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脉冲磁场致单核细胞增生李斯特菌失活的作用机制研究

2020-12-08阅读(643)

脉冲磁场致单核细胞增生李斯特菌失活的作用机制研究

论文摘要

单核细胞增生李斯特菌（Listeria Monocytogenes）是一种食源性致病微生物,广泛存在于肉制品、水产品、豆制品、酱料等食品中,感染后可引起人畜共患李斯特菌病。作为非热加工技术之一,脉冲磁场杀菌因其具有对食品品质影响小等优点而受到学术界的广泛关注。论文首先研究脉冲磁场对单核细胞增生李斯特菌的灭活效果,再从细菌形态结构、Ca2+跨膜行为角度分析脉冲磁场对单核细胞增生李斯特菌的灭活机制,并进一步研究脉冲磁场对单核细胞增生李斯特菌基因表达、蛋白表达的影响,从分子水平上分析脉冲磁场灭活单核细胞增生李斯特菌的机制,以期为脉冲磁场杀菌技术的产业化提供理论依据。论文的主要研究结果如下:（1）采用磁场强度2-8 T、脉冲数10-50个的脉冲磁场处理单核细胞增生李斯特菌,当磁场强度为8 T、脉冲数为20时,单核细胞增生李斯特菌的残留率最低,为9.60%。通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察脉冲磁场处理前后的单核细胞增生李斯特菌,发现脉冲磁场处理后的菌体出现了变形,细胞内容物不完整。（2）采用Fluo-4 AM钙离子荧光探针测定单核细胞增生李斯特菌胞内的钙离子浓度来表征钙离子的跨膜运动。Fluo-4 AM钙离子荧光探针在单核细胞增生李斯特菌中的最优负载条件为:温度37℃,时间120 min。脉冲磁场处理后,荧光强度与菌落总数显著负相关（P<0.01）,说明菌体的死亡与胞内钙离子浓度的升高存在密切的联系。激光共聚焦显微镜观察进一步证明脉冲磁场处理加快了钙离子的跨膜运动,胞内钙离子浓度的升高导致了单核细胞增生李斯特菌的死亡。（3）采用转录组学法研究脉冲磁场处理前后单核细胞增生李斯特菌的基因表达变化。对差异基因进行GO分析发现:脉冲磁场处理能够破坏细菌的趋化性和运动性;影响与代谢相关基因的表达;影响与细胞膜成分相关的基因的表达;调控与DNA损伤相关的基因;调控对有害物做出反应的相关基因,引起细胞对脉冲磁场刺激的应激反应等。对差异基因进行KEGG代谢通路分析发现:差异基因参与趋化性和运动性相关的代谢途径;参与碳水化合物等相关的代谢途径;参与ABC转运体相关的代谢途径;参与群体感应相关的信号传导途径;参与双组分系统相关的信号传导途径。对5个目的基因（lmo0229、lmo0796、lmo1475、lmo1557及lmo2205）进行荧光定量PCR验证,发现lmo0229、lmo0796、lmo1475、lmo1557表达量分别上调了4.3、2.37、2.38、2.52倍,lmo2205表达量下调了0.57倍,其结果与转录组学试验结果一致。（4）采用蛋白质组学法研究脉冲磁场处理前后单核细胞增生李斯特菌的蛋白表达变化。对差异表达蛋白进行GO分析,发现脉冲磁场影响了单核细胞增生李斯特菌的碳水化合物代谢、核苷酸代谢、硫代谢等代谢过程;并通过对胞内辅酶的影响进一步调控糖、蛋白质等物质的代谢过程;影响细菌翻译过程;影响细菌DNA等遗传物质。KEGG代谢通路分析发现,差异蛋白参与碳水化合物、核苷酸、硫代谢等代谢通路;此外,氨基酸代谢通路也都受到了脉冲磁场的影响。因此,脉冲磁场影响了单核细胞增生李斯特菌正常的生理和代谢活动,从而导致了细菌的死亡。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  •   1.1 单核细胞增生李斯特菌
  •   1.2 食品杀菌技术
  •     1.2.1 热杀菌技术
  •     1.2.2 食品非热杀菌技术
  •     1.2.3 食品物理杀菌技术的应用
  •   1.3 脉冲磁场杀菌技术
  •     1.3.1 脉冲磁场杀菌技术简介
  •     1.3.2 脉冲磁场杀菌技术研究进展
  •   1.4 转录组学在非热杀菌中应用
  •   1.5 蛋白组学在非热杀菌中应用
  •   1.6 研究意义及内容
  •     1.6.1 研究意义
  •     1.6.2 主要内容
  •     1.6.3 技术路线图
  • 第二章 脉冲磁场对单核细胞增生李斯特菌灭活效果及对细胞形态的影响
  •   2.1 试验材料
  •     2.1.1 试验材料与试剂
  •     2.1.2 主要仪器与设备
  •   2.2 试验方法
  •     2.2.1 单核细胞增生李斯特菌的培养
  •     2.2.2 生长曲线的测定
  •     2.2.3 脉冲磁场灭活单核细胞增生李斯特菌的处理
  •     2.2.4 单核细胞增生李斯特菌形态结构观察
  •   2.3 结果与讨论
  •     2.3.1 单核细胞增生李斯特菌生长曲线
  •     2.3.2 磁场强度和脉冲数对单核细胞增生李斯特菌灭活效果的影响
  •     2.3.3 脉冲磁场对单核细胞增生李斯特菌形态和结构的影响
  •   2.4 本章小结
  • 2+跨膜行为的影响'>第三章 脉冲磁场对单核细胞增生李斯特菌Ca2+跨膜行为的影响
  •   3.1 试验材料
  •     3.1.1 试验材料与试剂
  •     3.1.2 主要仪器与设备
  •   3.2 试验方法
  •     3.2.1 单核细胞增生李斯特菌的培养
  •     3.2.2 Fluo-4 AM荧光特性测定
  •     3.2.3 Fluo-4 AM负载单核细胞增生李斯特菌效果测定
  •     3.2.4 Fluo-4 AM负载单核细胞增生李斯特菌最优条件的测定
  •     3.2.5 单核细胞增生李斯特菌钙离子跨膜行为的测定
  •     3.2.6 激光共聚焦显微镜观察单核细胞增生李斯特菌胞内钙离子
  •   3.3 结果与讨论
  •     3.3.1 Fluo-4 AM荧光特性分析
  •     3.3.2 Fluo-4 AM负载单核细胞增生李斯特菌的效果分析
  •     3.3.3 Fluo-4 AM负载单核细胞增生李斯特菌的最优测定条件
  •     3.3.4 脉冲磁场对单核细胞增生李斯特菌钙离子跨膜行为及菌体死亡的影响
  •     3.3.5 激光共聚焦显微镜观察脉冲磁场处理前后单核细胞增生李斯特菌胞内钙离子
  •   3.4 本章小结
  • 第四章 脉冲磁场对单核细胞增生李斯特菌转录组的影响
  •   4.1 试验材料
  •     4.1.1 试验材料与试剂
  •     4.1.2 主要仪器与设备
  •   4.2 试验方法
  •     4.2.1 单核细胞增生李斯特菌的培养
  •     4.2.2 单核细胞增生李斯特菌的RNA提取及测序
  •     4.2.3 生物信息学分析
  •     4.2.4 荧光定量PCR验证差异表达基因
  •   4.3 结果与讨论
  •     4.3.1 样品间相关性检验
  •     4.3.2 差异基因表达水平的聚类分析
  •     4.3.3 差异表达基因的筛选
  •     4.3.4 差异表达基因的GO分析
  •     4.3.5 差异表达基因的KEGG分析
  •     4.3.6 差异表达基因的荧光定量PCR验证
  •   4.4 本章小结
  • 第五章 脉冲磁场对单核细胞增生李斯特菌蛋白组的影响
  •   5.1 试验材料
  •     5.1.1 试验材料与试剂
  •     5.1.2 主要仪器与设备
  •   5.2 试验方法
  •     5.2.1 单核细胞增生李斯特菌的培养
  •     5.2.2 单核细胞增生李斯特菌的蛋白提取
  •     5.2.3 蛋白浓度测定
  •     5.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
  •     5.2.5 胰蛋白酶酶解标记
  •     5.2.6 反相色谱分离
  •     5.2.7 色谱与质谱条件
  •     5.2.8 数据处理
  •   5.3 结果与讨论
  •     5.3.1 电泳图谱
  •     5.3.2 差异表达蛋白的鉴定
  •     5.3.3 差异表达蛋白的GO分析
  •     5.3.4 差异表达蛋白的KEGG分析
  •   5.4 本章小结
  • 第六章 总结及展望
  •   6.1 主要结论
  •   6.2 创新性
  •   6.3 工作展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读硕士期间取得的研究成果
  • 攻读硕士期间参与的科研项目

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 张咪

    导师: 钱静亚

    关键词: 脉冲磁场,单核细胞增生李斯特菌,转录组学,蛋白质组学

    来源: 江苏大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,轻工业手工业

    单位: 江苏大学

    分类号: TS201.3

    总页数: 83

    文件大小: 8544K

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