郑颖娟[1]2004年在《免疫活性细胞和肿瘤耐药细胞的中性鞘糖脂表达与肿瘤免疫的相关关系研究》文中研究表明目的：鞘糖脂广泛分布于真核细胞质膜，它们不仅是细胞的基本结构单位，而且随着细胞的生命状态和功能状态不断地发生着变化，在细胞的粘附、生长、分化、增殖、信号转导、抗原递呈等基本活动中发挥重要作用。按其所含单糖性质，鞘糖脂分为中性鞘糖脂和酸性鞘糖脂。中性鞘糖脂仅含中性糖类，按所含糖基数目的多少，又分别称为单己糖神经酰胺(CMH)、二己糖神经酰胺(CDH)、叁己糖神经酰胺(CTH)及四己糖神经酰胺等。四己糖神经酰胺因是人类红细胞膜上的主要鞘糖脂，故又被称为红细胞糖苷脂(Glob)。既往由于受限于中性鞘糖脂检测手段的灵敏度，对鞘糖脂生物学功能的研究多集中在神经节苷脂和大块组织的中性鞘糖脂上，对淋巴细胞这样鞘糖脂含量极微组织中性鞘糖脂的研究甚是缺乏。所以，本课题旨在建立一种灵敏度高、稳定性好的中性鞘糖脂的检测方法，并应用该方法检测免疫活性细胞和肿瘤细胞中性鞘糖脂在不同状态下的表达规律，初步探讨效靶双方中性鞘糖脂的表达与肿瘤细胞免疫的相关关系，为深入研究肿瘤免疫的分子机制及提高过继性细胞免疫治疗(AIT)的疗效提供新思路。 方法：1．中性鞘糖脂放射自显影检测方法的建立：(1)应用~(14)C标记的鞘糖脂合成前体—棕榈酸为示踪剂，应用液闪仪测定不同活度梯度示踪剂所标记的KB细胞含量，建立示踪放射比活度与细胞标记量的曲线，确定所需的最佳放射比活度；(2)对提取的中性鞘糖脂按不同的放射活度进行高效薄层层析后，行放射自显影，摸索最佳的曝光时间。(3)比较放射自显影与碘显色法的检测灵敏度。2．不同时期LAK细胞中性鞘糖脂的表达与其形态及功能的相关性研究：(1)在培养过程中观察PHA-LAK细胞的形态学变化；(2)在LAK-I期和LAK-M期，应用~(14)C棕榈酸为示踪剂，标记PHA-LAK细胞。收集两期细胞的中性鞘糖脂，进行放射自显影。3．与敏感、耐药及耐药逆转株共育后LAK细胞中性鞘糖脂的表达与肿瘤免疫的关系研究：(1)在LAK-M期，应用~(14)C棕搁酸标记LAK细胞，之后与肿瘤亲本株KB细胞、耐药株KBVZoo细胞以及耐药逆转株KBVV细胞共育24小时，期间连续观察LAK细胞的形态学变化;(2)采用MTT比色法，研究LAK细胞及NK细胞对叁株肿瘤细胞的杀伤活性;(3)收集共育前后标记LAK细胞的中性鞘糖脂，进行放射自显影。3.敏感、耐药及耐药逆转株中性鞘糖脂的表达与肿瘤免疫的关系研究:(l)应用’4c棕搁酸标记KB、KBv20。以及KBvV细胞，之后与LAK细胞共育24小时，检测共育前后叁株肿瘤细胞中性鞘糖脂的表达;(2)观察共育24小时后叁株肿瘤细胞的形态学变化;(3)叁株肿瘤细胞对LAK细胞溶瘤的敏感性观察。 结果:1.’4c棕搁酸能较好地标记细胞中性鞘糖脂，选择合适的示踪剂量和曝光时间可以获得清晰稳定的放射自显影图像，而且在碘显色法无法清晰显示的水平，依然可以获得清晰的放射自显影图像。在应用放射自显影法检测不同状态下LAK细胞中性鞘糖脂的表达时发现，该方法能清晰稳定地检测到低至10“水平的LAK细胞的中性鞘糖脂，比常规碘显色法灵敏度提高了50一100倍。2.生长过程中PHA一LAK细胞形态学与中性鞘糖脂表达的变化:(l)形态学变化:在LAK一I期，细胞变大，粘附力增强，可见贴壁生长，细胞之间则相互聚集形成集落，且随着刺激时间的延长，集落越来越大;在用无丝裂原的培养液换液，进入LAK一M期后，细胞集落逐渐消散，细胞变小;在LAK一Mp期，细胞变形能力较强，多见伪足现象;随着培养时间的延长，至LAK一Ma期，细胞变圆，伪足现象减少并逐渐消失。(2)中性鞘糖脂表达的变化:PHA一LAK细胞在LAK一I期和LAK一M期其中性鞘糖脂的表达均以CTH和Glob为主，但四种中性鞘糖脂的表达比例存在着明显的差异。LAK一I期短糖链中性鞘糖脂CMH和CDH的含量明显高于LAK一M期;在LAK一M期，随着培养时间的延长，CMH和CDH的含量逐渐降低直至无法检测到，而CTH和Gfob高级复杂糖脂的比例逐渐升高。3.与不同肿瘤细胞共育后LAK细胞形态、功能及中性鞘糖脂表达的变化:(l)形态学变化及比较:共育后不久，LAK细胞即发生变形运动，伸出伪足，并向靶细胞周围聚集。继之，LAK细胞的伪足与靶细胞紧密接触，靶细胞胞浆突起回缩，胞体变圆，两者接触处可见靶细胞呈泡沫样变形。1至2小时内，可见大量靶细胞被LAK细胞包围，LAK细胞在接触一个靶细胞的同时，仍能伸出伪足接触邻近靶细胞，将其拉近，形成较大的由多个LAK细胞和靶细胞组成的类似集落的细胞团块，而靶细胞多数变形，部分胞体破碎或呈固缩状。与KB细胞组相比，在KBv200和KBVV组，LAK细胞出现在靶细胞周围的时间早，数量多，伸出伪足的LAK细胞比率高，出现集落样细胞团块的时间亦早。(2)杀瘤活性的比较:NK和LAK细胞对耐药株KBv20。耐药性逆转前后的杀伤率均明显高于敏感株KB(p<0.05)，而对耐药株和逆转株的杀伤率无统计学差异(P>.05)。LAK对各株的杀伤活力均明显强于NK细胞(p<0.05)。(3)与不同肿瘤细胞共育后，LAK细胞中性鞘糖脂表达的变化:共性:与共育前比较，短糖链中性鞘糖脂CMH和CDH出现表达，CDH的含量增高得尤为明显;CTH和Glob高级复杂糖脂的百分含量因之减少。个?
张辉[2]2005年在《晚期卵巢癌多药耐药的免疫逃逸机制以及CIK细胞实验性治疗的基础与临床研究》文中指出目的:卵巢癌发生率占妇科恶性肿瘤的23~27%,10 年生存率在4.0~20.0%,是妇科肿瘤病人的第一位死亡原因,大部分患者发现时已属晚期,其转移途径主要为直接蔓延及腹腔种植,广泛的盆腹腔种植转移使手术难以切除干净。目前其治疗方法虽多,但5 年生存率尚无明显改善,其中一个重要原因就是卵巢癌化疗过程中多药耐药性(multidrug resistance,MDR)的产生,引发MDR 的耐药蛋白,往往随着化疗的用药过程过度表达,造成化疗药物不能进入其作用靶点-细胞核,而导致化疗失败,顺铂(CDDP)耐药就是卵巢癌患者化学治疗中颇为棘手的问题之一。卵巢癌临床耐药的产生与多种耐药相关基因的共表达有关,共同表达是耐药相关基因受共同因子调控的证据,从一个侧面反映了多药耐药机制的复杂性,这也是卵巢癌多年来化疗未取得实质性进展的重要原因,只有通过多基因的联合检测,才能更客观全面的筛选针对不同耐药机制的高效低毒药物,指导个体化治疗,同时对前瞻性优化药物、预测药物敏感性和判断疗效具有重要的临床应用价值。目前围绕其展开的研究大都以肿瘤原发病灶为主要研究对象,而晚期卵巢癌则是以广泛腹腔内癌和大量腹水形成为特征,其术后辅助化疗主要目的是清除微小转移灶,但转移灶是否与原发灶癌组织耐药基因的表达存在差异还不清楚,了解耐药基因在原发灶和转移灶肿瘤细胞中表达的差异,对晚期卵巢癌患者治疗方案的选择和逆转措施的实施具有重要的指导意义。近年来有关多药耐药性肿瘤免疫反应特点的研究倍受关注,国内外研究显示多药耐药细胞比敏感细胞更容易逃避机体的免疫识别和攻击。人类白细胞抗原(HLA)和共刺激分子B7 表达的降低可能是卵巢癌细胞逃避机体免疫监视的主要原因,且耐药亚株的共刺激信号B7 表达高于亲本敏感株,免疫效应细胞对MDR 肿瘤细胞的杀伤活性高于对其亲代药物敏感肿瘤细胞系, 提示MDR 发生后,机体的免疫监视功能有重新被激活的可能
参考文献：
[1]. 免疫活性细胞和肿瘤耐药细胞的中性鞘糖脂表达与肿瘤免疫的相关关系研究[D]. 郑颖娟. 第一军医大学. 2004
[2]. 晚期卵巢癌多药耐药的免疫逃逸机制以及CIK细胞实验性治疗的基础与临床研究[D]. 张辉. 河北医科大学. 2005