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肺炎克雷伯氏菌发酵菊糖产2,3-丁二醇的研究

2020-12-10阅读(296)

肺炎克雷伯氏菌发酵菊糖产2,3-丁二醇的研究

论文摘要

随化石燃料地日益枯竭,利用生物法制备2,3-丁二醇的方式备受重视,其中利用非粮作物菊芋代替葡萄糖作为发酵碳源用于生物合成2,3-丁二醇是一个重要的研究方向,但菊芋块茎中的菊糖较难被微生物直接利用导致产物产量及生产强度较低,因此筛选合适的菌株、合理的优化发酵工艺对于以菊糖为主要碳源进行生物法制备2,3-丁二醇的整个过程至关重要。首先,本实验筛选到一株能直接转化菊糖产2,3-丁二醇的单菌。固体培养时菌落形成时间短,表面光滑呈半球态,菌落较粘易形成拉丝,为革兰氏阴性菌,经16S rRNA鉴定确定其为肺炎克雷伯氏菌并命名为Klebsiella pneumoniae DL-H3。然后,考察了菌种DL-H3所产菊粉酶的催化性能和影响因素。菌种DL-H3所产菊粉酶主要位于胞内,是一种外切型菊粉酶,其适宜的催化条件为pH 6.0、30℃、以含2%菊糖的缓冲液为底物反应30 min,发现各金属离子中K+与Mn2+对于菊粉酶的催化反应促进作用最强,各类试剂中琥珀酸与乙酸能抑制菊粉酶使其丧失活力,10种常见氮源中硫酸铵的添加使菌种DL-H3的总糖利用率达到最大值77.68%。其次,对菊糖无法完全被利用的原因进行了研究。在培养基与培养条件的优化下（pH6.5、搅拌速率200 r/min、通气速率0.2 vvm、块茎浸提液中添加16.53 g/L硫酸铵）总糖利用率达到86.98%,比未优化时提高20%左右,随发酵的进行发酵液中菊糖的平均聚合度由初始的2.82增大到结束时的8.08,菌种DL-H3所产的菊粉酶在发酵过程中能一直保持较高酶活,残糖中菊糖未被降解与利用的原因可能是随发酵的进行短链菊糖优先被摄取与利用,长链菊糖逐渐积累但无法被菌种DL-H3摄取进入细胞,阻断了酶解反应的发生,导致菊糖无法被完全利用。再次,通过对菊糖先进行预处理再发酵的策略实现了菊糖的完全利用。使用硫酸调节发酵液的初始pH至3.00再进行高温灭菌,实现了菊糖的部分降解。经预处理后的绝大部分菊糖能被利用,并且菌种DL-H3具备耐受高浓度底物进行批次发酵的能力。通过优化供氧条件,菌种DL-H3在pH 6.0、搅拌速率250 r/min、通气速率0.2 vvm、202.55g/L的底物浓度条件下进行批次发酵,目标产物（2,3-丁二醇+乙偶姻）的产量达80.83 g/L,转化率为0.426 g/g,生产强度为2.23 g/（L*h）,具备工业化生产的潜质。最后,利用乙酸乙酯/磷酸氢二钾体系对2,3-丁二醇和乙偶姻的分离进了研究,发现该体系更适合分离乙偶姻,在利用该体系对菌种DL-H3所产发酵液中2,3-丁二醇进行盐析萃取时,发酵液中杂质多导致乳化现象严重使得萃取效果差。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 引言
  • 1 文献综述
  •   1.1 2,3-丁二醇
  •     1.1.1 2,3-丁二醇的理化性质
  •     1.1.2 2,3-丁二醇的应用
  •     1.1.3 2,3-丁二醇的制备
  •   1.2 发酵底物
  •     1.2.1 菊芋
  •     1.2.2 菊芋资源的开发与利用
  •     1.2.3 菊糖
  •   1.3 微生物
  •     1.3.1 产2,3-丁二醇微生物
  •     1.3.2 产菊粉酶微生物
  •     1.3.3 一步发酵菊糖产2,3-丁二醇微生物
  •   1.4 2,3-丁二醇的代谢调控
  •     1.4.1 2,3-丁二醇的代谢途径
  •     1.4.2 2,3-丁二醇的代谢调控
  •   1.5 本课题研究思路
  •     1.5.1 本课题的研究意义
  •     1.5.2 本课题的研究内容
  • 2 目标微生物的筛选与发酵性能研究
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验材料与仪器
  •     2.2.1 实验试剂
  •     2.2.2 实验仪器
  •     2.2.3 用于微生物筛选的样品来源
  •     2.2.4 菊芋块茎来源
  •     2.2.5 培养基
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 筛选能一步发酵菊糖产2,3-丁二醇的微生物
  •     2.3.2 摇瓶实验
  •     2.3.3 发酵罐实验
  •     2.3.4 分析方法
  •   2.4 结果与讨论
  •     2.4.1 目标微生物的筛选
  •     2.4.2 摇瓶实验对发酵条件的初步摸索
  •     2.4.3 发酵罐实验
  •   2.5 小结
  • 3 DL-H3所产菊粉酶的特性研究
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验材料与仪器
  •     3.2.1 实验试剂
  •     3.2.2 实验仪器
  •     3.2.3 实验菌种
  •     3.2.4 培养基
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 菌体富集培养
  •     3.3.2 发酵罐实验
  •     3.3.3 菊粉酶的特性研究
  •     3.3.4 分析方法
  •   3.4 结果与讨论
  •     3.4.1 DL-H3所产的菊粉酶的基本性质
  •     3.4.2 影响菊粉酶酶活的因素
  •     3.4.3 发酵罐实验
  •   3.5 小结
  • 4 2,3-丁二醇发酵工艺的优化
  •   4.1 引言
  •   4.2 实验材料与仪器
  •     4.2.1 实验试剂
  •     4.2.2 实验仪器
  •     4.2.3 实验菌种
  •     4.2.4 培养基
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 摇瓶实验
  •     4.3.2 发酵罐实验
  •     4.3.3 菊粉酶的获取与检测方法
  •     4.3.4 发酵液的预处理
  •     4.3.5 2,3-丁二醇盐析萃取的方法
  •     4.3.6 分析方法
  •   4.4 结果与讨论
  •     4.4.1 发酵条件的优化
  •     4.4.2 菊糖的预处理
  •     4.4.3 批次发酵
  •     4.4.4 2,3-丁二醇的盐析萃取
  •   4.5 小结
  • 结论
  • 展望
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 关文天

    导师: 戴建英

    关键词: 肺炎克雷伯氏菌,菊粉酶,菊糖,丁二醇,预处理

    来源: 大连理工大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,一般化学工业

    单位: 大连理工大学

    分类号: TQ923

    DOI: 10.26991/d.cnki.gdllu.2019.001160

    总页数: 84

    文件大小: 8802K

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