李卓[1]2003年在《经静脉声学造影间歇二次谐波成像诊断移植肾急性排斥反应的实验研究》文中研究指明目的 (1)应用经静脉声学造影间歇二次谐波成像(SHCI)结合声学定量(AD)技术评价正常移植肾血流灌注的可行性。(2)通过评价急性排斥反应(急排)移植肾血流灌注情况探讨经静脉声学造影间歇二次谐波成像对移植肾急排的诊断价值。(3)比较分析应用间歇二次谐波成像结合声学定量(AD)方法与彩色多谱勒血流显像(CDFI)测量阻力指数方法，探讨声学造影对移植肾急性排异反应的诊断价值。 方法 健康杂种犬15只，雌雄不限，体重(15.5±2.7)kg，将其中五只犬的左、右肾分别移植给另10只犬，供、受体均采用3％的戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉，活体取肾时热缺血时间短于4分钟，冷缺血时间短于1小时。采用自身做前后对照，术后密切观察血Cr指标，术后3d内血Cr值及尿量基本正常，作为正常组。于第4-5天，尿量减少，Cr值迅速升高，行粗针肾实质活检，病理证实移植肾发生急性排斥反应，这时的犬作为急性排斥组(急排组)。成功建成犬急性排异反应模型8例(2例失败，一例出现急性肾小管坏死，一例发生超急排)。HP5500型超声诊断仪；L7540探头(频率4～10MHz)和S4探头(频率2～4MHz)，谐波成像方式(发射频率2.1MHz，接收频率4.2MHZ)，每次实验保持机械指数、压缩和时间增益补偿等条件不变，采用系统间隔时间触发，采集T-INT数据，设定为1000毫秒。移植术后第一天起，每天进行CDFI检查及经静脉声学造影间歇二次谐波成像及声学定量，并在其接受超声检查前后24h内，第一军医大学硕士月开究生学位论文测定动物模型血清肌醉(Cr)和尿素氮(BUN)。犬取仰卧位，于右侧骼窝取得满意的移植肾切面，然后显示肾脏彩色血流图像，用脉冲多谱勒在小叶间动脉取样，声束与血流方向夹角小于60“显示多谱勒频谱，并储存于磁光盘备测。仪器设定切换为声学密度测定(acousticdensit。metry，AD)状态，54探头(频率2一互MHz)，谐波成像方式(发射频率2.IMHz，接收频率4.ZMHZ)，在皮质显示清晰时，经静脉按0.02ml/kg体重团注全氟显，进行移植肾声学造影，接之以10ml生理盐水冲刷管腔，在AD T-INT模式下采集图像，并存入磁光盘备析。图像分析;(l)选频谱轮廓清晰停帧，在获取形态基本一致的频谱后测量收缩期最大血流速度(S)、舒张期最低血流速度(D)及平均速度(TAV)，电脑自动计算出移植肾的血管阻力指数。(2)启用HP SonoS 5500型超声诊断仪AD定量分析软件，回放所需图像，置ROI取样框(4 1 x41)与肾皮质内(同一分析过程中保持不变)测定皮质平均强度，减去皮质本底强度，得到平均强度增强值，选择Y函数拟合方式，拟合出皿C时间一强度曲线 (Time一工ntensity eurve，Tle)参数，并自动计算出以下参数值:皮质的峰值强度(Peak Intensity，Pl)，灌注曲线下面积(Area Under theCurve，AUC)。降支减半时间(Half time of Deseent，HT)、平均通过时IhJ(Mean一Transit time，MTT)。 结果(1)正常移植肾组TIC参数于造影前后均有变化，PI、AUC和HT于造影后均明显高于造影前(P<0.01)，而MTT于造影前后未见显着差异。造影前时间强度曲线均近于基线水平，造影后迅速升高达峰值而后逐渐下降至造影前水平。(2)正常组和急排肾组TIC参数比较;造影后急排肾组较正常移植肾组H、Auc明显下降(P<0.01)，而HT和MTT未见明显差异(P>0.05)。，急排肾组峰值明显低于正常移第一军医大学不员d匕毛开究生学位创势文植肾组。(3)PI、AUC、RI分别与Cr间存在相关关系，r值分别为0.972，0.978，0.708;经两相关系数U检验，PI一Cr，AUC一Cr相关程度较RI一Cr相关程度高。 结论声学造影对移植肾的监测，显着提高了对移植肾在组织结构和微循环方面的认知程度，并改善了肾脏的声学图像，对肾脏的血流灌注也逐渐从定性走向定量研究(1)本实验初步表明经静脉声学造影间歇二次谐波显像技术结合声学定量技术是观测异体移植肾血流灌注的有效检测手段。(2)此种方法所获得的TIC参数对定量估测异体移植肾排斥的发生有较高的价值。(3)此方法较彩色多谱勒方法所获得的RI与移植肾急排的发生相关关系更为密切。对移植肾术后急排的诊断有着良好的应用前景。
叶艺[2]2004年在《经静脉声学造影定量观察移植肾并发症血流灌注实验研究》文中研究指明背景： 一直以来，超声对移植肾并发症的诊断多依赖于其二维声像图所显示的形态和回声强度的变化，对肾脏血流灌注的评价也仅靠测定肾血管阻力及血流流速来加以判断。近几年来，新型声学造影剂及相关成像技术的研究取得了长足进展，从而使超声能够更加有效、直观地评价组织器官的血流灌注情况。本研究建立犬同种异体肾移植模型，经手术控制产生肾移植并发症：急性排斥、急性肾小管坏死，联合应用间歇触发成像和超谐波成像技术结合近年来发展起来的声学密度定量技术，观察移植肾急性排斥和急性肾小管坏死发生前后肾皮质血流灌注的超声表现，对照病理检查结果，探讨该方法用于肾移植并发症鉴别诊断的可行性。 目的： 1．应用经静脉声学造影(ICU)、声学密度定量(AD)和间歇触发成像超谐波(IUHI)成像技术结合肾脏显微镜下病理检查结果，定量评价移植肾急性排斥发生前后血流灌注变化。 2．应用ICU、AD和(IUHI)技术结合肾脏显微病理检查结果定量评价肾脏显微病理检查结果移植肾急性肾小管坏死发生前后血流灌注变化。 3．对比分析声学造影移植肾急性排斥和急性肾小管坏死血流灌注变化特点，探讨该方法对移植肾并发症鉴别诊断的可能性。 方法: 1.建立肾移植并发症动物(实验犬)模型 2.超声实验:采用HP Sonos5500型彩色多普勒超声仪，采用自身对照法，以术后15分钟内超声检查所见为对照指标，常规术后每天各检查一次直至动物死亡或移植肾皮质无造影剂灌注时终止实验。 ①常规超声检查选用C3540探头，频率2.1一4.2MHz，对移植肾进行常规二维超声和DoPPler检查并测定移植肾大小，各级肾动脉血流速度及RI。 ②超谐波声学造影测量移植肾皮质血流灌注。 声学造影剂及剂量:采用全氟丙烷白蛋白气体微泡造影剂，微泡直径2.0一5.伽m，浓度i.oxiog一2.oxiog/ml，pH值6.4一7.4。造影剂经外周静脉弹丸式注射，剂量为0.03ml瓜g，重复3次。每次注射后立即尾随注入2ml生理盐水冲洗，重复注射应每次间隔大于15min. 造影方法:采用彩色多谱勒超声(HP Sonos 5500型)53探头，频率1.0一3.OMHz，选定移植肾最大长轴切面，探头固定，启动超谐波造影程序，选1.3/3 .6MHz谐波成像频率:启动Trigger功能，触发成像(即瞬间反应成像)，每隔30(刃ms成像一帧。机械指数设置<0 .6，减低二维图像增益至仅能清楚显示移植肾，造影前、后仪器设置条件不变。造影剂经静脉注射后，观察移植肾区域灰度变化及血管显影情况，同时启动L00p程序，动态记录所有图像资料并存贮于仪器内置磁光盘中，供后期分析。 ③分析方法: 视觉造影效果:造影前后后显像效果判定声学定量:调出存贮的造影图像资料，应用AD软件进行定量分析，将(2lX21像素)半月形取样框分别置于移植肾皮质(距包膜3llun以内)进行叁点取样后取均值测定:造影剂灌注峰值(P工)、灌注曲线下面积(AUC)、降支减半时间(HT)、平均通过时间(MTT)、取样间期(51)。 ④统计学分析:测值以均数士标准差表示，组间比较应用t检验。 结果: 1.本研究发现移植肾急性肾小管坏死时二维及CDFI示移植肾大小无明显改变，RI值在正常值范围内波动。而TIC曲线各参数中PI下降2.1%，AUC下降42.4%，HT下降44.9%，MTT下降31.6%，皮质与皮髓质交界部AUC值比率下降27%。除PI值外，AUC、HT、MTT、皮质与皮髓质交界部AUC值比率均明显降低。 2.急性排斥开始发生，显微病理示肾小管上皮细胞崩解，间质内见红细胞，提示急性排斥早期肾小管内皮损伤。移植肾形态增大，CDFI示血流信号尚丰富，小叶间动脉RI值虽逐渐升高，但未超过0.70，皮质部造影剂灌注稍减少，TIC曲线降低，以AUC减少明显，提示微循环血流灌注减少，PI值稍有改变;重度急性排斥时显微病理示，小动脉内皮炎、小动脉血栓形成，满视野红细胞。移植肾形态肿胀，皮质未见血流信号，未见造影剂灌注，TIC曲线接近低平，各参数显着降低。声学造影nC曲线及参数变化与急性排斥的病理变化一致。 3、回顾本研究，对比分析急性排斥与急性肾小管坏死声学造影特点，急性排斥与急性肾小管坏死早期均可见仅有AUC明显降低，而其他参数无显着变化的共同表现。但是，急性排斥发生时间晚于急性肾小管坏死，急性肾小管坏死发生于术后1天内，而急性排斥多发生在术后3一6天。急性肾小管坏死血流灌注变化趋势应为术后第1天开始Pl、AUC逐渐降低达到其最低值，随后，Pl、AUC开始升高，至基本恢复正常;随着急性排斥的逐渐加重，PI、AUC进行性降低，直至TIC曲线接近低平。 结论: 对比常规超声检查，超谐波声学造影可直观反映移植肾急性肾小管坏死、急性排斥的血流灌注，时间一强度曲线及相关参数可评估移植肾早期急性肾小管坏死血流灌注，及时定量反映急性排斥不同阶段血流灌 一8-注变化。我们初步获得的研究结果提示:声学造影技术用于鉴别移植肾急性排斥、急性肾小管坏死血流灌注异常可行。应进一步扩大实验样本量，建立超谐波声学造影定量指标，为?
罗晓莉[3]2009年在《超声造影评价大鼠肾脏冷缺血—再灌注损伤及肾移植急性排斥反应血流灌注的实验研究》文中进行了进一步梳理实验一超声造影评价大鼠肾脏冷缺血-再灌注损伤血流灌注的实验研究目的研究应用超声造影(contrast-enhanced ultrasound, CEUS)技术定量测定大鼠肾脏冷缺血-再灌注损伤(cold ischemia-reperfusion injury, CIRI)肾脏不同解剖区域的血流灌注,分析并判断肾内血流动力学指标与血清肾功能、急性肾小管坏死(acute tubular necrosis, ATN)病理损伤程度的相关性,探讨CEUS在ATN诊断上的应用价值。研究方法封闭群SD雄性大鼠假手术组(sham-surgery group, SSG)、肾冷缺血-再灌注损伤组(cold ischemia-reperfusion injury, CIRI)各5只于术后第1、3、7天进入实验(每组共15只)。在充分麻醉状态下行左颈静脉插管,造影剂选用声诺维TM(SonoVueTM),输注方式为经颈静脉连续注射,输液速度为0.8 ml. kg-1. min-1。采用Philips IU22型彩色超声诊断仪,选用脉冲反相谐波成像(pulse inversion harmonic imaging)技术,经左侧腹壁行左肾超声造影并存储动态图像,脱机后用QLAB分析软件进行分析。皮质感兴趣( region of interest, ROI)放置于与声束垂直的正对肾门处肾脏包膜下皮质区,髓质部分ROI放置在与肾门处对侧肾实质区中段髓质的外髓层和内髓层,经One Minus Exp曲线拟合,软件以指数方程Y =A (1 - e-βt )自动生成造影剂微泡声学强度随时间变化的曲线,获得肾脏皮质血流(renal cortical blood flow, RCBF)、外髓层血流(renal outer medullary blood flow, ROMBF)、内髓层血流(renal inner medullary blood flow, RIMBF)的参数:峰值声学强度( peak signal intensity, A);造影剂灌注速率(signal velocity,β);根据公式计算出感兴趣区局部肾组织血流量(regional renal blood flow): A×β。CEUS检查完毕,开腹,经后腔静脉抽取血液行血清肾功能检测,摘取肾脏,放血处死大鼠。肾组织经固定后行HE染色,光镜下行肾小管坏死病理评分。统计分析CIRI大鼠肾内血流动力学的变化及其与血清肾功能、病理肾小管坏死程度的相关性。结果SSG组与CIRI组实验大鼠同组之间不同时间点、两组之间对应时间点之间比较血流参数A值均无显着差异(P﹥0.05);SSG组术后第1天肾皮质、外髓层血流量偏低,但与第3、7天比较均无显着差异(P﹥0.05),β值与第3、7天血流量比较有显着差异(P﹤0.05),第1、3、7天血清肾功能指标、病理肾小管坏死积分比较均无显着差异(P﹥0.05)。CIRI组术后第1天肾皮质、外髓层、内髓层血流量均明显减低,血流量的减少主要是速度指标β值的减低所致,其中肾皮质血流量与SSG组比较有显着差异(P﹤0.01)。CIRI组术后第3天肾皮质血流开始恢复,外髓层与内髓层血流量未见明显改善,肾皮质、外髓层、内髓层血流量仍显着低于SSG组(P﹤0.01);术后第7天CIRI组肾皮质、外髓层、内髓层血流全面恢复正常,与SSG组比较无显着差异(P﹥0.05)。与之相对应,CIRI组术后第1天与第3、7天比较血清肾功能指标SCr、BUN以及病理肾小管坏死积分(tubular necrosis score, TNS)均显着高,与SSG组第1天比较差异非常显着(P﹤0.01);第3天肾功能指标SCr、BUN以及病理肾小管坏死积分逐渐降低,但与SSG组比较差异仍非常显着(P﹤0.01);第7天降低至正常,与SSG组比较无显着差异(P﹥0.05)。经统计相关分析CIRI大鼠血清SCr、BUN及病理肾小管坏死积分与皮质、外髓层、内髓层血流参数A值均无显着相关关系(P﹥0.05);血清肾功能指标SCr、BUN及病理肾小管坏死积分与超声造影肾皮质、外髓层、内髓层血流参数均成负相关,其中以与皮质血流参数β、A×β相关性最好。结论肾脏冷缺血-再灌注损伤肾皮质、髓质血流均明显减少,在随后肾组织损伤修复过程中肾皮质血流早于髓质率先恢复;肾冷缺血-再灌注损伤肾血流量的变化主要是由于血流灌注速度β值的变化所致;超声造影血流灌注参数β、A×β均为评价肾冷缺血-再灌注损伤血流灌注的敏感指标。实验二超声造影评价大鼠肾移植急性排斥反应血流灌注的实验研究目的研究应用超声造影技术定量检测肾移植术后急性排斥反应(acute rejection, AR)肾内不同解剖区域血流灌注的变化,动态、全面了解AR早期病理演变过程,探讨肾移植术后AR肾血流动力学变化特点及CEUS的诊断价值。研究方法同基因(Isograft)组与异基因(Allograft)组肾移植大鼠各3只于术后第1、3、7天进入实验(每组共9只)。超声检查方法、血清肾功能指标测定同实验一。离体肾组织经固定后行常规HE染色、特殊染色(马松叁色染色、过碘酸雪夫染色、六胺银染色)及透射电镜下超微结构的观察,依据Banff 2007诊断标准进行肾移植术后AR的诊断,统计分析Isograft组与Allograft组、急性排斥反应与非急性排斥反应大鼠肾内血流动力学的变化及其与血清肾功能、急性排斥反应Banff病理诊断分级的相关性。结果Allograft组与Isograft组术后第1天大鼠肾皮质、外髓层、内髓层血流均明显减少,两组比较超声造影血流参数A、β、A×β值均未见显著差异(P﹥0.05)。术后第3天Isograft组皮质血流开始改善,至术后第7天肾皮质、外髓层、内髓层血流均改善明显,β、A×β值与第1、3天比较有非常显着差异(P﹤0.01),但A值1、3、7天叁个时间点之间比较均未见显着差异;而Allograft组术后第3天肾皮质、外髓层、内髓层血流均逐渐降低,表现为A、β、A×β值均减少,第7天显着减少,与第1、3天比较有差异非常显着(P﹤0.01)。与Isograft组比较,Allograft组术后第3天肾皮质、外髓层血流参数A、β、A×β值及内髓层血流参数A×β值均显著降低(P﹤0.05);第7天肾皮质、外髓层、内髓层血流参数A、β、A×β值均降低非常显著(P﹤0.01)。血清肾功能指标SCr、BUN术后第1天Allograft组与Isograft组比较无显着差异(P﹥0.05),术后第3、7天Isograft组大鼠血清SCr、BUN逐渐降低,Allograft组显着增高,两组比较均差异非常显着(P﹤0.01)。HE及特殊染色Isograft组在1、3天可见不同程度的肾小管坏死,第7天基本恢复正常,未见明显的淋巴细胞浸润和血管炎症;Allograft组肾移植术后3天肾小管间质和肾小球旁、小动脉周围淋巴细胞灶性浸润,Banff诊断分级为急性细胞性排斥反应IA- IB级;移植后7天间质炎性细胞浸润明显增多,肾小球Bowman囊囊壁增厚,肾小管、小动脉淋巴细胞浸润,肾小动脉外膜结缔组织增生,管壁增厚,Banff诊断分级为急性细胞性排斥反应Ⅱ-Ⅲ级,未见明显体液性排斥反应。电镜下Isograft组肾组织超微结构未见明显异常,Allograft组术后第3天肾小管上皮细胞间隙明显增大,毛细血管内皮细胞轻度增生,间质淋巴细胞浸润,血管平滑肌细胞增厚。术后7天肾小球Bowman囊囊壁明显增厚,间质、肾小管及血管壁均见大量淋巴细胞浸润,小动脉血管壁明显增厚。经统计相关分析AR大鼠超声造影肾皮质、外髓层、内髓层血流参数A、β、A×β值与血清肾功能指标及病理Banff诊断分级均成负相关,其中以与A值的相关性最好。结论大鼠肾移植术后急性排斥反应肾皮、髓质血流显着降低,超声造影血流灌注参数A、β、A×β值均为检测肾移植术后急性排斥反应肾脏血流灌注的敏感指标,连续、动态监测肾血流变化可早期诊断大鼠肾移植术后急性排斥反应的发生。实验叁大鼠急性肾小管坏死与肾移植术后急性排斥反应血流灌注的对比研究目的研究应用CEUS探讨肾移植术后缺血-再灌注损伤所致ATN和肾移植术后早期AR肾组织不同的血流动力学变化,以期为两者的鉴别诊断提供依据。研究方法SSG组、CIRI组各5只分别于术后第1、3、7天进入实验(每组共15只),Isograft组与Allograft组肾移植大鼠各3只分别于术后第1、3、7天进入实验(每组共9只)。实验方法同实验一、实验二相关部分。组间统计方法采用方差分析。结果术后第1天CIRI组、Isograft组、Allograft组大鼠肾皮质血流与SSG组比较均明显减少,表现为β、A×β值的降低(P﹤0.05),A值各组间未见显着差异;CIRI组、Isograft组、Allograft组叁组间比较大鼠肾皮质血流各参数未见显着差异(P﹥0.05)。Isograft组、Allograft组大鼠肾外髓层血流量与CIRI组、SSG组比较均明显减少,表现为A×β值的降低(P﹤0.05);术后第3天,CIRI组、Isograft组肾皮质血流渐趋改善,至第7天各参数与SSG组比较无显着差异(P﹥0.05);Allograft组则渐趋恶化,术后第3天皮质、外髓层、内髓层血流与其余叁组比较参数A、A×β有显著降低(P﹤0.05),第7天A、β、A×β值与其余三组比较均差异非常显著(P﹤0.01)。与之相对应,术后第1天CIRI组、Isograft组、Allograft组大鼠血清肾功能指标SCr、BUN与SSG组比较均明显增高(P﹤0.01);CIRI组、Isograft组、Allograft组大鼠叁组之间比较未见明显差异(P﹥0.05)。术后第3天,CIRI组、Isograft组SCr、BUN渐趋降低,至术后第7天CIRI组、Isograft组SCr、BUN恢复正常,与SSG组比较未见统计学差异(P﹥0.05);Allograft组则渐趋恶化,增高显着,第3,7天与SSG组、CIRI组、Isograft组比较有非常显着差异(P﹤0.001)结论急性肾小管坏死发生在术后早期,肾内皮质、髓质血流均明显减少,血流量的变化主要是由于血流灌注速度的变化所致;肾移植术后急性排斥反应的发生晚于急性肾小管坏死,肾皮、髓质血流减少更加显着,血流量的减少与血流速度、血管容积均密切相关;超声造影肾血流定量测定可为二者的临床早期鉴别诊断提供依据。
马艳[4]2005年在《超声诊断移植肾急性排斥的动物实验研究》文中认为目的: 肾移植术后急性排斥(AR)反应是导致移植肾功能障碍的主要原因,AR如能早期、准确诊断,并给予合理的治疗是提高移植肾存活的关键。多年来,多普勒超声由于具有简便、无创、可重复、价格相对低廉的优点,一直被认为是肾移植术后并发症的重要监测工具,但它对AR的诊断价值还是一个有争论的问题。因此,本研究在常规彩色多普勒血流显像(CDFI)和彩色多普勒能量图(CDE)检查的基础上,联合应用新近发展起来的超谐波声学造影(UHCI)和声学密度定量(AD)技术,探讨其定量评价AR反应不同时期移植肾皮质血流灌注的价值;并分析各灌注参数与临床生化指标变化的关系,以寻找更客观、敏感的超声检测指标,为临床早期诊断肾移植术后AR反应提供有力依据。 资料与方法: 1.急性排斥动物模型的建立:健康杂种雄性犬10只,体重10～15kg,随机分为5组,每组各2只犬。采用3%戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉后,行单侧原肾切除术,移植于异体右髂窝。 2.超声检查:采用HP Sonos 5500型彩色多普勒超声诊断仪,L7540(频率4～10MHz)及S3探头(频率1～3MHz)。常规肾移植术后1、3、5…(T_1、T_3、T_5…)隔天对移植肾进行一次超声检查,直至动物死亡,并同期测定血清肌酐(SCr)、24h内生肌酐清除值(CCr)。 ①高频及多普勒超声检查:先行二维超声扫描,观察移植肾锥体大小,皮质厚度,皮髓质轮廓及分界等。然后选择CDFI及CDE模式显示移植肾皮质区的血管分布及血流灌注情况,并将CDE显示的肾皮质血流灌注分为四级。在彩色多普勒清晰显示肾皮质血管树的状态下,用脉冲多普勒在小叶间动脉中取样,
赵轶[5]2006年在《超声诊断移植肾急性排斥的研究》文中研究说明目的： 彩色多普勒是早期诊断移植肾急性排斥反应的首选检查，其图象清晰直观，数据可信，无创伤，为抢救病人赢得了时间；但是多年来的临床统计发现，其诊断准确性相对不高，对临床的实际效用亦存在着许多争论。基于以上问题，本研究是在动物实验研究、常规二维超声和彩色多普勒血流显像(CDFI)及彩色多普勒能量图(CDPI)检查的基础上，联合应用新近发展起来的超谐波声学造影(UHCI)和声学密度定量(AD)分析技术，对移植肾急性排异发生、发展过程中的肾皮质血流灌注参数进行动态监测，连续、动态观察移植肾急性排斥的发生、发展过程中肾皮质血流灌注的变化。通过测定其血流灌注参数，与同期临床生化指标、病理组织学检查进行对照分析，以寻找诊断移植肾急性排斥更敏感的指标，为临床早期诊断肾移植术后移植肾急性排斥反应提供客观依据。资料与方法： 1．急性排斥实验监测模型的建立：对2004年12月到2005年12月的移植肾病人进行观察，取其中30例移植。肾急性排斥资料，观测移植肾皮质动脉血流信号。其中男：26例，女：4例，年龄(岁)：20～62，平均年龄：43岁。 2．超声检查：采用acuson SEQUOIA 512型彩色多普勒超声诊断仪，4C1凸阵探头，频率2～4.5MHz和15L8w线阵探头，频率8.0～14MHz。常规肾移植术后1、3、5、7…(T1、T3、T5、T7、、…)隔天对右髂窝移植肾进行一次超声检查(个别移植肾位于左髂窝)。并同期对临床的生化指标进行观测，测定血清肌酐(SCr)、内源性肌酐清除(CCr)、尿肌酐(UCr)
何晓霞[6]2012年在《彩超组织动态灌注（DTPM）定量评价IgA肾病的研究》文中研究说明研究背景：IgA肾病(IgAN)是最常见的原发性肾小球。肾炎类型,也是终末期肾衰(ESRD)的主要原因之一,因其起病隐匿、临床表现与病理变化复杂多样,以致于临床表现—病理分级不一致,给临床诊治带来了严重困难,故研究其疗效判别方法和预后影响因素成为当前临床医学的难点和热点。IgAN的病理改变除肾小球及肾小管间质病变外,肾血管病变在疾病演变中的价值也越来越受重视,并且成为判断预后的重要参考指标之一。有许多方法如肾活检、肾血管造影、MRI及CT灌注成像等均可评估肾血管病变,其中以肾活检最为可靠,但受主客观条件所限,这些方法均不能作为常规手段,为监测IgAN肾间质血管病变进展,而进行人的活体重复性肾活检更不适宜。无创性的彩超组织动态灌注(DTPM)技术明显克服了上述技术有创损伤和不便于重复进行等缺点,而且可定量观察分析,它从血流动力学改变入手研究肾皮质血流灌注情况,从而反映肾间质血管病变严重程度,近年来备受国内外关注。目的：用彩超组织动态灌注测量(DTPM)技术对各IgA肾病肾间质血管病变组肾皮质血流灌注情况进行分析,探讨其监测IgA肾病肾间质血管病变进展的可行性观测指标及其临床意义。对象及方法：2010年02月-2012年02月湘雅二医院肾内科住院的经免疫病理证实为原发性IgAN患者158例,所有入选病例排除急性期的IgAN以及系统性红斑狼疮、紫癜性肾炎及糖尿病肾病等继发性IgAN,经病理学检查参照Katafuchi半定量积分法对其肾间质血管损害程度分级后分为四组：无间质血管病变组、轻度间质血管病变组、中度间质血管病变组、重度间质血管病变组,于肾活检术前叁天应用GE Vivid7彩超诊断仪采集拟诊为IgAN的患者右肾2-3个心动周期的彩色血流视频图像,待病理确诊后回顾性收集入选病例肾穿年龄、病程、血压等临床指标,并选出其肾脏彩色动态图像运用PixelFlux软件进行脱机分析,测得各组DTPM技术血流灌注参数：平均血流速度(Vmix)、平均灌注强度(Imix)、组织阻力指数(TRI),并进行分析比较。结果：1.各IgAN肾间质血管病变组间DTPM技术灌注参数比较：与无间质血管病变组相比：轻度间质血管病变组Imix、Vmix值稍低,差异无统计学意义(P>0.05),TRI增高,差异有统计学意义(P<0.05),中、重度间质血管病变组Imix及Vmix减低,TRI值增高,差异有统计学意义(P<0.05)；与轻度间质血管病变组相比：中、重度间质血管病变组Imix、Vmix减低,TRI增高,差异均有统计学意义(P<0.05)；与IgAN中度间质血管病变组相比：重度组Vmix、Imix减低,TRI增高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.DTPM技术灌注参数与IgA肾间质血管病变严重程度的相关分析：IgAN肾间质血管病变各组Imix、Vmix与肾间质血管病变严重度分级呈等级负相关,TRI与肾间质血管病变严重度分级呈正相关。3.ROC曲线分析可知：TRI. Imix及Vmix评价IgAN肾间质血管病变严重度的灵敏度及特异性良好。结论：1、DTPM技术灌注参数与IgAN肾间质血管病变严重度分级呈良好的等级相关,表明相关灌注参数可以较好的反映IgA肾间质血管病变严重程度,可以作为监测IgAN肾间质血管病变进展的观测指标。2、DTPM技术灌注参数Vmix及Imix随IgAN。肾间质血管病变的加重而降低,TRI随其肾间质血管病变的加重而升高。3、ROC曲线分析表明：DTPM技术灌注参数Vmix、Imix及TRI对于评价IgA肾间质血管病变严重度的敏感性及特异性良好。
张翊[7]2013年在《超声介导的微泡破坏促进MSCs归巢并修复糖尿病肾病的实验研究》文中研究说明研究背景：糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是终末期肾脏疾病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因，与ESRD较高的死亡率密切相关。目前广泛认为小管间质损害是ESRD可靠的预测因子并与肾功能障碍密切相关。微量白蛋白尿是糖尿病肾病的早期征象。现有许多证据表明对糖尿病肾病进行早期干预和精确调控可以减缓，甚至逆转糖尿病肾病的进程。因此，对早期糖尿病肾病进行及早干预、提高治疗物质在肾间质的聚集是目前医学领域亟待解决的问题。目前治疗糖尿病肾病的常用方法诸如调控血糖、胰腺和肾脏移植、透析治疗等虽然能改善肾功能，却因当前药物治疗和治疗技术的有限性，导致并发症多、生存质量不高，效果并不显着。骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)移植治疗是近年来国内外研究的重点，其易于分离提取，具有高度的扩增潜能，有良好的基因稳定性、组织相容性好、不涉及伦理道德问题，为受损组织和器官的修复开辟了一条新途径。MSCs能够分化为功能性的胰岛素生成细胞，逆转糖尿病大鼠高血糖状态，也能够分化为肾脏细胞修复受损肾脏。因而，MSCs移植治疗被认为是改善高血糖和肾功能的、具有极大吸引力的治疗手段。但骨髓中MSCs含量极少，远远小于肾脏修复所需要细胞的量，加上目前干细胞移植治疗移植后细胞存活率较低、干细胞靶向归巢能力欠佳等问题，均极大地限制了其应用。因此，如何调控骨髓干细胞的肾向性、提高干细胞靶向归巢能力和移植的有效性是干细胞移植治疗肾脏疾病的关键。超声介导的微泡破坏(Ultrasound-mediated microbubble destruction)作为一种新的、极具前景的治疗方法应用于多个领域，例如将药物和基因传递到心血管系统，开放血脑屏障和血瘤屏障，增强毛细血管和血管通透性以及促进干细胞归巢等。肾脏是高滤过器官，对生物学效应较为敏感，对于肾脏疾病的干细胞移植治疗，超声介导的微泡破坏作用是否同样有效呢？研究显示，超声基因转染治疗仪(1.0W/cm~2)联合自制微泡能有效促进MSCs归巢至肾脏，使急性肾损伤大鼠肾功能得到明显改善。该研究还发现，超声+微泡组大鼠肾脏ICAM-1mRNA表达高于对照组、超声+微泡+MSCs组大鼠肾脏ICAM-1mRNA表达高于单纯MSCs移植组，说明超声介导的微泡破坏可以增加MSCs的靶向黏附、提高MSCs归巢至肾脏的能力，进而更有效地实现MSCs靶向移植治疗肾脏疾病的效果。然而，关于慢性肾脏疾病的干细胞治疗，超声介导的微泡破坏作用对其影响的研究较少，本实验尝试利用超声介导的微泡靶向破坏作用，经静脉移植MSCs治疗链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导的1型糖尿病肾病大鼠，并试图探索其安全性及可能机制，期望能提供一种新的、非侵入性的方法，对糖尿病肾病患者给予系统性药物治疗的前提下选择性增强干细胞在肾脏的聚集，最大化提高糖尿病肾病的治疗效果，为提高干细胞无创、有效地靶向归巢及减缓疾病进程、或是逆转糖尿病肾病病程进展提供一种新思路和新方法。研究目的：1.探讨诊断超声介导的微泡破坏促进经静脉移植的同源异体MSCs归巢糖尿病肾病大鼠肾脏的可行性和安全性；2.探讨在诊断超声介导的微泡破坏作用下，经静脉移植的MSCs对修复大鼠糖尿病肾病的有效性；3.初步探讨诊断超声介导的微泡破坏技术对促进静脉移植的MSCs靶向归巢并修复大鼠糖尿病肾病的可能机制。研究方法：1.采用全骨髓培养法对SD (Sprague Dawley)大鼠骨髓MSCs进行分离、培养、及纯化，检测其生物学特性。流式细胞仪检测细胞表面标记分子，成脂、成骨诱导分化进行细胞鉴定。为便于对体内干细胞的追踪，采用携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒对培养的MSCs进行转染，并观察转染后MSCs表达绿色荧光情况及细胞毒性反应。2.腹腔单次注射60mg/Kg SZT建立稳定的大鼠1型早期糖尿病肾病模型，随机血糖浓度和尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate, UAER)评价模型是否成功建立。3.①观察eGFP标记的MSCs归巢肾脏的情况。模型大鼠被随机分为MSCs组和超声+微泡+MSCs组，两组均经尾静脉移植MSCs，72h后采用激光共聚焦显微镜观察eGFP标记的MSCs在肾脏的定植情况，观察MSCs在MSCs组与超声+微泡+MSCs组肾脏内的荧光分布并进行阳性细胞计数和统计学比较。②超声介导的微泡破坏对糖尿病肾病模型大鼠肾脏通透性的影响。模型大鼠被随机分为叁个批次，每一批次均分为对照组(未处理组)、超声组、微泡组与超声+微泡组。第一批次大鼠在注射伊文思蓝(evans blue, EB)同时接受相应处理，1小时后检测EB含量、激光共聚焦显微镜及透射电镜观察各组毛细血管通透性改变，实时荧光定量PCR (Real-Time PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测E选择素(E-selectin)的mRNA和蛋白表达，肾脏组织学观察超声介导的微泡破坏对组织结构的可能损害；第二批次大鼠(处理同第一批次)24小时后检测UAER评价超声介导的微泡破坏对肾脏滤过功能可能的影响；第叁批次大鼠(恢复组)接受相应处理后24小时再接受EB注射，观察毛细血管通透性的恢复。4.模型大鼠被随机分为正常非糖尿病肾病组、未治疗组、超声+微泡组、MSCs组与超声+微泡+MSCs组。给予相应处理后1、2、4、8周每周固定时间点检测各组随机血糖浓度。8周后，检测大鼠UAER和血浆胰岛素水平、透射电镜观察肾小球和肾小管超微结构、肾脏PAS染色和胰腺HE染色观察肾脏和胰腺病理结构，胰腺组织免疫荧光双标技术观察胰岛β细胞和α细胞分布及数量恢复，酶联免疫吸附测定(Enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)检测抗炎因子白细胞介素10(IL-10)的蛋白表达，免疫组织化学法(Immunohistochemistry, IHC)检测促纤维化因子TGF-β1在肾内的分布和表达，并进行半定量分析。结果：1.培养的MSCs贴壁生长，形态以梭形为主；细胞表面高表达CD44(99.44%)和CD90(99.37%)，几乎不表达CD34(1.17%)和CD45(7.12%)。成脂诱导培养1周后油红O染色显示胞浆红色脂滴形成，成骨诱导2周后茜素红S染色显示红色钙结节形成。选择感染复数(Multiplicity of infection, MOI)为10转染MSCs，转染后72h荧光显微镜下观察，绝大部分MSCs呈现明亮的绿色荧光，eGFP转染阳性率约90%。转染后MSCs形态仍为梭形，生长良好，未见明显毒性反应，传代后荧光表达稳定。2. STZ注射3天后，大鼠逐渐出现多饮、多食、多尿、精神萎靡、活动减少、反应迟钝、鼠毛稀疏、晦暗无光泽等体征，连续3天监测随机血糖浓度均大于16.7mmol/L，提示1型糖尿病模型建立成功。糖尿病模型成功建立后4周，血糖值稳定在20.8-33.8mmol/L之间，大鼠出现微量白蛋白尿，UAER值从(18.64±6.43μg/mg，对照组)升高至(46.79±15.42μg/mg，糖尿病肾病组)。胰腺及肾脏病理学均提示早期糖尿病肾病模型成功复制。3.①荧光显微镜计数并比较MSCs组与超声+微泡+MSCs组肾内eGFP阳性细胞数，分别为(5.7±0.8)个，(18.3±2.9)个，差异有统计学意义(P＜0.01)。eGFP标记的MSCs主要位于肾间质毛细血管外、管周区域，少数位于肾小球。②超声联合微泡组肾内EB蓝染面积最明显，表面与冠状面蓝染面积分别为(49.12±7.31)%和(37.99±4.36)%，超声组肾内有轻微蓝染，表面与冠状面蓝染面积分别为(9.37±3.45)%和(10.10±3.24)%，对照组和微泡组未见蓝染。③超声联合微泡组的EB含量(37.267±4.948μg/g)明显高于对照组(13.942±2.848μg/g)、超声组(14.126±2.570μg/g)、微泡组(13.969±2.076μg/g)和恢复组(14.658±3.916μg/g)。④激光共聚焦结果显示超声+微泡组肾间质毛细血管周围EB渗出较其他组为明显，似呈“渔网状”，余各组未见EB渗出。⑤透射电镜观察到超声辐照后间质毛细血管壁变薄，变得不连续、不光滑，对照组、超声组和微泡组的间质毛细血管保持完整。⑥超声+微泡组E-selectin的mRNA和蛋白表达明显高于对照组、超声组和微泡组。⑦肾脏HE染色后观察，各组肾脏组织没有出血、坏死和肾脏结构的改变。⑧各组之间UAER值没有统计学差异。⑨各组未见血尿。4.①细胞治疗后1周，MSCs组和超声+微泡+MSCs组血糖浓度明显降低。细胞移植后第2周，血糖浓度降到最低水平并持续至整个实验阶段。细胞治疗后8周，MSCs组和超声+微泡+MSCs组，血糖浓度无明显差异(23.8±5.5mmol/L&24.0±4.6mmol/L,P=0.395)。未治疗组和超声+微泡组直至实验结束仍保持较高血糖水平，浓度分别为(28.4±6.2) mmol/L及(27.9±6.5) mmol/L。②细胞治疗后8周，与正常组(25.27±2.34mIU/L)相比，未治疗组和超声+微泡组的血浆胰岛素水平明显降低，分别为(16.42±2.17) mIU/L和(16.67±2.33) mIU/L，二者之间无明显统计学差异，而MSCs组和超声+微泡+MSCs组的血浆胰岛素水平有所上升，分别为(19.31±1.68) mIU/L和(19.53±1.59) mIU/L，二者之间也无明显统计学差异。③细胞治疗后8周，未治疗组和超声+微泡组的UAER值均保持较高水平，分别为(643.25±204.58) μg/mg和(637.29±212.24) μg/mg。该值约4倍高于同时期正常组大鼠UAER值(128.57±36.93μg/mg)。MSCs组和超声+微泡+MSCs组的UAER值明显降低，分别为(302.41±49.21) μg/mg和(252.83±39.58) μg/mg。尽管MSCs组和超声+微泡+MSCs组的UAER值均未降至正常水平，但超声+微泡+MSCs组的UAER水平明显低于MSCs组。④MSCs治疗后8周，未治疗组和超声+微泡组大鼠肾小球基底膜增厚，细胞外基质增生，系膜区增宽，足突广泛融合、增宽；肾小管上皮细胞胞浆内可见髓鞘样结构，小管上皮细胞微绒毛肿胀，线粒体肿胀并伴大量空泡变。MSCs组大鼠肾小球基底膜增厚、细胞外基质增生以及系膜区增宽情况减轻，小部分足突融合，大部分修复；肾小管上皮细胞部分线粒体肿胀伴少量空泡变性。超声+微泡+MSCs组大鼠肾小球基底膜大部分未见明显增厚，细胞外基质增生明显减轻，系膜区未见增宽，足突融合明显好转；肾小管上皮细胞线粒体轻度肿胀，未见明显空泡变性。⑤肾脏PAS染色显示，至整个实验结束，未治疗组与超声+微泡组的肾小球和肾小管在光镜下有类似改变，均表现为肾小球硬化、体积增大、基底膜增厚、系膜区增宽、系膜基质增生和肾小管扩张，肾小管上皮细胞空泡变性。MSCs组和超声+微泡+MSCs组上述情况均明显好转，MSCs组仅有一小部分肾小球硬化和肾小管扩张，超声+微泡+MSCs组光镜下可观察到几乎正常的肾小球和肾小管结构。⑥胰腺HE染色和胰腺组织免疫荧光双标检查均显示，未治疗组和超声+微泡组胰岛和胰岛β细胞大面积破坏，与正常组胰岛或胰岛β细胞相比，胰岛形态不规则、体积减小、胰岛素生成细胞数量减少并向周边分布，而胰高血糖素生成细胞数量增多并向中央分布。MSCs移植治疗后8周，MSCs组和超声+微泡+MSCs组胰岛或胰岛β细胞无论在数量、结构或是体积上均明显改善，经治疗后的胰岛素生成细胞重新向胰岛中央分布，胰高血糖素生成细胞重回周边分布。⑦免疫组织化学法检测TGF-β1在正常组中有少量表达，在未治疗组和超声+微泡组中强表达，MSCs组表达次之，超声+微泡+MSCs组弱表达，半定量分析后显示，超声+微泡+MSCs组与MSCs组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。⑧ELISA法检测IL-10在正常肾组织中高表达，未治疗组和超声+微泡组中表达明显降低，而MSCs组表达增加，超声+微泡+MSCs组表达进一步增加。结论：1.成功实现大鼠MSCs的分离、培养及纯化，骨髓贴壁法是获取、纯化、扩增MSCs简便、易行的方法。通过生长曲线、细胞周期、透射电镜等生物学特性检测，提示培养的MSCs呈低分化状态，有较强的自我更新能力。通过流式细胞仪检测细胞表面标记分子，以及体外成脂、成骨诱导分化，初步判定所获细胞为MSCs。2.腹腔单次注射链脲霉素(60mg/Kg)可建立稳定的大鼠1型糖尿病肾病模型，随机血糖浓度和UAER可有效评价模型是否成功建立。3. eGFP转染MSCs可有效示踪MSCs在靶器官的分布，按照MOI=10转染细胞，细胞转染后无明显毒性且荧光表达稳定，其方法简便，操作便捷，可应用于MSCs的标记。4.诊断超声介导的微泡破坏技术可增加糖尿病肾病大鼠肾间质毛细血管通透性，为经静脉移植的MSCs归巢并修复受损肾脏提供了研究基础。其可能机制为超声介导的微泡破坏所产生的空化效应可刺激超声辐照区域肾间质毛细血管的破裂及局部炎症发生，上调E-selectin炎症因子的表达，改变微环境，进而增加移植的MSCs向受损肾脏聚集与归巢。5.超声介导的微泡破坏技术在合适的参数下对肾脏可能是安全的，对大鼠肾脏滤过功能没有影响。肾间质毛细血管通透性的增加是可逆的，24小时后可恢复到正常水平。6.诊断超声介导的微泡破坏产生的空化效应通过增加间质毛细血管通透性、增加炎症因子E-selectin的表达，局部改变微环境，促进更多的外源性MSCs黏附、聚集、归巢至肾间质，抑制促纤维化因子TGF-β1表达，减轻肾小管和间质损害，阻止糖尿病肾病的进程。7. MSCs移植通过旁分泌效应产生抗炎因子IL-10，调节炎性细胞因子/抗炎细胞因子的产生，抑制机体炎症反应，从而减轻肾小球增大和肾小管扩张程度，延缓肾损害，保护肾脏。8. MSCs移植降低血糖浓度，促进胰岛恢复，有效遏制糖尿病肾病的进程，对促进肾脏修复产生积极作用。
参考文献：
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[3]. 超声造影评价大鼠肾脏冷缺血—再灌注损伤及肾移植急性排斥反应血流灌注的实验研究[D]. 罗晓莉. 第四军医大学. 2009
[4]. 超声诊断移植肾急性排斥的动物实验研究[D]. 马艳. 第一军医大学. 2005
[5]. 超声诊断移植肾急性排斥的研究[D]. 赵轶. 第一军医大学. 2006
[6]. 彩超组织动态灌注（DTPM）定量评价IgA肾病的研究[D]. 何晓霞. 中南大学. 2012
[7]. 超声介导的微泡破坏促进MSCs归巢并修复糖尿病肾病的实验研究[D]. 张翊. 第叁军医大学. 2013
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