与思路。

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李小璟

导师: 徐志文,陈斌

关键词: 低血清培养,自噬

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 四川农业大学

分类号: Q25

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000830

总页数: 61

文件大小: 2611k

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