徐军军[1]2008年在《外周血来源间充质干细胞在组织工程皮肤制备中的作用》文中进行了进一步梳理干细胞分为成体干细胞,胚胎干细胞,诱导多潜能干细胞(IPS)。干细胞具有向多个胚层分化的潜能,在细胞治疗和组织工程中发挥重要的作用。成体干细胞较胚胎干细胞有无伦理道德的限制,无免疫排斥反应,分离培养容易等优点,相对易于用于临床的治疗。骨髓间充质干细胞(BMSC),脂肪来源间质干细胞(ADSC),能够修复心肌,皮肤,骨等器官的损伤。但是获取骨髓间充质干细胞(BMSC),脂肪来源间质干细胞(ADSC)对病人造成的痛苦大,也有被感染等不安全因素,同时它们来源于患者自体使得干细胞作为一种“药品”受到限制(捐赠骨髓者稀少)。血液来源干细胞具有采集安全,对病人造成痛苦少且来源广泛(血液干细胞库)等优点,在临床应用中得到重视。造血干细胞(HSC)移植能够重建免疫系统,同时移植造血干细胞亦可以治疗下肢缺血性疾病,心肌损伤修复等。在非动员条件下,外周血来源间质干细胞(PBMSC)是否存在,存在争议。目前有报道将外周血来源间质干细胞(PBMSC)修复骨损伤,神经损伤。但是对于外周血来源间质干细胞(PBMSC)是否能够参与皮肤损伤修复还没有报道。本试验在提高分离外周血来源间质干细胞(PBMSC)效率的基础上,探讨外周血来源间质干细胞(PBMSC)能否参与皮肤损伤修复。(1)在皮肤损伤的条件下,外周血中间质干细胞(MSC)的含量升高。(2)骨髓间充质干细胞培养上清液,富含多种因子对于能够提高外周血来源间质干细胞(PBMSC)的分离效率。(3)外周血来源间质干细胞(PBMSC)具有间质干细胞的特性,不表达造血系的表面标志(CD34-,CD45-),能够向成脂,成骨诱导。(4)外周血来源间质干细胞(PBMSC)与骨髓间充质干细胞(BMSC)相似,能够促进皮肤创面的愈合,参与皮肤损伤修复。外周血来源间质干细胞(PBMSC)能够成为细胞治疗及组织工程皮肤的种子细胞。
李敬东[2]2015年在《肝细胞生长因子修饰的人脐带间充质干细胞对再障模型小鼠造血功能的影响》文中研究说明背景和目的再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)是一种常见的骨髓衰竭症,其病因多样、发病机理复杂。造血微环境缺陷是导致再生障碍性贫血发病的机制之一。尤其是骨髓基质细胞之一的间充质干细胞的缺陷很可能是导致再生障碍性贫血发生的重要环节之一;再生障碍性贫血的治疗除雄激素、免疫抑制剂以外,造血干细胞移植是非常重要的手段,但供体细胞来源的不足和严重的移植物抗宿主病(GVHD)是阻碍这种技术开展的重要障碍。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)的特点为该类细胞共有的自我更新、复制能力以及多向分化潜能,可进一步分化为造血细胞,并且可以支持造血、调节免疫功能,是骨髓造血微环境的重要组成成分。间充质干细胞具有低的免疫原性和可移植性,正在逐步成为细胞治疗的重要种子细胞。间充质干细胞和造血干细胞共移植可以促进造血干细胞植入、减少GVHD的发生。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)作为一种细胞因子具有促进细胞生长作用,同时对血管生成、细胞分裂等均有影响,还可以对造血干、祖细胞向造血部位(骨髓)迁移起着促进和诱导的作用。表达HGF的相关基因可以通过腺病毒等载体转染入间充质干细胞内,使间充质干细胞表达HGF增多,多数的研究表明HGF基因的修饰对间充质干细胞促进细胞修复、调节免疫等方面功能有增强的作用。但HGF基因修饰的间充质干细胞对造血功能的影响方面的研究却比较少。本研究的目的是在我院前期临床经验的基础上,通过动物实验探讨人脐带来源间充质干细胞(Human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,h UMSC)对再障模型小鼠造血功能的影响、HGF和间充质干细胞在对再障模型小鼠造血功能的影响上是否有协同作用,HGF基因修饰的间充质干细胞系的构建和其在再生障碍性贫血临床治疗中的潜在的价值。材料与方法第一部分:回顾性分析新乡医学院第一附属医院血液科2009年1月至2014年12月重型再生障碍性贫血(SAA)接受人脐带来源间充质干细胞联合外周血干细胞共移植病例6例,其中SAAⅠ型2例,SAAⅡ型4例,移植前均接受环孢菌素(CSA)及雄性激素治疗并不同数量输血,供者均为HLA配型6/6全相合同胞,其中男性供者4例,女性供者2例,血型不合1例。预处理方案为经典“环磷酰胺+ATG”的基础上加氟达拉滨;短疗程氨甲蝶呤(MTX)加环孢菌素预防GVHD;患者住无菌的移植病房;注意加强支持治疗。0天输注外周血干细胞CD34+细胞4.18(2.75-6.46)×106/kg(患者)输注造血干细胞前4小时输注人脐带来源的间充质干细胞2.71(2.4-3.0)×1010个。观察预处理方案不良反应,输注造血干细胞过及间充质干细胞过程是否是顺利;造血功能恢复时间的观察;GVHD及其他并发症发生的情况以及供者干细胞植入情况。第二部分:我们通过贴壁培养法,获得人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells、h UMSC),通过流式细胞仪检测间充质干细胞的表面抗原标志、通过诱导成神经细胞分化和成脂肪分化来鉴定间充质干细胞的特性。应用携带HGF基因的腺病毒载体(Ad-HGF)转染间充质干细胞,MOI为150 pfu/细胞,转染时间48小时。应用免疫标记法(Western blot)及酶联免疫吸附法(ELISA)检测转染后人脐带来源间充质干细胞HGF的表达。同时通过流式细胞仪对表面标志进行相应的检测,应用成神经细胞和成脂肪分化过程来检测Ad-HGF转染对人脐带来源间充质干细胞的影响。第叁部分:我们将24只BABL/C小鼠分为实验对照组、h UMSC组、Ad-HGF修饰MSC组,应用6MV的X线均匀照射各组小鼠,照射后第2、4、6天,给每只小鼠腹腔注射环磷酰胺50mg/kg、氯霉素62.5mg/kg。造模后第8天MSC组经小鼠尾静脉给h UMSC悬液注射含细胞数5×107个、Ad-HGF修饰MSC组经小鼠尾静脉注射Ad-HGF修饰的MSC悬液0.2ml含细胞数5×107个,并于注射后第2天应用ELISA法检测模型小鼠外周血中HGF的含量。实验对照组等量注射生理盐水。造模后每天观察小鼠一般情况同时测量体重等指标。造模后第8天取血观察叁组血常规变化、同时取骨髓行骨髓涂片、骨髓活检的检查;濒死小鼠及死亡小鼠解剖观察;观察造模后第21天血常规,评价小鼠再障模型的稳定性及3组小鼠造血功能变化及恢复的程度。叁组数据对比采用统计学T检验方法。结果第一部分:6例患者均顺利植入,3个月时评价均为100%供者型,白细胞中位恢复时间12d,血小板中位恢复时间16d。移植过程顺利,人脐带来源的间充质干细胞输注过程中患者无不良反应,无急性移植物抗宿主病(GVHD)发生,无其他严重并发症发生。第二部分:我们通过贴壁培养法获得的获得人脐带来源的间充质干细胞均呈贴壁生长的成纤维细胞样形态,表型特征分析显示细胞为非造血细胞群,转化试验证明细胞具有体外成神经细胞和成脂肪能力,说明获得的细胞符合MSC的特性。我们应用携带HGF基因的腺病毒载体(Ad-HGF)转染间充质干细胞,通过检测其表面标志及分化能力均不受影响。通免疫印迹法和酶联免疫吸附法检测的转染后间充质干细胞表达的较未转染组HGF增高,差别有统计学意义。第叁部分:3组试验小鼠应用X线及化学药物造模,在造模后发现小鼠活动减少,摄食减少、体重下降,试验对照组1例死亡。造模后第8天,血常规检测发现,注射间充质干细胞2组小鼠白细胞、红细胞、血小板下降均较实验对照组轻,差别有统计学意义;Ad-HGF转染MSC组较MSC组上述指标高,但无统计学差别。骨髓涂片及骨髓活检均见造血组织减少、脂肪细胞增多现象。但Ad-HGF转染MSC组及MSC组病理变化较实验组轻。观察至21天各组白细胞、红细胞、血小板数量均处于低水平,但MSC组和Ad-HGF修饰MSC组恢复较好。结论第一部分:人脐带来源的间充质干细胞联合外周血干细胞共移植治疗重型再生障碍性贫血安全无相关不良反应,造血恢复良好,急性GVHD发生率低。第二部分:贴壁培养方法获得的人脐带来源间充质干细胞经检验符合MSC的各项特征;携带HGF基因的腺病毒载体(Ad-HGF)转染的间充质干细胞表面的各种标志的表达、转化成其他细胞的功能等特征不受影响。第叁部分:X线及环磷酰胺、氯霉素联合构建小鼠再生障碍性贫血模型符合临床再障特点,血常规及骨髓变化符合典型再障表现。实验动物死亡率低。模型稳定持久。人脐带来源间充质干细胞及Ad-HGF修饰的人脐带间充质干细胞对再障模型小鼠的造血功能均有保护作用,修饰后的间充质干细胞此保护作用略强,提示HGF与间充质干细胞对再障模型小鼠造血功能可能有协同作用,需进一步研究证实。
耿珊[3]2016年在《当归多糖调控CML患者骨髓间充质干细胞衰老抑制白血病干细胞增殖的机理研究》文中研究说明背景干细胞具有自我更新和多向分化能力,这是维持组织和器官结构与功能稳态的关键因素之一。人体衰老和老年性疾病的发生、发展与机体干细胞衰老有密切关系。研究证明。造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC)衰老与多种老年性疾病密切相关,主要表现为造血系统衰退所致的严重贫血,免疫系统低下所致的防御功能降低,细胞增殖分化失控所致的白血病发生等。研究证明,随着年龄的逐步增加,造血诱导微环境的生态龛数量减少和功能衰退,进而导致HSC数量减少和功能低下,最终伴随相关老年性疾病的发生。因此干细胞是研究细胞衰老的重要模型,深入研究干细胞衰老和延缓干细胞衰老的现代生物学机理,不仅对推动人体衰老问题的研究有重大的科学意义,而且在预防老年疾病和治疗退行性疾病中有不可估量的社会价值。造血诱导微环境(HIM)是HSC赖以生存和增殖分化的场所,HIM不仅是HSC生存的支架,它还产生诸多造血调控因子,影响细胞信号转导对其功能起着重要调控作用。现代造血理论认为,HIM的核心成分是骨髓基质细胞,它构成特定的生态龛调控HSC的功能,骨髓基质细胞是多种细胞组成的混合细胞群,它们大多起源于骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCS)。因此阐释造血干细胞衰老机制需要同步研究BMSCS对其衰老的影响。慢性髓细胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)是一种造血干细胞克隆增生性疾病,骨髓以髓系细胞增生,外周血以白细胞增多和脾肿大为主要特征,以老年人的患病率较高。研究证明,白血病的发生发展与白血病干细胞(leukemia stem cell,LSCS)密切相关。目前认为,LSCS由正常HSC演化而来,尤其HSC衰老或HIM变化是形成LSCS的关键因素,同时LSCS也是临床治疗白血病的难点所在。迄今白血病的根治除了HSC移植外没有理想的治疗手段,但该治疗手段复杂,尤其是难以获得理想的供体细胞,且花费巨大,大多数患者并没有治疗机会。如何治愈白血病仍是医学界难以攻克的瓶颈。如果寻找到既能抑制白血病细胞增殖分化,又能对骨髓正常造血细胞有良好保护作用的天然药物有效成分将对白血病等肿瘤的治疗带来新的治疗途径。当归是中医临床“补血、活血”要药,当归多糖(ASP)是其主要药物活性成分之一。我们多年的研究证明,ASP对HSC的增殖分化有重要调控作用,且可以延缓HSC衰老,促进贫血动物骨髓造血功能,对免疫器官有良好保护作用。最近我们研究发现,ASP能促进LSCS的衰老,对移植性白血病有较好的治疗效果。但ASP的“双向调节”作用机理尚不清楚。目的本文将现代干细胞最新理论和技术与传统中医“气血理论”和衰老理论结合研究如下内容1.随年龄增加小鼠与人骨髓HSC/HPCS与BMSCS衰老的生物学特点;2.ASP调控骨髓间充质干细胞对LSCS的影响;3.ASP调控BMSCS衰老抑制LSCS作用机理。研究对阐释干细胞衰老理论和中医学“气血理论”有重要的理论价值;对临床治疗白血病有重要的应用价值。方法1.雄性C57BL/6小鼠,分为幼年组(A组,3~4周龄),青年组(B组,2月龄),中年组(C组,6月龄),中老年组(D组,12月龄),老年组(E组,18月龄)。提取各组小鼠骨髓单个核细胞,用本课题组改良MACS分离法分选纯化Sca-1+细胞群。衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色观察各年龄组阳性细胞百分比,造血祖细胞混合集落(CFU-Mix)培养比较各年龄组Sca-1+细胞集落形成能力。2.取正常人骨髓,分为青年组(3例,26~31岁),中年组(3例,52~59岁)与老年组(3例,62~70岁),改良MACS分选出各组骨髓CD34+CD38-细胞,流式细胞术检测其纯度,台盼蓝染色检测细胞存活率,SA-β-gal染色检测各组细胞衰老情况。3.分离各组人骨髓单个核细胞,体外贴壁培养14-21天,倒置镜下计数细胞数>50的成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)个数。取第3代BMSCS,流式细胞术检测CD34,CD45,CD73,CD90,and CD105细胞表型,SA-β-gal染色观察各年龄组阳性细胞百分比,CCK-8检测比较各年龄组BMSCS形成CFU-F的能力。4.取正常人骨髓3例。慢性髓细胞白血病患者骨髓5例,分别分为对照组与ASP组。对照组,进行常规培养;ASP组,在培养体系中加10μg/ml当归多糖,其它条件同于对照组。分别计数各组CFU-F数量,CCK-8检测各组BMSCS增殖情况,SA-β-gal染色检测衰老细胞阳性率。碱性磷酸酶染色检测各组BMSCS的成骨分化能力,油红O染色检测BMSCS成脂分化能力。5.检测上述各组BMSCS内SOD,总谷胱甘肽,MDA,超氧化物的含量,观察各组细胞的氧化损伤及抗氧化能力。Elisa检测血管生成素Ⅰ含量,了解各组BMSCS的对造血系统的支持作用。6.RT-PCR和Western blotting检测各组人BMSCS衰老相关基因p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1m RNA及衰老相关蛋白P16INK4a、P21Cip1/Waf1、P19、P53表达的改变。7.将培养了叁代的各组BMSCS分别加入到带Transwell的六孔板的下层,将LSCS分别加入transwell的上层,每孔各106个LSCS。培养24h,取出上层的CD34+CD38-细胞进行CFU-Mix培养及CCK-8增殖能力检测。结果1.MACS分选前小鼠Sca-1+细胞百分比为(1.02 0.19)%;MACS分离纯化后Sca-1+细胞纯度可达(93.66±0.83)%。各年龄组分选前后Sca-1细胞纯度百分比无统计学差别。MACS分离纯化前每106个BMNCs中CD34+CD38-细胞群比例为1.76±0.34%;MACS分离纯化后每106个细胞中CD34+CD38-细胞群比例为91.15±2.41%。各组人BMSCS高表达CD73,CD90,CD105抗原,低表达CD34,CD45抗原。2.青年组,中年组与老年组人每107个BMNS形成CFU-F能力随年龄增加逐渐下降;人CD34+CD38-细胞形成CFU-Mix数量随年龄增加逐步下降降低,集落中的细胞数也逐渐减少;人BMSCS的SA-β-gal染色阳性率随年龄增加逐渐升高。幼年组,青年组,中年组,中老年组和老年组小鼠Sca-1+HSC/HPCSs形成CFU-Mix数量随年龄增加逐渐降低,集落中细胞数也逐渐减少;SA-β-gal染色小鼠BMSCS阳性细胞数随年龄增加逐渐升高。小鼠或人BMSCS的增殖情况均随年龄呈现逐步降低趋势。3.LSCS与BMSCS共培养结果表明,空白对照组和白血病组的LSCS集落数量明显高于其它组,集落中细胞数也高于其它组。ASP组LSCS集落数量明显少于白血病组,提示ASP干预的BMSCS有抑制LSCS增殖的作用,ASP作用BMSCS可以延缓其衰老。4.CML患者的BMSCS与健康人的BMSCS比较,形成CFU-F能力下降,而ASP作用CML患者的BMSCS后,形成CFU-F能力明显提高。SA-β-gal染色阳性的人BMSCS数在白血病组显着增加,而ASP组的SA-β-gal染色阳性的细胞数明显降低。白血病组的BMSCS成骨、成脂分化能力明显降低,而ASP组的BMSCS成骨、成脂分化能力明显高于白血病组。白血病组BMSCS的SOD,总谷胱甘肽与血管生成素Ⅰ含量明显降低,而MDA及超氧化物均明显增高,而ASP组BMSCS的SOD,总谷胱甘肽与血管生成素Ⅰ的含量明显提高,而MDA及超氧化物均明显降低。说明CML患者BMSCS较健康人的BMSCS出现明显衰老,而ASP可以延缓其衰老。5.PCR结果显示p16INK4a,p19Arf,p53,p21Cip1/Waf1基因在各组人BMSCS中均有表达,白血病组p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1m RNA表达水平显着高于其它各组,ASP组相应基因表达水平低于白血病组,Western Blot结果提示各组人BMSCS均有所表达P16INK4a、P21Cip1/Waf1、P53、P19蛋白,白血病组表达明显增高,ASP组相应蛋白表达低于白血病组,提示ASP能延缓人BMSCS衰老,其机理可能与ASP调控p16INK4a-Rb和p19Arf-Mdm2-p53-p21Cip1/Waf1信号通路有关。结论1.随年龄增加小鼠和人类的HSC及BMSCS均会出现衰老,表现为增殖分化能力下降等,这两种细胞的衰老可能存在相互关联。2.随着年龄的增加,人骨髓间充质干细胞出现衰老,对造血系统尤其是造血干细胞的支持作用下降,这可能会导致造血干细胞变成增殖性很强的白血病干细胞,于是患上白血病。且有白血病干细胞的存在,白血病的治疗效果不好,容易复发。本部分实验提示当归多糖可能可以通过延缓间充质干细胞衰老抑制白血病干细胞的增殖分化,进而抑制白血病干细胞的产生,降低慢性髓细胞白血病的患病率。3.当归多糖可以调控CML骨髓间充质干细胞衰老,从而抑制白血病干细胞的增殖,其可能的机理是通过提高细胞的抗氧化能力和降低细胞氧化损伤。也可能与p16INK4a-Rb和p19Arf-Mdm2-p53-p21Cip1/Waf1信号通路的调控有关。这个发现可以成为我们今后探索治疗CML的新方法的新途径。
马杰[4]2007年在《全身照射引起小鼠Flk-1～+骨髓间充质干细胞细胞衰老不相关的成骨潜能改变及其与骨骼和造血系统损伤的关系》文中进行了进一步梳理干细胞存在于机体胚胎及成体的各种组织中，是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体，其中成体干细胞(adult stem cells, ASCs)，尤其是间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)能支持机体多种组织器官生理性的持续更新过程，并参与疾病或损伤时组织再生和修复。我们已经成功地从胎儿和成人的多种组织及小鼠骨髓的MSCs培养体系中分离得到Flk1~+MSCs，它们具有稳定的表型特征，即Flk1、CD29、CD44、CD105阳性，内皮细胞特征性表型von Willebrand(vWF)、CD31和造血细胞的表型CD34、CD45、CD11a、CD11b和HLA-DR阴性；能向叁个胚层的细胞分化；并且已在多个疾病损伤模型中证实它能参与组织损伤修复。更为重要的是，慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)、再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)、骨髓增殖异常综合征(meylodysplastic syndrom, MDS)患者的骨髓中也含有具有相同表型特征的Flk1~+ MSCs，它们或作为白血病干细胞(leukemia stem cells, LSCs)存在参与CML的发生，或因其分化潜能或免疫调节功能的异常参与疾病进展。以上说明：Flk1~+ MSCs不仅在组织损伤和修复中发挥重要作用，其生物学特性的异常改变可能还是一些疾病发生、发展的干细胞水平的机制。放射治疗是目前临床上常用的一种肿瘤治疗方法，但它除了能杀灭肿瘤细胞外，也往往损伤正常组织，如骨和骨髓等，导致放射相关的一系列近期和远期并发症。已有报道，放射诱导的造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)衰老是放射后长期骨髓造血功能损伤的潜在机制。但骨髓中不仅含有HSCs，还含有MSCs，它能分化为骨髓基质的多种细胞成分，构成HSCs龛位(niche)。其中由骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)分化而来的成骨细胞，不仅参与骨组织的构成，还是HSCs龛位的关键细胞成分。因而我们应用全身照射(total body irradiation,TBI)小鼠模型进行了以下实验，观察TBI对小鼠Flk1~+BMMSCs生物学特性的影响及其意义。本研究第一部分旨在观察Flk1~+BMMSCs在放射损伤后细胞衰老相关的细胞和分子水平指标的变化。结果显示：在接受单一剂量4Gy的TBI后，小鼠Flk1~+BMMSCs并未表现出细胞衰老相关的形态学、衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)活性的改变以及细胞周期阻滞现象，相反地，TBI后第3天，较多的Flk1~+BMMSCs进入S期。同时，TBI也未能诱导细胞衰老相关基因p16~(INK4a)、p21~(cip1／waf1)、p53和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达上调。鉴于成骨细胞在骨骼和HSCs龛位中的重要作用，在第二部分的实验中我们研究了TBI对小鼠骨髓间充质干／祖细胞池大小及其成骨分化潜能的影响。4Gy的TBI后，小鼠骨髓间充质干／祖细胞池明显缩小，表现为成纤维细胞集落形成单位(colony-forming unit fibroblast,CFU-F)数量迅速减少，4周内未见恢复。向成骨细胞分化的Flk1~+BMMSCs碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和Von Kossa染色及成骨分化相关基因：核心结合因子1(core-binding factor 1, Cbfa1)、Ⅰ型胶原(type 1 collagen,Col1)、骨钙蛋白(osteocalcin, OC)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)在TBI前后不同时间点的表达变化均说明Flk1~+BMMSCs的成骨潜能在TBI后第3天明显增强，随后成骨细胞分化、成熟障碍。这一改变可能与BMMSCs上具有PDZ结合基序的转录共激活基因TAZ(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)的表达变化相关。在第叁部分的实验中我们观察了TBI后小鼠体内成骨细胞、骨骼系统以及HSCs骨龛(osteoblastic niche)的改变。我们发现，TBI后体内成骨细胞数量显着减少，骨组织结构破坏明显，TBI后第15周时，TBI小鼠全身骨密度(bone mineral density, BMD)明显降低。纺锤形的、表达神经-钙黏附素的成骨细胞(spindle-shaped N-cadherin-expressing osteoblasts, SNOs)被认为是HSCs骨龛中的关键细胞成分，TBI后其数量亦明显减少。总之，通过以上实验研究，我们证实4Gy TBI不能诱导小鼠Flk1~+BMMSCs发生细胞衰老；但骨髓间充质干／祖细胞池显着缩小；TBI后早期Flk1~+BMMSCs进入S期增多，成骨分化潜能明显增强，随后细胞周期逐渐恢复，成骨分化能力显着降低。TBI诱导的Flk1~+BMMSCs数量、细胞周期状态及成骨潜能的动态改变提示在TBI后早期Flk1~+BMMSCs存在一定的代偿，但最终Flk1~+BMMSCs数量和成骨分化能力的显着降低可能是TBI后骨骼和造血系统长期损伤的干细胞水平的机制。
张瑞[5]2017年在《黄连素对骨髓间充质干细胞成骨分化作用的初步研究》文中指出牙周炎是由细菌感染导致的牙齿支持组织的慢性炎症性疾病。目前的治疗方法主要是机械清除菌斑和局部刺激因素,以及通过牙周再生性手术如GTR促进已破坏组织的恢复,但这些治疗方法只能停止疾病进展,组织再生疗效仍然十分有限。牙周组织工程是牙周组织再生的理想策略,其目标是在控制局部感染的基础上,使用支架材料、干细胞和细胞因子诱导牙周组织再生,以恢复牙周组织的结构和功能。考虑到感染和再生两个方面,负载抗生素/抗菌剂的组织工程支架是目前研究的焦点。传统抗生素具有毒副作用大、易产生耐药性等缺点,近来研究发现很多植物成分对人类病原微生物具有抗性,植物抗菌成分引起众人的关注,逐步成为研究的热点。黄连素(berberine,BBR)是一种苄基异喹啉生物碱,存在于白毛莨、黄连、刺檗、具芒小檗等植物的根茎中,它用于治疗腹泻已经有两千多年的历史,具有疗程短、疗效快、副作用少、作用温和、成本低等特点。最近研究发现黄连素对多种口腔致病菌具有抗菌作用。黄连浸提物以及黄连素对牙龈卟琳单胞菌(Porphyromonasgiingivalis,P.gingivlis)、伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans,A.actinomycetemcomitans)、中间普氏菌(Prevotella intermedia,P.intermedia)、变黑普氏菌(Preyotella nigrescens)、具核梭杆菌(Fusobacteriu.nucleatum,nucletum)等牙周致病菌具有较强的抑菌作用。将黄连药膜置于牙周袋,可明显减轻中重度牙周炎患者的牙龈炎症和探诊深度,提高基础治疗的疗效。此外,Ⅱ期临床试验证实口服黄连上清软胶囊可治疗上焦风热证,中医学中的上焦风热证即指急性牙周炎。黄连素在我国有着两千多年的药用历史,来源丰富,获取便利,安全经济,因此具有良好的临床应用前景。传统医学书籍《药品化义》中记录黄柏泡酒,和四物汤同服,有健骨的作用,可治疗膝盖疼痛和下肢无力。另外,用于治疗骨质疏松症的传统中草药配方如二仙汤含有黄连素,且其中的黄连素成分是抑制骨质疏松症的主要活性成分。动物实验和临床试验表明,黄连素单独使用或与维生素D3联合使用能有效缓解骨质疏松症,减少破骨细胞的数量,抑制破骨细胞的骨吸收活性,同时促进骨形成,提高骨形成相关因子的表达水平。黄连素在一定浓度范围内对骨髓巨噬细胞不产生细胞毒性,并通过抑制NF-κB和Akt的活化抑制破骨细胞的形成和活性。以上研究中,黄连素的骨保护作用主要与抑制破骨活动相关,关于黄连素促进干细胞成骨分化的研究很少。因此,本实验中我们研究了牙周关键致病菌P.gingvalis及其毒力因子牙龈素RgpA感染对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影响,评价黄连素对P.gingivalis的抑菌作用,以及对P.gingivalis感染引起的成骨分化方面效应的调节,发现黄连素能够改善P.gingivalis感染引起的成骨分化能力下降,并进一步研究黄连素对BMSCs成骨分化的直接作用及可能的作用机制。将黄连素的广谱抗菌和促进干细胞成骨分化两方面的作用结合起来,有望用于牙周组织工程,在控制局部感染的同时,诱导干细胞的成骨分化潜能,提高牙周组织再生疗效。第一部分黄连素改善Pgingivalis 感染引起的间充质干细胞成骨分化能力下降[目的]细菌感染对牙周组织再生的成败具有关键性的影响。P.gingivalis是慢性牙周炎的关键致病菌,其毒力因子牙龈素(gingipain,GP)在促进牙周组织破坏过程中发挥着重要的作用。本部分初步探索P.ginnlis及RgpA(Arginine-gingipain A)突变菌感染对间充质干细胞成骨分化的影响,同时观察黄连素和CL(14-25)两种抗菌药物对P.gingivalis 感染引起效应的改善作用。[方法1首先采用overlap PCR的方法构建了同源重组片段up_erm_down',并将该片段连接到自杀质粒载体上,获得重组质粒pPHU281_up_erm_down,将重组片段或重组质粒电转化入P.gingivalis ATCC33277细胞,利用细菌DNA的同源重组构建RgpA突变菌。PCR、测序和SDS-PAGE鉴定RgpA突变菌。观察RgpA突变菌的菌落形成和血细胞凝集活性,透射电镜观察RgpA突变菌的结构组成,激光共聚焦显微镜观察RgpA突变菌的生物膜形成。CCK-8检测P.gingivalis和RgpA突变菌感染对间充质干细胞增殖活性的影响。qPCR检测间充质干细胞成骨分化相关基因的表达。微量肉汤稀释法检测黄连素和CL(14-25)对P.gingivalis的抑菌作用。提取并纯化细菌培养上清中的牙龈素蛋白,根据酶促反应的荧光产物释放量,检测黄连素和CL(14-25)对RgpA酶活性的抑制作用。[结果]成功构建了P.gingivalis ATCC33277 RgpA突变菌,与野生型菌相比,RgpA突变菌血细胞凝集活性下降、菌体胞外囊泡减少、细菌生物膜形成增加。感染复数MOI为100:1时,P.gingivaais及RgpA突变菌感染BMSCs 24h对细胞的增殖活性无明显影响,但引起Runx2、ALP、OCN等成骨分化相关基因的表达下降,P.gingivalis及RgpA突变菌感染对BMSCs成骨分化的影响无显着差异。黄连素和CL(14-25)两者均可抑制P.gingivalis 细菌的生长,且抑菌作用呈现药物浓度依赖性,其中黄连素最小抑菌浓度是31.3 μg/mL。黄连素和CL(14-25)均可抑制RgpA的酶活性,且酶活性抑制作用呈现药物浓度依赖性。黄连素显着改善P.gingvalis感染引起的间充质干细胞成骨分化基因下调,且与未感染对照组相比,进一步上调了 OSX、COLI、ALP、OCN、OPN等基因的表达。[结论]成功构建了RgpA 突变菌;在不影响细胞增殖活性的情况下,P.gingivalis感染引起BMSCs成骨分化基因表达下降,P.gingivalis毒力因子RgpA在此过程中作用不大;黄连素对P.gingivalis的抑菌作用显着优于CL(14-25);黄连素能够改善P.gingivalis感染引起的间充质干细胞成骨分化能力下降。第二部分黄连素对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化能力的影响[目的]第一部分实验发现黄连素能够改善P.gingivalis 感染引起的干细胞成骨分化基因表达下降,本部分实验目的是研究黄连素对BMSCs成骨分化的直接作用。[方法]首先采用全骨髓贴壁法,分离大鼠BMSCs,做原代培养。观察细胞形态特征及生长情况,测定生长曲线,流式细胞仪检测CD90、CD105、CD45、CD11b等细胞表面标记。成骨诱导21天,茜素红染色检测成骨矿化能力;成脂诱导18天,油红O染色检测成脂分化能力。采用CCK-8法检测黄连素对大鼠BMSCs增殖活性的影响。成骨诱导培养基中加入0、1、3、10、30 μM黄连素,培养BMSCs 3天和7天后,碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)活性检测试剂盒和染色分析观察ALP的表达;培养7、14天后,qPCR分别检测成骨分化相关因子(Runx2、OSX、COLI、ALP、OCN、OPN)的 mRNA表达水平;培养18天后,茜素红染色分析细胞矿化。[结果]分离获得的细胞具有贴壁特性;细胞表面CD90、CD105呈阳性表达,阳性率分别为99.5%、99.8%;CD45、CDllb表达阴性,表达率分别为4.67%、3.72%;具有多向分化潜能,在特定条件下可分化成成骨细胞和脂肪细胞。在2-32 μM浓度范围内黄连素对大鼠BMSCs没有细胞毒性。与对照组相比,黄连素浓度在1-10 μM时显着促进细胞ALP的活性,1、3μM时上调OSX、COLI、ALP、OCN、OPN等成骨相关基因的mRNA表达水平,促进矿化形成。黄连素促间充质干细胞成骨分化的最适浓度为3 μM。[结论]采用全骨髓贴壁法成功分离获得大鼠原代BMSCs。3μM黄连素显着促进BMSCs的成骨分化能力,同时不影响细胞的增殖活性。第叁部分黄连素通过Wnt/p-catenin信号通路促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[目的]进一步研究黄连素促进BMSCs成骨分化的作用机制。Wnt/β-catenin信号通路在骨生物学中发挥重要作用,Runx2、OSX、OCN、OPN是该通路的下游靶基因,第二部分实验证实,黄连素上调BMSCs成骨相关基因Runx2、OSX、OCN、OPN等的表达,黄连素可能通过Wnt/β-catenin信号通路促进间充质干细胞的成骨分化。本部分探讨Wnt/β-catenin信号通路是否参与黄连素促进BMSCs成骨分化的过程。[方法]将0、1、3、10、30 μM的黄连素加入成骨诱导培养基,培养1、3、7天,提取BMSCs的的总蛋白、细胞浆蛋白、细胞核蛋白,Western Blot检测β-catenin的蛋白表达。SABC-CY3免疫组化进行免疫荧光染色,观察β-catenin蛋白的亚细胞定位。双荧光素酶报告基因检测β-catenin与TCF/LEF(T-cell factor/Lymphoid enhancer factor)转录因子的作用活性。Wnt信号通路特异性抑制剂DKK-1预处理间充质干细胞,观察在阻断Wnt/β-catenin信号通路的情况下,黄连素对干细胞成骨分化的影响。[结果]黄连素处理细胞3天,与对照组相比,各加药组总蛋白提取物中β-catenin蛋白水平显着升高(P<0.05),3、10μM药物组胞浆蛋白水平显着升高(P<0.05),各组胞核β-catenin蛋白积累均显着高于对照(P<0.05),且最高相比对照组增加了 3倍左右。3 μM黄连素孵育细胞72 h,细胞免疫荧光的结果示胞内β-catenin蛋白积累增加,并且向细胞核移位;3μ ^黄连素孵育细胞24 h,TOP flash/Fop flash双荧光素酶报告基因检测结果示,β-catenin/TCF的转录活性升高,升高至对照组的2倍左右。Wnt特异性抑制剂DKK-1预先加入细胞孵育24 h以阻断Wnt信号,然后加入3 μM黄连素,加药3天后DKK-1+ BBR组的β-catenin蛋白表达和ALP活性与BBR组相比显着降低(P<0.05);加药7天后DKK-1+ BBR组的ALP、COLI、OCN mRNA表达与未做任何处理的对照组相比有所上调,但明显低于BBR组CP<0.05);此外,DKK-1+BBR组的细胞钙结节形成与BBR组相比明显减少。[结论]Wnt/β-catenin信号通路参与黄连素促进间充质干细胞成骨分化的过程。
张帆[6]2011年在《淫羊藿苷诱导人脐带间充质干细胞分化为成骨细胞的实验研究》文中研究说明背景和目的人脐带间充质干细胞的体外分离及定向培养是目前组织工程学的热点。研究淫羊藿苷对人脐带间充质干细胞的生物学作用,以及诱导其向成骨细胞分化的可能。尝试为骨组织工程找到一个新的体外诱导成骨细胞的方案。方法无菌条件下取39-40周健康产妇剖腹产后1 h的脐带(均征得产妇及其家属同意),去除外膜及血管后,将脐带组织剪碎,接种于培养瓶中。采用贴壁培养法培养并传代。倒置显微镜观察细胞形态及生长情况,免疫细胞化学染色法鉴定细胞表面抗原标志物(CD34,CD44,CD105,CD45)。取生长状态良好的第3代细胞进行细胞爬片,待细胞生长至80%-90%融合时分为2组进行诱导分化,空白对照组加入基础培养基,实验组加入淫羊藿苷和基础培养基诱导培养。倒置显微镜下观察其形态并检测成骨细胞标志物ALP、碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测定、钙化结节的检测。将结果进行统计学分析。结果脐带间充质干细胞原代细胞培养4天后,可见组织块周围细胞成放射状生长,类似成纤维细胞,形态均一,贴壁状态。培养15天后,培养瓶有80%-95%融合,按照1：2或者1：3的比率传代,传代后4h细胞贴壁,1-6代细胞12 h贴壁率>85%,24h贴壁率可达90%。6-8d细胞长满瓶底,细胞融合率可达100%。传代细胞在生长的过程中呈现间充质干细胞的形念特点。第3代脐带间充质干细胞免疫组化染色,显示表面标CD44、CD105强阳性,CD34、CD45阴性,检测结果符合人UCMSCs的特征。诱导培养后形态学检测：实验组可见大量脐带间充质干细胞由漩涡状排列向多角形,立方形细胞发展。空白对照组干细胞无明显变化。成骨性检测：随着培养天数的增加,实验组诱导后细胞液中成骨细胞特征性碱性磷酸酶强阳性表达并且有钙沉积。实验组细胞内ALP含量与对照组比较有显着性差异(P<0.001),实验组钙化结节染色强阳性。结论本实验证明了人脐带中可以提取干细胞并在体外采用组织块贴壁培养法培养,传代,增殖。在一定情况下可以向成骨诱导。在向成骨诱导方面,淫羊藿苷对人脐带间充质干细胞的增殖和成骨分化具有促进作用,可作为骨性诱导因子,在脐带间充质干细胞治疗骨缺损,骨坏死方面有着广阔的前景。
李晓莉[7]2008年在《低氧条件下骨髓间充质干细胞在中空纤维膜反应器中的扩增》文中进行了进一步梳理骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一类存在于骨髓间质层的极少量细胞,不但具有强大的自我更新及多向分化潜能,还具有支持造血的重要功能,并且植入反应弱,易于被外源基因转染并稳定表达,是组织工程和细胞/基因治疗中较为理想的种子细胞,受到广泛关注。但是骨髓中的MSCs的含量非常少,并且在正常培养条件下细胞在传代过程中容易失去增殖和分化活性,这极大影响了间充质干细胞的可用性。所以在扩增过程中,如何在保证增殖数量的同时,减少在细胞增殖过程中产生的损伤,保持干细胞的特性及分泌基质的能力,这是组织工程中首先应解决的问题,也是临床利用这些细胞治疗疾病的前提。为了提高间充质干细胞的扩增倍数并保持干细胞的特性,本文在低氧条件下采用灌注式中空纤维膜生物反应器(Hollow-fiber Membrane Bioreactor)进行体外扩增MSCs。采用密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,将第五代MSCs接种于醋酸纤维素中空纤维膜上预培养24小时后,转移至反应器中。根据骨髓中溶解氧对应的气相氧气浓度的范围是1%-7%,用叁气培养箱制造低氧环境,低氧组设为5%O_2,对照组为20%O_2。连续培养7天后,收获细胞。通过计算细胞的扩增倍数、成纤维细胞-集落形成实验、多向诱导分化检测和流式细胞仪分析,考察低氧动态环境对骨髓间充质干细胞增殖的影响。结果表明,低氧条件下在灌注式中空纤维膜生物反应器内,O_2含量基本保持恒定;MSCs扩增倍数明显增加,7天后扩增倍数达到11倍,明显高于常氧组8倍的扩增倍数。在低氧动态环境下扩增的细胞具有更强的成集落能力,低氧组集落数为112,而对照组为53,并且细胞的增殖潜能和代谢活性都有所增强。多向诱导分化检测和流式细胞仪分析结果显示,骨髓间充质干细胞在低氧动态条件下培养具有更强的诱导分化能力,保持了较好的干细胞特性。因此,本文所采用的培养方法是体外培养与扩增MSCs的一种有效的方法。
宋娜[8]2013年在《肩峰下滑囊间充质干细胞多能性的探讨及PEDF蛋白在成骨分化过程中的作用》文中提出间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）具有分化为多种细胞的潜能。这个特性使得MSC在再生医学领域中成为研究热点。但是MSC缺乏特定的标记，所以对于MSC的生物学特性，目前了解的还不是很透彻。在骨髓，肌腱，脂肪以及滑膜等组织都可以分离得到MSC，细胞来源的广泛性使得MSC成为一种非常有吸引力的治疗资源。将MSC应用到再生医学的研究，首先就需要将MSC从特定组织得到的细胞混合物中分离出来。大量的研究发现了MSC表面的一些标记，包括CD44，CD73，CD105等，但是这些表面标记并不是MSC所特有的。特异标记的缺乏在一定程度上限制了MSC的鉴定与分离，因此，目前的研究中，研究者们通常联合使用几个表面标记来鉴定MSC，从而克服鉴定困难。再生医学研究中，利用干细胞疗法修复或再生组织的研究已经取得了很大的进步。据报道，MSC可以接种到支架结构或是受一些因子刺激后移植到动物体内，可以诱导或促进组织或器官的修复和再生。肩袖损伤是一种常见的临床疾病，由过度使用和年龄老化等原因引起。通过支架材料以及以细胞为基础的治疗肌腱修复的生物学方法也正在研究开发过程中。以骨髓间充质干细胞和肌腱干细胞为基础的修复和再生肌腱的生物学疗法是目前研究相对较多的。但是由于这两种细胞分离的有限性，限制了这两种细胞在肌腱损伤修复方面的应用。因此，我们认为与肩袖肌腱连接的肩峰下滑囊组织的细胞可能会是肌腱修复的种子细胞，更利于肌腱的修复和再生。体内外实验评测我们在肩峰下滑囊组织分离得到的细胞的多能性。细胞来源于手术废弃物的肩峰下滑囊组织。基于上述假设，在本研究中采集肩袖损伤患者病组织，并将该组织用胶原酶和中性蛋白酶消化为单个细胞悬液，培养及分化结果证明从该组织分离的细胞具有向成骨、成脂、成软骨以及肌腱细胞系的潜能。流式细胞术检测结果也表明该细胞表面含有MSC表面标记，细胞是间充质干细胞的亚群。体外BMP12处理细胞后，细胞表达肌腱组织相关的标记基因，细胞形态呈有序的平行状。用BMP12体外处理细胞并接种到HA/TCP支架结构上，然后移植到小鼠体内可以形成范围较大的骨组织以及肌腱样组织。通过组织学分析和DMP1的免疫荧光染色鉴定骨组织的形成，结果显示肩峰下滑囊组织的细胞在体内形成的肌腱样组织呈平行的，波浪形的胶原纤维束状，这是肌腱组织的典型结构特征，而未用BMP12处理的肩峰下滑囊组织间充质干细胞在支架结构上形成了成纤维软骨组织。本研究第一次证明肩峰下滑囊组织来源的细胞在体内具有成骨、成纤维软骨、成肌腱样组织的潜能，表明该细胞可以在肌腱组织工程的应用方面发挥作用。骨组织疾病也是极为常见的临床疾病，其中，骨质疏松是最为常见的骨组织疾病。骨组织疾病主要是由于营养不良，癌症，感染或遗传以及外界因素造成的，而且几乎所有的骨疾病的发病机制都是由于骨吸收与骨形成的不平衡所导致的，发育阶段的骨组织易骨折的状况也是这个原因引起的。成骨发育不全是一种遗传性疾病，在不明原因的情况下经常发生骨折状况，患有该病的小孩被称为“玻璃孩”。色素上皮衍生因子（Pigment epithelium-derivedfactor，PEDF）是一种潜在的具有抗血管生成作用的因子，广泛存在于各种组织。研究表明，PEDF的缺乏是成骨发育不全症的一个标记，PEDF的突变也会导致成骨发育不全症。因此，本研究将探索PEDF在人间充质细胞内的作用及其作用机制。结果表明，含有PEDF的细胞维持液培养的细胞表达成骨细胞相关的基因，在第14天，该培养液培养的细胞表现出ALP活性；另外，在含有PEDF的成骨诱导液内培养的细胞的ALP活性相对于只有成骨分化液诱导的细胞组提高了19%（35.655±1.827U/mg蛋白, P=0.0.041VS29.956±2.100U/μg protein）。通过茜素红定量研究发现，含有PEDF的成骨诱导液培养的细胞形成的钙沉积水平比单独的成骨诱导液培养的细胞组高50%以上（2.108±0.306OD/ml/well/1x104cells/cm2，P=0.017VS1.398±0.098OD/ml/well/1x104cells/cm2）。PEDF特异的siRNA抑制MSC的PEDF表达水平后，ALP活性也下降（PEDFsiRNA组:33.552±2.009U/ng蛋白VS对照siRNA组39.269±3.533U/ng蛋白, P=0.039），同时钙沉积水平也显着降低（PEDF siRNA组：0.654±0.050OD/ml/per well/1x104cells/cm2VS对照组：1.152±0.132OD/ml/well/1x104cells/cm2, P=0.010），外源的PEDF蛋白可以部分恢复ALP活性和钙沉积水平。在人的MSC细胞内，PEDF通过激活ERK和AKT信号通路诱导成骨分化相关基因的表达。这些数据表明，PEDF参与人MSC的成骨分化过程，主要影响细胞的钙沉积水平。综上所述，人类肩峰下滑囊间充质干细胞（HBDMSC）在以MSC为基础的治疗肌腱损伤相关疾病方面具有巨大的潜能，是促进肌腱修复和再生的种子细胞。在人的MSC中，PEDF通过ERK和AKT信号通路调控成骨细胞分化进程，尤其是钙沉积水平。
温学红[9]2004年在《来源于骨髓间充质干细胞和造血干细胞的成骨细胞性质的研究》文中认为目的 1 来源于骨髓的间充质干细胞可以向成骨细胞定向分化，检测在体外分离培养间充质干细胞成骨诱导后细胞的性质，探讨不同诱导时间后细胞的性质并与来源于正常人松质骨成骨细胞进行比较。2 骨髓中含有造血和间充质两种干细胞系统，探讨骨髓中两种干细胞功能的交叉性。方法1 采用Ficoll分离骨髓中的间充质干细胞，体外扩增，流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。在DMEM／F12培养基中加入地塞米松、β-磷酸甘油、抗坏血酸(称为OS培养基)定向诱导MSC分化为成骨细胞，观察细胞形态，用碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原、骨钙素(OCN)染色来鉴定成骨细胞功能，同时用不同浓度的BMP-2和DEX刺激细胞来观察诱导7天、14天的成骨细胞的性质并和来源于人松质骨的成骨细胞进行比较。2 采用MACS CD34+细胞分离系统分离骨髓，流式细胞仪检测分离骨髓CD34+的纯度。分离纯化的CD34+细胞在OS培养基中诱导培养并进行成骨细胞功能鉴定。结果1 流式细胞仪检测结果，体外分离的MSC可表达CD29、CD105，弱表达Stro-1，不表达CD34。诱导培养后细胞形态由纤维状变成多角形，ALP、Ⅰ型胶原、骨钙素染色呈阳性。体外诱导分化14天的成骨样细胞比诱导7天的细胞更加成熟，但其成骨能力比正常的成骨细胞成骨能力要弱。2 MACS分离系统分离骨髓CD34+细胞后纯度达95％，分离效果较好，CD34+细胞直接培养可获得贴壁细胞。但CD34+细胞体外扩增潜能较小。CD34+细胞诱导培养7天后可以检测到成骨细胞的标志即ALP、Ⅰ型胶原、OCN的表达以及钙沉积。结论1 不同诱导时间下骨髓间充质干细胞来源的成骨细胞成熟度不同。2 来源于间充质干细胞的成骨细胞成骨活性要弱于正常成人松质骨来源的成骨细胞。3 骨髓中造血干细胞(CD34+细胞)中含有成骨细胞的前体细胞，提示骨髓中造血和间充质两种干细胞的功能有交叉。
高恒恒[10]2017年在《骨髓间充质干细胞在前列腺癌骨转移中的作用》文中研究指明目的前列腺癌发展到晚期阶段常伴有骨骼的转移,严重影响着患者的生活质量。本研究通过体外细胞实验研究前列腺癌好发骨转移的原因和机制。通过研究骨髓间充质干细胞对于前列腺癌发生骨转移的作用机制,进一步寻找临床预防、治疗前列腺癌骨转移的新对策,从而采取相应的干预措施抑制前列腺癌的复发和转移,最终提高患者的生活质量。方法1.(1)提取小鼠骨髓,根据细胞贴壁生长方式不同,通过全骨髓培养的方法分离并纯化小鼠骨髓间充质干细胞,培养过程中观察细胞的形态学变化。(2)在体外通过诱导剂对间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞的定向诱导,再行油红O染色、茜素红染色,对间充质干细胞进行鉴定。(3)收集培养间充质干细胞的上清液,标记记为间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)。用MSC-CM培养对数生长期的前列腺癌细胞C42细胞1-5天,通过MTT的方法检测各细胞培养孔的吸光值,从而绘制出生长曲线。(4)细胞划痕实验,观察充质干细胞条件培养基处理C42细胞48个小时后细胞的爬片情况,使用Image J软件计算培养细胞的划痕面积。Transwell实验,在上室加入一定数量细胞,下室加入适量的充质干细胞条件培养基,培养24小时后,通过Giemsa染色观察转移至下室细胞的数量。2.(1)利用免疫磁珠细胞分选的方法(MACS)分选出CD133+前列腺癌干细胞,通过RT-PCR和Western Blot实验进一步验证细胞的干性。(2)用DMEM培养基培养CD133+C42细胞1-5天。通过MTT的方法检测各细胞培养孔的吸光值,绘制生长曲线。(3)用间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)培养前列腺癌干细胞CD133+C42,分别在第2天及第4天后提取细胞的RNA及蛋白。通过RT-PCR和Western Blot实验观察前列腺癌干细胞表面标志物CD133、CD44的表达情况。结果1.(1)间充质干细胞在培养24小时后开始贴壁,可见短梭形、圆形以及多角形的细胞贴壁生长。3天后细胞突起长短不一。细胞生长第8天细胞密集生长。(2)间充质干细胞诱导形成的脂肪细胞脂质聚集,经过油红O染色,脂滴被染色橘红色,细胞核呈浅蓝色。经诱导形成的成骨细胞形态为多角形,体积增大。经过茜素红染色,产生深红色化合物。(3)生长曲线结果可见MSC-CM组的细胞增殖能力明显增加。(4)细胞划痕实验显示MSC-CM组细胞的划痕面积明显大于对照组。Transwell实验显示MSC-CM组细胞的数量明显大于对照组。2.(1)免疫磁珠细胞分选法(MACS)分选出CD133+C42,通过基因和蛋白水平对其检测,结果符合肿瘤干细胞的生物学特性。(2)MTT实验结果显示,MACS分选的前列腺癌干细胞CD133+C42在体外的增殖能力与未分选的前列腺癌细胞C42比较有明显增强。(3)对照组CD133、CD44表达逐渐减弱,而MSC-CM实验组能够稳定表达。结论1.骨髓间充质干细胞(MSCs)能够显着促进前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。2.骨髓间充质干细胞(MSCs)能够维持前列腺癌干细胞干性的稳定表达。
参考文献：
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[2]. 肝细胞生长因子修饰的人脐带间充质干细胞对再障模型小鼠造血功能的影响[D]. 李敬东. 郑州大学. 2015
[3]. 当归多糖调控CML患者骨髓间充质干细胞衰老抑制白血病干细胞增殖的机理研究[D]. 耿珊. 重庆医科大学. 2016
[4]. 全身照射引起小鼠Flk-1～+骨髓间充质干细胞细胞衰老不相关的成骨潜能改变及其与骨骼和造血系统损伤的关系[D]. 马杰. 中国协和医科大学. 2007
[5]. 黄连素对骨髓间充质干细胞成骨分化作用的初步研究[D]. 张瑞. 南京大学. 2017
[6]. 淫羊藿苷诱导人脐带间充质干细胞分化为成骨细胞的实验研究[D]. 张帆. 郑州大学. 2011
[7]. 低氧条件下骨髓间充质干细胞在中空纤维膜反应器中的扩增[D]. 李晓莉. 大连理工大学. 2008
[8]. 肩峰下滑囊间充质干细胞多能性的探讨及PEDF蛋白在成骨分化过程中的作用[D]. 宋娜. 吉林大学. 2013
[9]. 来源于骨髓间充质干细胞和造血干细胞的成骨细胞性质的研究[D]. 温学红. 天津医科大学. 2004
[10]. 骨髓间充质干细胞在前列腺癌骨转移中的作用[D]. 高恒恒. 天津医科大学. 2017
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