（辽宁省肿瘤医院肿瘤内科，辽宁沈阳110042）
中图分类号R735.34文献标志码A文章编号1008-0408（2015）2-0012-02
摘要目的：研究细胞周期的信号调控机制的意义。方法：本人收集辽宁省肿瘤医院手术切除并经病理学检查证实的大肠癌标本及其配对正常大肠黏膜，构建完成大肠癌及其癌前病变的组织微阵列石蜡块，进行免疫组化分析。结果:大肠癌组织中Ecadherin蛋白表达均与患者年龄、性别、大肠癌Borrmann分型、组织学类型、Lauren分型及侵袭深度无关,P>0.05，但两者表达与大肠癌淋巴结转移密切相关，即有淋巴结转移组Ecadherin及阳性表达率显著高于无淋巴结转移组，P<0.05。在大肠癌组织中Ecadherin蛋白表达表达呈正相关，有统计学意义（rk=0.288，P=0.013）。结论：Ecadherin蛋白可以作为大肠癌诊断和预后判断的分子标志物，CD133不仅参与了大肠黏膜癌变的起始阶段,同时也参与了癌变的全部进程,CD133有望作为一个有临床应用价值的大肠癌早诊和大肠黏膜癌变预警的蛋白标志物。
关键词大肠癌；STAT3；Ecadherin；CD133；免疫组织化学
大肠癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，长期以来我国一直是大肠癌高发区，因此大肠癌的治疗研究仍是我国医务人员工作、研究的重点。迄今关于大肠癌发病机制及治疗研究仍没有重大突破，尚不能满足临床对大肠癌进行有效控制的需要。在正常情况下，大肠黏膜上皮细胞增殖和凋亡间保持动态平衡，这是其结构完整和功能健全的基础。这种平衡有赖于癌基因、抑癌基因，以及某些调节肽等的调控，一旦失控，癌基因被激活而抑癌基因被抑制，促使增殖加快，DNA损伤增加但得不到修复，产生非整倍体，而凋亡机制不能相应启动，使细胞获永生，渐进性细胞周期调控机制的破坏则最终进展到癌。因此，深入研究细胞周期的信号调控机制具有重要意义。
1材料与方法
本人收集辽宁省肿瘤医院手术切除并经病理学检查证实的大肠癌标本及其配对正常大肠黏膜各91例，肠上皮化生35例，异型增生7例。91例大肠癌患者中男56例，女35例；年龄26～81岁，中位年龄60岁；大肠癌大体Borrmann分型：Ⅱ型6例，Ⅲ型78例，Ⅳ型7例；WHO病理组织学分型：乳头状腺癌2例，高分化管状腺癌8例，中分化管状腺癌27例，低分化腺癌32例，黏液腺癌14例，印戒细胞癌4例，未分化癌4例。所有标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，制成4μm厚切片备用。所有患者术前均未接受放、化疗。
大肠癌组织芯片制作：采用组织芯片制作仪(Microarrayer,BeecherInstruments,USA)制作组织芯片。构建完成大肠癌及其癌前病变的组织微阵列石蜡块1、2、3和4（蜡块1：含115个组织芯；蜡块2：含107个组织芯；蜡块3：含108个组织芯；蜡块4：含121个组织芯）。将组织芯片蜡块行连续切片，切片厚度为4μm，用于免疫组织化学染色的切片裱于经0.1%多聚赖氨酸防脱片处理的载玻片上，60°C烤片1小时，58°C中继续烤片18小时，常温保存备用。
免疫组化染色检测STAT3、Ecadherin和CD133蛋白表达：采用Envision方法对大肠癌及其癌前病变组织芯片进行免疫组化染色。兔抗人STAT3单克隆抗体（工作浓度1：120）和Ecadherin单克隆抗体（工作浓度1：100）分别为美国CST和SAB公司产品；兔抗人CD133多克隆抗体购自福州迈新公司。PV-9000通用型二步法免疫组化检测试剂盒和DAB显色试剂盒均购于北京中杉金桥生物有限公司。所有操作步骤依据产品说明书进行，每组试验均以PBS代替一抗作为阴性对照。
结果判定：免疫组化染色以细胞浆和/或细胞核中出现清晰棕黄色颗粒为阳性细胞。每一病例选择2个有代表性的高倍镜视野，计数200个细胞，阳性细胞占计数同类细胞百分率≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分。染色强度以阳性细胞呈色反应为准：无特异着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；然后按染色强度和阳性细胞所占的百分比的乘积将结果分为：0分为阴性（－）；1～4分为弱阳性（+）；5～8分为中度阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。
统计学分析：采用SPSS11.5统计学软件处理，STAT3、Ecadherin及CD133蛋白在正常大肠黏膜和大肠癌及其癌前病变中的表达阳性率的比较应用χ²检验和Fisher确切概率法，STAT3、Ecadherin及CD133三者的表达相关性评价应用Kendall'stau-b等级相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
STAT3蛋白阳性信号主要分布在细胞浆。STAT3蛋白在肠化生(95.2%,20/21)、不典型增生(85.7%,6/7)和大肠癌组织中(67.0%,60/91)的阳性表达率显著高于正常大肠粘膜(6.6％,85/91)，P<0.00l。异型增生和大肠癌组织中STAT3的表达阳性率之间差异无统计学意义,P=0.738。大肠癌组织中STAT3表达阳性率显著低于肠上皮化生组(x2=10.91，P=0.012)。Ecadherin蛋白阳性信号主要分布在细胞核，部分在细胞浆表达。Ecadherin蛋白在肠化生(71.4％，15/21)、不典型增生(100％，5/5)和大肠癌组织中(60.0％，30/50)的阳性表达率显著高于正常大肠粘膜(32％，16/50)，P<0.05。肠上皮化生、异型增生组织与大肠癌组织中Ecadherin的表达阳性率之间差异无统计学意义（P=0.710；P=0.050）。大肠癌组织中Ecadherin蛋白表达均与患者年龄、性别、大肠癌Borrmann分型、组织学类型、Lauren分型及侵袭深度无关,P>0.05，但两者表达与大肠癌淋巴结转移密切相关，即有淋巴结转移组Ecadherin及阳性表达率显著高于无淋巴结转移组，P<0.05。在大肠癌组织中Ecadherin蛋白表达表达呈正相关，有统计学意义（rk=0.288，P=0.013）。CD133蛋白阳性信号主要分布在细胞浆，CD133在肠上皮化生(32/35,91.4%)、不典型增生(4/4,100%)和大肠癌(74/91,81.3%)组织中的阳性表达率显著高于远癌正常大肠黏膜(2/51,3.9%),P<0.001。肠上皮化生组CD133阳性表达率显著高于大肠癌组(χ²=12.694，P=0.005),而异型增生组织与大肠癌组织中CD133表达阳性率之间未见统计学差异,P=0.118。大肠癌组织中CD133蛋白表达均与患者年龄、性别、大肠癌Borrmann分型、组织学类型、Lauren分型及侵袭深度无关,P>0.05，但与大肠癌淋巴结转移密切相关，即有淋巴结转移组CD133阳性表达率显著高于无淋巴结转移组，P<0.05。大肠癌组织中Ecadherin蛋白表达与CD133蛋白表达未见相关（rk=0.081，P=0.537）。
3结论
细胞信号转导是外界环境刺激因子和胞间通讯信号分子等作用于细胞表面（或胞内）受体后，跨膜转换形成胞内第二信使，以及经过其后的信号途径级联传递、引起细胞生理反应和诱导基因表达的过程。细胞信号转导包括直接信号转导（细胞间的缝隙连接）和间接信号转导（跨膜信号转导）。近年研究发现STAT3广泛表达于不同类型的细胞和组织中，参与细胞生长、凋亡、恶变等生理功能的调控。细胞因子激活Jauns激酶家族的酪氨酸激酶(Jauns激酶)，后者磷酸化并激活STAT蛋白，激活前的STAT蛋白属于胞浆蛋白，而活化后的STAT则以同源或异源二聚体形式移位到胞浆，在靶基因的启动区与特定的DNA元件结合，发挥其生物学活性。亦有实验表明，细胞内的刺激可以激活STAT，已有大量实验证实STAT与中枢神经系统疾病、肿瘤、心血管系统疾病等多种病理生理过程有着密切的关系。多数取自人类的癌标本和源于肿瘤的细胞株中都有组成性活化的STAT蛋白，其中以STAT3最为常见。研究发现STAT3的异常活化可以促进细胞的分化增殖，抑制细胞的凋亡，有利于肿瘤细胞的发生发展及耐药细胞株的出现。CD133是凋亡抑制因子IAPs家族(Inhibitorsofapoptosis)的新成员,被认为在bcl-2的下游阻断了半胱氨酸蛋白酶Caspase-3和Caspase-7凋亡调节通路，具有抑制细胞凋亡促进细胞增殖的作用。有研究表明CD133可能是STAT3信号通路的一个下游靶基因。
1、Ecadherin在细胞中的过度激活在大肠癌的发生发展、侵袭转移的过程中起着重要的作用。Ecadherin与代表大肠癌恶性生物学本质的淋巴结转移密切相关。本研究结果提示Ecadherin蛋白可以作为大肠癌诊断和预后判断的分子标志物，对其进行深入研究有望为大肠癌的诊断与治疗提供新的思路。
2、CD133能够维持肿瘤生长和具有成瘤能力。是联系细胞周期和细胞凋亡的重要因子。本研究表明CD133不仅参与了大肠黏膜癌变的起始阶段,同时也参与了癌变的全部进程,CD133有望作为一个有临床应用价值的大肠癌早诊和大肠黏膜癌变预警的蛋白标志物。本研究结果也提示CD133也有望成为临床判断大肠癌预后不良的指标。
参考文献
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作者简介：
李远航（1973—？）男职称：副主任医师博士所在单位：辽宁省肿瘤医院肿瘤内科
白维君（1962—？）女职称：主任医师博士所在单位：辽宁省肿瘤医院肿瘤内科
张建国（1975—？）男职称：副主任医师硕士所在单位：辽宁省肿瘤医院肿瘤内科