程瑞芳[1]2004年在《来源于脐血与骨髓中间充质干细胞和造血干细胞的比较》文中研究说明目的： 观察体外分离培养的脐血与骨髓中间充质干细胞和造血干细胞扩增及向成骨细胞诱导的特性，探讨脐血与骨髓干细胞的差异和造血干细胞向成骨细胞的分化。 方法： 用密度梯度离心法体外分离、纯化和培养脐血与骨髓中单个核细胞(MNC)和CD34+细胞，加入SCF和TPO促脐血CD34+细胞扩增。在细胞贴壁后，加入地塞米松、β-甘油磷酸和抗坏血酸，向成骨细胞定向诱导。用瑞氏染色、碱性磷酸酶(ALP)染色、骨钙素和Ⅰ型胶原免疫组化染色、矿化结节染色和流式细胞仪分型作为检测手段，观察脐血与骨髓中MNC和CD34+细胞的形态、生长特性、诱导分化和表面标志的不同。 结果： 1、分离18份脐血，只有12份获得了贴壁细胞。MNC体外培养可以获得贴壁细胞，但形态不均一，主要为破骨样细胞和纤维样细胞，传代不超过二次。向成骨细胞诱导后细胞形态变化不大，ALP增多，骨钙素和Ⅰ型胶原染色阳性，矿化结节染色显示无钙沉积。脐血CD34+细胞经SCF和TPO刺激，扩增潜能较高，体外扩增后可以获得少量贴壁细胞，传代后不再贴壁生长。 2、分离12份骨髓，均获得了贴壁细胞。MNC和CD34+细胞体外培养可以获得形态均一的纤维样贴壁细胞，是间充质干细胞(MSC)，无需添加细胞因子即可扩增，可多次传代。贴壁细胞向成骨细胞诱导后细胞变大，ALP明显增多，分泌骨钙素和Ⅰ型胶原，有钙沉积。 结论： 1、骨髓CD34+细胞低表达Stro-1，其中含有成骨细胞的前体细胞：脐血 天津医科大学硕士研究生论文CD34+细胞高表达Str。一1，在体外只能能获得极少的贴壁细胞，提示骨髓造血细胞与脐血造血细胞(CD34+细胞)的性质不同。 2、脐血中是否含有间充质样干细胞仍然是一个有争议的问题，我们的实验结果显示，脐血不能获得典型的间充质样干细胞。 3、脐血MNC体外培养后获得贴壁细胞，虽然从形态上呈破骨细胞样，但向成骨诱导后可以表达成骨细胞标志物，如ALP、Coll和OCN，提示这些细胞在功能上至少己经具备了某些成骨细胞的性质。
曲琦[2]2016年在《脐血源内皮祖细胞在造血干细胞移植中的作用及机制探究》文中指出一.脐血源内皮祖细胞(cord blood derived endothelial progenitorcell,CB-EPC)的体外分离、培养及鉴定目的:探讨体外分离及扩大培养CB-EPC的方法,在本实验室建立稳定的CB-EPC培养体系。方法:以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞(mononuclear cells,MNCs),将MNCs接种于纤连蛋白(Fibronectin,Fn)包被的培养瓶中,培养基为endothelial growth medium-2(EGM-2),其中添加recombinant human fibroblast growth factor-β(rh FGF-β),recombinant human epidermal growth factor(rh EGF),R3-insulin-like growth factor(IGF)-1,vascular endothelial growth factor(VEGF),ascorbic acid and GA-100)及10%FBS。采用贴壁培养培养72小时(hour,h)后弃未贴壁细胞的培养方式。2-3天半量换液一次并观察贴壁细胞生长状况。待细胞出现EPC形态特征并达到80%以上融合后,可传代培养。以流式细胞术检测所分离培养细胞表面CD34,CD45,CD133,CD31,KDR,及CD14抗原表达情况,鉴定是否为EPC表型。用CCK8法分析实验所选用的Passage(P)1-P5之间EPC的体外增殖能力,以成熟内皮细胞株人脐静脉内皮细胞(human umbilical veins endothelial cells,HUVECs)为对照。以Matrigel胶铺板,HUVEC为对照,分析EPC各代细胞之间体外成管能力及差异。采用Transwell小室,分析观察各代EPC细胞的迁移能力及与HUVEC迁移能力的差异。进一步通过荧光定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)方法分析所培养细胞的内皮相关基因表达,确定其内皮系属性。结果:在特殊内皮系培养基的培养条件下,72h后去除未贴壁细胞继续培养,可于体外分离培养后约21-28天时出现典型EPC表现的克隆细胞团;继续培养,细胞团分裂增殖、克隆增大并逐渐融合;细胞生长速度较快,可经胰酶消化传代培养,约4-5天可传代一次,并可稳定传代约10代左右。流式细胞技术分析所分离培养细胞表面抗原的表达,和HUVECs相比,所培养EPC均不表达或极弱表达CD45(EPC vs.HUVEC,2.32%±1.56%vs.0.92%±0.77%,P=0.236)及CD14(EPC vs.HUVEC,3.44%±1.27%vs.1.29%±0.54%,P=0.054);EPC上有干祖细胞标志的CD133阳性表达(26.12%±4.56%),而HUVEC无此抗原表达(0.13%±0.11%)(P=0.001);CD31(EPC vs.HUVEC,98.82%±1.33%vs.97.90%±1.50%,P=0.472)和KDR(EPC vs.HUVEC,34.21%±6.44%vs.30.78%±5.60%,P=0.524),在脐血EPC及HUVEC上均有阳性表达,表达量相当;CD34在脐血EPC及HUVEC上均有表达,但在脐血EPC表面表达阳性率更高(EPC s.HUVEC,45.66%±6.81%vs.26.89%±4.91%,P=0.018)。以CCK8法对脐血EPC体外增殖能力分析,和HUVEC相比,脐血EPCs在体外培养第4天后增殖更为迅速,在P1,P3及P5之间,脐血EPC体外扩增趋势相当,无明显增殖差异,均较HUVEC扩增迅速。脐血EPC可于体外形成管腔样结构,成管能力较HUVEC弱,在40×镜下观察视野内脐血EPC成管数为P1,28.67±4.51个;P3,29.33±4.51个;P5,31.33±4.04个,而HUVEC为71.67±7.64个,各代脐血EPC和HUVEC成管数差异均具有统计学意义(P1 vs.HUVEC,P=0.000;P3 vs.HUVEC,P=0.000;P5 vs.HUVEC,P=0.000),而各代EPC之间成管数无明显差异(P=0.749)。在细胞迁移能力上,于×100视野下,随机计数叁个不同视野,脐血EPC细胞数为P1,208.67±13.05个;P3,204.33±16.17个;P5,203.00±16.37个,而HUVEC细胞计数为71.67±3.79,两两比较有统计学意义(P1 vs.HUVEC,P=0.000;P3 vs.HUVEC,P=0.000;P5 vs.HUVEC,P=0.000),而各代之间迁移能力无统计学差异(P=0.925)。选取内皮细胞相关基因CDH5,VWF,VEGF,TIE1,TIE2,及SELE,通过RT-q PCR方法,进一步确认所培养细胞的内皮源性质,以HUVEC为对照,脐血EPC中基因转录水平CDH5增高1.64±0.32倍(P=0.025),VWF增高4.49±0.50倍(P=0.000),VEGF增高1.76±0.12倍(P=0.008),TIE1增高2.08±0.28倍(P=0.021),TIE2增高2.25±0.26倍(P=0.014),SELE增高7.34±0.61倍(P=0.000)。结论:通过体外分离脐血MNCs,以特殊培养基贴壁、黏附蛋白包被培养器皿,培养72h弃未贴壁细胞进一步培养的方法,可于培养的21-28天获得典型EPC形态表现的细胞群。经流式鉴定该细胞群非造血系细胞,并带有部分阳性的祖细胞标记区别于成熟内皮细胞,表达内皮相关基因,符合目前对EPC的表型认知。实验中所用细胞,各代表型特征、基因表达及内皮功能稳定。从脐血中分离培养的细胞具备目前所知关于EPC的大部分特点,在本实验室已建立CB-EPC的分离、有效扩增体系,可进一步应用于后续实验。二.脐血源内皮祖细胞为基质对体外扩增造血干细胞的作用及机制探究目的:探究CB-EPC在脐血造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC)体外扩增中的作用。分析以CB-EPC为基质细胞,体外扩增脐血HSPC数量的有效性,干祖细胞数量及比例,并分析扩增后的脐血HSPC体内长期造血重建的作用及相应机制。为脐血HSPC体外有效扩增提供新的途径和解决方法,为克服脐血造血干细胞移植(hematiopoietic stem cell transplantation,HSCT)因有核细胞数不足的临床应用限制提供一有效途径。方法:CB-EPC为常规分离、培养。用于HSPC获取的脐血标本,其来源与EPC分离所用脐血标本非同一供体。分离脐血MNCs后,以CD34+磁珠阳性分选法,分选其中的HSPCs并以流式分析CD34+细胞阳性率。脐血HSPC与EPC直接接触共培养或以Transwell小室的间接接触共培养,以不加EPC单纯培养的HSPC为对照,培养7天后计数扩增的细胞总数,结合流式术计数CD34+细胞数,及更原始祖细胞CD34+CD38-细胞数,各系祖细胞CD34+CD33+、CD34+CD19+、CD34+CD61+细胞数。流式细胞术检测扩增后HSPC的细胞周期,分析分裂各期细胞比例。比较扩增前后脐血HSPC的集落形成能力,行HSPC扩增后的功能学分析。建立人-非肥胖糖尿病、重症联合免疫缺陷小鼠(non-obese diabetic/severe combined immunodeficient mice)NOD/SCID鼠异种移植模型,移植分组包括:经MACS后CD34+干细胞组;单纯培养7天后干细胞组;共培养7天后干细胞组及照射组;分析移植后小鼠的生存状况、外周血象的恢复及移植后的人类HSPC嵌合。以RT-q PCR方法分析EPC扩增脐血HSPC的分子机制,并取具有体外扩增HSPC作用的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)为对照。结果:在培养7天后,直接接触共培养HSPC扩增6.75±0.84倍,单纯HSPC培养扩增3.76±0.60,二者之间存在统计学差异(P=0.003);间接接触共培养体外扩增HSPC 7.56±0.80倍,较单纯HSPC培养扩增倍数存在显着性优势(P=0.001);但直接接触共培养与间接接触共培养在HSPC的扩增倍数上,无明显差异(P=0.239)。直接接触共培养可扩增CD34+细胞5.38±0.61倍,单纯体外扩增培养有3.25±0.59倍CD34+细胞扩增,二者相比较具统计学差异(P=0.003);间接接触共培养同样可有效扩增CD34+细胞,扩增倍数为4.06±0.43倍,较单纯培养具统计学差异(P=0.025),与直接接触共培养之间无统计学差异(P=0.124),表明EPC的体外支持脐血HSPC扩增作用主要来源于细胞因子的分泌,而细胞间的直接生理性接触对HSPC扩增作用有限;在单纯培养条件下,CD34+CD38-细胞群扩增79.12±19.77倍,与EPC的直接接触共培养后,该群细胞扩增倍数可达156.17±21.32倍,明显较单纯培养时扩增倍数增高(P=0.010);在间接接触共培养条件时,该群细胞可获95.43±33.00倍扩增,亦较单纯培养时升高(P=0.026);接种0天时,脐血HSPC中CD34+CD38-的细胞比例为2.13%±0.58%,经单纯共培养7天后该比例达到44.29%±7.30%;经直接接触共培养可将该群细胞比例升高至48.38%±5.07%,与单纯培养下该细胞群比例无明显统计学差异(P=0.392);而间接接触共培养情况下CD34+CD38-群比例为24.58%±3.02%,较单纯培养(P=0.004)及直接接触共培养(P=0.002)条件下细胞比例均低;该部分结果显示,尽管EPC支持脐血HSPC体外扩增主要依靠EPC细胞因子的分泌,但是EPC与HSPC的细胞间直接接触有利于维持更原始造血细胞的比例。在直接接触共培养条件下,CD34+CD33+及CD34+CD61+细胞群较单纯培养或间接接触共培养均有更多倍数的扩增,而淋系CD33+CD19+在叁种培养条件下扩增倍数相当。细胞周期结果显示,单纯培养后较培养前HSPC有G0/G1期细胞比例的下降(60.67%±1.68%,P=0.000),S期细胞比例的升高(31.40%±3.50%,P=0.000),而G2/M期细胞比例相当(5.94%±0.17%,P=0.120);经接触共培养7天后的细胞群,也存在G0/G1期比例下降(59.77%±1.94%,P=0.000),S期细胞比例上升(35.17%±2.75%,P=0.000),但有相当的G2/M期细胞比例(5.62%±0.39%,P=0.851),尽管以EPC为基质的体外共培养体系可较单纯培养提供更高倍数的HSPC扩增,却仍保证了足够的细胞处于分裂前期,有助于维持其干细胞特性;以EPC为基质共培养后的HSPC形成的CFU总数不仅比新鲜分离的HSPC多(446.33±6.66 vs.124.67±9.71,P=0.000),且比单纯培养后的HSPC总数多(446.33±6.66 vs.257.33±6.67,P=0.000)。就CFU的种类而言,与EPC共培养后的HSPC形成的各类CFU,在CFU-GM,BFU-E以及CFU-E数量上均较新鲜分离后的HSPC和单纯培养后的HSPC所形成的CFU数量多。人-NOD/SCID小鼠移植实验中,可观察到EPC扩增培养HSPC移植组与未经培养组有相似的白细胞、血红蛋白及血小板的各系血细胞恢复趋势;在移植后5周内,EPC扩增培养HSPC移植组小鼠的血红蛋白及血小板水平较未经培养HSPC组小鼠更高;单纯培养HSPC移植组小鼠多在移植后5周内死亡,未到达观察终点,未经培养HSPC组、EPC扩增培养HSPC移植组到观察终点分别有50%,60%小鼠存活,在生存时间上经统计分析无明显统计学差异(P=0.892)。在移植后8周未经培养HSPC组、EPC扩增培养HSPC移植组小鼠中均有人CD45的成功植入,平均嵌合率分别为16.0%±14.3%,13.3%±11.0%(P=0.750)。分析其机制,RT-q PCR结果显示EPC中的造血相关细胞因子基因IL6(4.24±1.42倍,P=0.017)、ANGPT1(7.75±0.90倍,P=0.000)及CXCL12(8.25±2.03倍,P=0.025)基因的转录水平均较MSC高;信号通路相关分子基因WNT5A转录水平在EPC中有明显升高(11.76±2.11倍,P=0.013);且经过体外共培养后的HSPC中,其WNT5A基因转录水平较培养前明显上调(3.49±0.54倍,P=0.001)。结论:人脐血源EPC可在体外有效扩增HSPC,提高细胞总数及具有原始造血、长期始动能力的细胞数量比例,提高各系祖细胞数量,并可保证一定数量处于静息期的HSPC数量,维持干细胞特性。经EPC为基质细胞扩增后的脐血HSPC具有良好的干细胞功能,可于体内植入及重建造血,在移植早期促进造血恢复。相关机制可能与EPC分泌多种造血相关因子及激活Wnt信号通路有关。脐血源EPC是良好的体外扩增HSPC的基质细胞,可为脐血HSPC体外有效扩增提供新的途径和解决方法。叁.脐血源内皮祖细胞联合造血干细胞移植在造血重建和移植物抗宿主病中的作用初探目的:通过联合脐血源EPC及HSC共移植的方式,分析其是否可通过修复移植过程中的内皮损伤,达到促进移植后的造血重建和减轻移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的作用。方法:建立人-NOD/SCID鼠共移植(EPC+HSC)模型,以单纯移植HSC小鼠为对照,观察移植后的生存状况、造血重建及体内植入,观察移植后小鼠有无GVHD相关症状并记录评分,以病理实验进行GVHD的验证;以CD31免疫组化病理实验分析共移植EPC组小鼠的骨髓微血管恢复情况,并与单纯移植小鼠比较;以慢病毒转染的方式转染绿色荧光蛋白EGFP入EPC,并建立小鼠移植模型,分析移植后EGFP-EPC的归巢及分布,是否直接参与骨髓的微血管恢复。以MSC为对照,流式细胞术分析EPC的表面人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)抗原表达及行混合淋巴细胞实验对EPC免疫原性进行分析。结果:经单纯移植小鼠(n=10)的中位生存时间为51天,长期存活率为60%;经脐血EPC联合HSC共移植组小鼠(n=10)的中位生存时间为54天,长期存活率为70%;EPC联合HSC共移植组较单纯移植组在生存时间上有提高的趋势,但统计学比较无明显差异(P=0.314)。两移植处理组均随着时间延长有血细胞恢复趋势,在观察的各时间点可发现共移植组较单纯移植组在WBC、HBG及PLT上均恢复值高。单纯移植组骨髓中人CD45嵌合比例为(13.27%±6.36%),共移植组骨髓中人CD45比例为(18.21%±10.57%),无统计学差异(P=0.308);在单纯移植组脾脏中的嵌合比为(4.91%±7.56%),共移植组中该比例为(5.14%±2.97%),无统计学差异(P=0.840)。单纯移植组中共有3只小鼠出现GVHD症状,主要表现为体重下降和(或)弓背姿势和(或)活动度下降和(或)耸毛,评分分别为2分、2分、6分;在共移植组中共观察到2只小鼠出现GVHD症状,该组的主要表现是体重下降和(或)轻中度活动度下降,评分分别为2分,1分;存在GVHD表现的小鼠存在不同程度的小肠和骨髓损伤,主要表现为腺体轻中度破坏和或骨髓增生度减低、骨小梁连续性差。EPC共移植组小鼠在观察终点时骨髓中有明显的、连续的CD31阳性染色,骨髓血管窦结构显示完整,提示其微血管恢复良好,而经单纯移植的小鼠骨髓血管内皮细胞有部分恢复但总体骨髓微血管恢复情况较共移植组为差。在将EPC转染EGFP并行移植实验后24h,骨髓中可检测到一定的呈聚集的染色阳性细胞,平均阳性比例占所有有核细胞比约为2.3%;移植后72h及7天,仍可见少量的阳性染色细胞分布于骨髓。实验中所用的EPC的免疫原性均较低,其表面HLA-I类抗原(HLA-ABC)的阳性率为(27.97%±3.60%),MSC的HLA-I类抗原阳性率为(44.46%±7.18%)(P=0.024);EPC表面HLAⅡ类抗原(HLA-DR)的阳性率为(6.37%±2.73%),同样较MSC该类抗原(14.77%±1.96%)表达低(P=0.012);与人淋巴细胞行混合淋巴细胞实验,以CFSE染色后未发现淋巴细胞过度增殖的现象。结论:本部分实验揭示了脐血EPC联合造血干细胞移植具有一定的促进移植后造血重建、减轻GVHD、延长生存时间的趋势,但因受样本量所限,仍需进一步扩大样本量进一步验证。修复骨髓微环境的髓窦内皮细胞损伤,可能是脐血源EPC促进移植后造血重建、减轻GVHD的机制之一。
何志裕[3]2010年在《人脐带血间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的实验研究》文中研究表明目的:1.研究脐带血来源的间充质干细胞体外分离、纯化及培养的条件,以建立稳定的体外培养体系,满足实验和临床的需要。2.探讨脐血间充质干细胞移植到心肌梗死大鼠体内,观察其是否可以存活及对大鼠心功能的影响。方法:1.无菌条件下采取健康育龄产妇正常分娩胎儿的脐带血42份,所有样本均于采集8h内分离。2.脐带血42份随机分成3组: FBS(胎牛血清)未包被组,FBS包被组,Mesencult培养基组,每组12份。FBS未包被组和FBS包被组均使用含10%FBS的LG-DMEM培养基,Mesencult培养基组使用培养干细胞专用的Mesencult培养基,与其添加物配合使用。3组均用Ficoll淋巴细胞分离液,密度梯度法分离脐血单个核细胞(MNC),将单个核细胞按密度1 X 108/ml接种于T25培养瓶中3.培养瓶置37℃饱和湿度含5%CO2孵育箱培养,72h后全量换液,去除未贴壁细胞,以后均7天换液一次。待细胞长到80%铺满瓶底时结束原代培养,按1:1进行消化传代。观察不同培养条件对脐血MSCs生长的影响。4.流式细胞术分析P2代细胞表面CD29、CD34、CD45、CD105标志。5.将36只SD大鼠随机分成MSCs移植组、假手术组和心肌梗死组各12只。结扎左冠状动脉前降支制备大鼠心肌梗死模型, 1周后,经尾静脉注射带DAPI标记的脐血MSCs。6.4周后测定大鼠血流动力学,并行免疫组织化学检测移植细胞存活与分化情况及检测梗死组织中FactorⅧ表达来比较叁组微血管密度。结果:1.实验观察显示:经典的MSCs培养方法,用未经胎牛血清包被培养瓶培养的MNC很少出现贴壁,且大多为形态多样的混杂细胞,无明显的细胞集落形成。在少数标本中约2周后细胞可达到融合,主要表现为大的扁圆形细胞、破骨细胞和梭形成纤维样的MSCs,尽管这些混杂细胞原代培养也可以达到融合,但其扩增能力明显受到限制,且传代未达2代。而脐血单个核细胞在合适的培养基中,以较高的密度种植于经胎牛血清包被的培养瓶内,原代培养产生的贴壁细胞以间充质干细胞为优势细胞,混杂有少量破骨样细胞。而在Mesencult培养基下培养,经传代后这些贴壁细胞可以被纯化为生长良好的间充质干细胞。其能保持良好的扩增能力和均质性。42份脐血中单个核细胞原代培养,其中仅8份传代培养成功,而其中Mesencult条件培养基有5份培养成功,明显高于经典培养方法。原代和P2代脐血MSCs的生长特性进行观察比较,原代MSCs在接种后的2-8d为生长的潜伏期,10-14d以后细胞进入对数生长期,3-4周左右逐渐进入平台期,P2代脐血MSCs扩增速度明显快于原代培养,2-4d倍增1次,5-10d后细胞进入到对数生长期,10-14d进入平台期。2.通过流式细胞仪检测P2代的脐血MSCs结果显示,P2代MSCs极弱表达CD34、CD45造血细胞标志,稳定地高表达CD29、CD105间充质细胞相关的表面抗原。这与骨髓MSCs的表面抗原标志相一致。表明脐血MSCs是存在于脐血中区别于造血细胞的一群处于未分化状态的非定向干/祖细胞。3.移植后4周,经血流动力学检测,与心梗组比较,MSCs移植组左室心功能明显改善(P<0.05),移植组心肌组织中可以观察到DAPI标记细胞存在,但标记细胞并未表达Troponin-T及connexin43,免疫组化染色检测示MSCs移植组心肌微血管密度(MVD)明显高于心梗组和假手术组。结论1.脐血单个核细胞以高密度(1X108cells/ml )接种在Mesencult培养基中、FBS包被培养瓶等条件下,可以在体外成功的培养出较纯化的脐血MSCs,其培养成功率较高。脐血MSCs的免疫表型符合间充质干细胞特征。2.经尾静脉移植的脐血MSCs能存活在心肌梗死大鼠心肌组织中。3.脐血MSCs移植能促进心梗大鼠心功能恢复,并刺激梗死部位血管生成。
李敏[4]2008年在《人脐血单个核细胞分离、培养方法的比较》文中研究说明目的:采用不同的分离、培养条件,以筛选出一种相对较好的脐血单个核细胞(mononuclear cells ,MNCs)分离、培养方法。方法:取2007-5/2008-2新疆医科大学第一附属医院产科健康产妇的脐血,比较不同分离方法所得脐血MNCs数及随后的细胞形态学变化,比较不同换液时间、不同培养基、不同浓度的胎牛血清对脐血MNCs原代培养及传代过程的影响,在原代培养第30天通过流式细胞仪检测细胞表面免疫表型。结果:3种分离方法在分离脐血MNCs数方面差异具有统计学意义(P<0.01),其中以羟乙基淀粉沉淀法得到的MNCs数量最多(15.23±4.30)×106/mL,密度梯度离心法、CD133免疫磁珠组所获MNCs数分别为(3.71±1.14)×106/mL、(0.066±0.027)×106/mL。但羟乙基淀粉沉淀法所得细胞生长状态欠佳。首次第5天～7天换液、低糖DMEM、IMDM培养基有利于MNCs的生长。还不能认为30%胎牛血清与20%胎牛血清的培养基在培养脐血MNCs方面有差别。流式检测密度梯度离心法、CD133免疫磁珠组CD34阳性率分别为10.1%、0.5%。结论:羟乙基淀粉沉淀法是一种高效的脐血分离方法,但其所得细胞的生长状态欠佳,需进一步实验证实。CD133免疫磁珠法所获细胞纯度高,可根据不同要求选用相应分离法。首次第5天～7天换液、低糖DMEM、IMDM培养基是相对较好的MNCs培养条件。30%胎牛血清与20%胎牛血清的培养基在培养脐血MNCs方面尚未发现差别。
宋闿迪[5]2009年在《非血缘双份脐血移植植入动力学及其机制的初步研究》文中认为背景与目的脐血是良好的造血干细胞(Haematopoietic Stem Cell, HSC)来源,但脐血中含有的HSC数量相对较少从而限制了其在成人中的应用。使用双份脐血混合移植治疗白血病获得成功,激起人们对其植入规律及其相互作用机制的研究。脐血移植的主要问题是植入延缓和早期移植排斥率高。沿用至今的早期移植排斥的标准是移植后28天ANC<0.5×109/L,这是一种间接的判定方法,一旦诊断,已失去早期干预的时机。移植受体在接受异体或异种移植物后,其受者体内存在着供体细胞,这种供、受体细胞相互移行、相互存在的现象称为嵌合现象。双份非血缘脐血移植(Double Umbilical Cord Blood Transplantation,DUCBT)术后检测造血细胞嵌合体具有判断移植物植入状况、评价预处理方案、预测GVHD严重程度、GVL效应、了解疾病的转归及早期干预治疗等方面的重要临床价值。建立一种移植后早期准确地评价移植物植入状态的方法和标准是非常必要的,以探讨移植物植入的规律和临床应用价值。同时对于DUCBT的相互作用机制研究证实:接受双份脐血移植的患者,大部分长期造血仅来源于一份脐血,而另一份脐血在植入早期即被排斥,推测脐血与脐血间可能存在相互作用。本项目前期实验将两份脐血的CD34+细胞体外混合培养检测对彼此归巢及分化能力影响,发现两者相互无明显影响。本实验将一份脐血CD34+细胞与另一份脐血T淋巴细胞体外混合培养,了解两份脐血相互作用是否与CD34+细胞与异体T淋巴细胞间的相互作用有关。方法选择我院接受DUCBT的患者12例,建立识别个体的荧光标记复合PCR扩增STR位点结合毛细管电泳检测嵌合体方法,使用Promage公司的PowerPlex16个体识别试剂盒扩增荧光标记多重STR,特异性STR位点选择包括:D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、PentaE、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、PentaD、vWA、D8S1179、TPOX、FGA 15个基因座和1个性别基因Amelogenin。扩增产物经ABI公司的3100型遗传分析仪进行毛细管电泳,GenScan?等分析软件分析数据。动态观察DUCBT后移植受者造血细胞嵌合体组成情况。同时从正常人骨髓中分离扩增间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSC),富集传代,加速器照射(12Gy)后作为滋养层细胞,将免疫磁珠分选纯化的一份脐血CD34+细胞与经脱脂棉纯化的另份脐血T淋巴细胞混合接种到其表面,共培养6天,通过流式细胞术检测CD34+细胞表面系分化指标(CD33,CD41,CD71)的变化。结果1. STR-PCR动态监测12例DUCBT患者中10例获得植入,移植物最早出现在移植后7天,7天移植物呈完全供者嵌合(Full Donor Chomerism, FDC)状态3例,14天移植物呈FDC状态10例,10例受者移植物均获得持续植入,而移植后14天移植物呈供受者混合嵌合(Mixed Chimerism, MC)状态2例患者,不论供受者嵌合比例占优势或劣势,移植后30天均呈完全受者状态,移植物被排斥。可见脐血移植术后14天内是脐血植入的关键时期,该期间移植物嵌合体的组成状况对植入至关重要。UCBT术后14天即能准确有效地判断出移植物植入状况。2.人骨髓MSC贴壁层的建立及鉴定正常人骨髓单个核细胞体外培养12d左右,MSC融合达70%～80%,呈漩涡状生长。细胞传至第叁代,其表面表达CD90、CD105、CD166、CD29、CD44、CD13和CD49e,不表达CD14、CD34、CD31、CD45和HLA-DR。3.异体T淋巴细胞对脐血CD34+细胞分化能力的影响体外共培养3天后镜下观察细胞数明显增多,培养6天后细胞数更加增多。实验组CD34+细胞和异体T淋巴细胞共培养后,CD33,CD71标记表达均略增强,CD41标记表达增强较明显,但与对照组比较(P>0.05)。结论1、复合扩增荧光标记STR-PCR结合毛细管电泳技术在UCBT术后14天即能准确有效地判断出移植物植入状况,该方法可作为早期评估UCBT是否成功最灵敏、最特异的指标;2、将单份脐血的CD34+细胞与异体T淋巴细胞体外混合培养后对CD34+细胞向各系分化的能力有促进作用,但无统计学意义,有待进一步研究。
周毅[6]2005年在《人脐血细胞静脉输注对血管性痴呆大鼠治疗作用的研究》文中认为背景与目的: 哺乳动物中枢神经系统(central neural system,CNS)受损后的修复是有限的,受损的神经元几乎不能再生。目前,越来越多的研究将精力集中在细胞移植治疗脑和脊髓病变方面。胚胎干细胞移植是治疗CNS疾病最有希望的手段之一,但其广泛应用受到组织来源、免疫排斥及伦理学等诸方面的限制。骨髓干细胞在体外经过一定条件培养可以表达nestin抗原并可以分化为神经元和胶质细胞。骨髓干细胞已经在CNS疾病如脑缺血及外伤等治疗方面得到了应用。将骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植到受损动物的CNS可以生长成为神经元。与骨髓及外周血相比,脐血具有免疫原性弱、淋巴细胞不成熟、来源丰富、易于采集及保存、无肿瘤细胞污染等优点。脐血较骨髓含有更多的干细胞,而且这些干细胞更原始,提示脐血源性干细胞比骨髓源性干细胞更有治疗应用价值。目前也有报道将人脐血细胞(human umbilical cord blood cells,HUCBCs)移植到CNS受损(如脑缺血或脊髓损伤)的动物模型中,从组织学及行为学改善方面证实了其有效性。血管性痴呆(vascular dementia,VaD)是指由于脑血管疾病引起的脑组织梗塞、低灌注或出血所致的认知功能损害综合征。目前,VaD成为老年期痴呆的第二大病因,仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)。随着人口老龄化和脑血管疾病发病率的上升,VaD的发病率也逐年上升。但对于VaD尚无特效治疗方法。为此,本实验拟初步观察HUCBCs静脉输注对VaD大鼠行为和认知功能的改善以及对脑组织保护及修复方面的作用。 方法: 1.脐血的采集和分离 选取健康无感染性疾病产妇,正常分娩的健康婴儿做为脐血采集对象。采取健康成人外周血作为对照组。脐血与外周血均采集10份。以淋巴细胞密度梯度分离法对细胞进行分离。 2.细胞鉴定 采集脐血,分离HUCBCs,对其进行nestin阳性细胞鉴定。以成人外周血细胞(Human peripheral blood cells,HUPBCs)作为对照组。以免疫细胞化学的方法对HUCBCs中nestin阳性细胞进行定性检测。采用流式细胞术对脐血细胞中
参考文献：
[1]. 来源于脐血与骨髓中间充质干细胞和造血干细胞的比较[D]. 程瑞芳. 天津医科大学. 2004
[2]. 脐血源内皮祖细胞在造血干细胞移植中的作用及机制探究[D]. 曲琦. 苏州大学. 2016
[3]. 人脐带血间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的实验研究[D]. 何志裕. 广州医学院. 2010
[4]. 人脐血单个核细胞分离、培养方法的比较[D]. 李敏. 新疆医科大学. 2008
[5]. 非血缘双份脐血移植植入动力学及其机制的初步研究[D]. 宋闿迪. 安徽医科大学. 2009
[6]. 人脐血细胞静脉输注对血管性痴呆大鼠治疗作用的研究[D]. 周毅. 第叁军医大学. 2005