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酸性果胶裂解酶的基因筛选及其在黑曲霉中高效重组表达研究

2020-12-02阅读(351)

酸性果胶裂解酶的基因筛选及其在黑曲霉中高效重组表达研究

论文摘要

酸性果胶裂解酶可通过β-消除反应有效降解果胶类物质,在食品工业中具有广泛用途,尤其是果蔬汁加工业,有助于果蔬汁澄清和提高出汁率。酸性果胶裂解酶主要由真菌产生,尤其是黑曲霉,但其天然原始菌株普遍存在产酶量低和产物杂质多的问题,远达不到工业需求。本研究旨在以具有低蛋白背景的安全菌株黑曲霉SH-2为表达宿主,将来自黑曲霉全基因组的5个果胶裂解酶基因（pelA、pelB、pelC、pelD、pelF）分别进行过量表达以期实现酸性果胶裂解酶的高效重组表达,并对重组酶的酶学性质和其在果汁澄清方面的实际应用进行探究。主要研究内容如下:（1）将构成黑曲霉果胶裂解酶基因家族的5个果胶裂解酶基因（pelA、pelB、pelC、pelD和pelF）成功克隆,并利用黑曲霉自身强启动子（葡萄糖淀粉酶启动子,PglaA）分别实现5个果胶裂解酶基因在黑曲霉SH-2中进行重组过量表达。通过酶活测定成功筛选得到两个高表达的酸性果胶裂解酶基因pelA和pelD,转化菌株分别为SH2-PelA和SH2-PelD,在摇瓶发酵条件下最高酶活力分别为11069.2 U/mL和8822.6 U/mL,在液体深层发酵条件下最高酶活力分别为65148.8 U/mL和35670.0 U/mL,分别比摇瓶发酵酶活提高5.9倍和4.0倍,表明重组菌株具有工业化大量生产酸性果胶裂解酶的潜力,并且重组菌株SH2-PelA具有较高的表达水平。（2）高产重组酸性果胶裂解酶经镍柱亲和层析纯化后进行western blot检测及酶学性质研究。经一步纯化后,重组酶rePelA和rePelD的比酶活分别为4618.0 U/mg和8522.7 U/mg,回收率分别为88.4%和79.4%,纯化倍数分别为5.7和4.9倍;底物特异性分析表明:重组酶rePelA和rePelD的比活力随果胶底物甲酯化程度增加而增加,对柑橘果胶（≥85%酯化度）酶活分别为22423.3 U/mL和31248.0 U/mL;rePelA和rePelD的最适反应温度均为50℃,并在30-50℃的范围内热稳定性良好;rePelA和rePelD的最适反应pH分别为4.5和5.0,并在酸性pH条件下稳定性良好;加入Na+、Mg2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Ba2+对rePelA具有不同程度的激活作用,其中Zn2+、Mn2+对rePelA激活作用较为显著,能提高约30%的酶活力,而Ca2+、Cu2+及表面活性剂SDS对rePelA有明显的抑制作用;加入Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Ba2+对重组酶rePelD具有不同程度的激活作用,而SDS表现为抑制作用。（3）将重组酸性果胶裂解酶应用于不同果汁澄清,结果表明:rePelA和rePelD对橙汁、苹果汁以及葡萄汁具有良好的澄清效果。经rePelA和rePelD处理后,橙汁的透光度分别提高了19.2和17.9倍,苹果汁的透光度分别提高了7.3和11.5倍,葡萄汁的透光度分别提高了3.8和5.7倍;此外,相比于添加单一果胶酶,复合添加不同果胶酶可在较短时间获得更好的果汁澄清效果。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 第一章 绪论
  •   1.1 果胶概述
  •     1.1.1 果胶的结构
  •     1.1.2 果胶的分类
  •     1.1.3 果胶的生物合成及降解
  •   1.2 果胶裂解酶概述
  •     1.2.1 果胶裂解酶的理化性质
  •     1.2.2 果胶裂解酶酶活测定方法
  •     1.2.3 果胶裂解酶的分离纯化
  •   1.3 果胶裂解酶的工业应用
  •     1.3.1 在纺织工业中的应用
  •     1.3.2 在造纸工业中的应用
  •     1.3.3 在果蔬汁加工及果酒生产中的应用
  •     1.3.4 在功能性食品生产中的应用
  •   1.4 果胶裂解酶的重组表达概况
  •     1.4.1 果胶裂解酶重组表达系统
  •     1.4.2 果胶裂解酶重组表达现状
  •   1.5 本课题研究意义及研究内容
  •     1.5.1 研究意义
  •     1.5.2 研究内容
  • 第二章 黑曲霉酸性果胶裂解酶的高效重组表达研究
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验材料与设备
  •     2.2.1 菌株和质粒
  •     2.2.2 实验材料
  •     2.2.3 实验设备
  •     2.2.4 引物设计
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 黑曲霉果胶裂解酶基因家族的生物信息学分析
  •     2.3.2 果胶裂解酶重组表达载体的构建
  •     2.3.3 黑曲霉原生质体转化
  •     2.3.4 果胶裂解酶基因重组表达转化子的验证
  •     2.3.5 果胶裂解酶活力测定方法
  •     2.3.6 蛋白含量的测定及SDS-PAGE蛋白电泳
  •     2.3.7 高产果胶裂解酶重组菌株的发酵培养
  •   2.4 实验结果与讨论
  •     2.4.1 黑曲霉果胶裂解酶基因家族的序列分析
  •     2.4.2 果胶裂解酶重组高效表达载体的构建
  •     2.4.3 不同果胶裂解酶基因过量表达株的转化及鉴定
  •     2.4.4 酸性果胶裂解酶高效表达基因的筛选研究
  •     2.4.5 高产重组酸性果胶裂解酶菌株的发酵研究
  •   2.5 本章小结
  • 第三章 重组酸性果胶裂解酶的蛋白纯化及性能研究
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验材料与设备
  •     3.2.1 所用菌株
  •     3.2.2 实验设备
  •     3.2.3 实验试剂
  •     3.2.4 培养基与溶液
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 镍柱亲和层析纯化重组蛋白
  •     3.3.2 Western blot检测重组蛋白
  •     3.3.3 重组酸性果胶裂解酶的酶学性质分析
  •     3.3.4 重组酸性果胶裂解酶应用于果汁澄清
  •   3.4 实验结果与讨论
  •     3.4.1 重组酸性果胶裂解酶的纯化工艺研究
  •     3.4.2 重组酸性果胶裂解酶的纯化效果及特异性分析
  •     3.4.3 重组酸性果胶裂解酶的酶学性质研究
  •     3.4.4 重组酸性果胶裂解酶在果汁澄清中的应用研究
  •   3.5 本章小结
  • 结论与展望
  • 本论文创新点
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间取得的研究成果
  • 致谢
  • 附件

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 何玉兰

    导师: 潘力

    关键词: 酸性果胶裂解酶,高效表达,黑曲霉,酶学性质,果汁澄清

    来源: 华南理工大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 华南理工大学

    分类号: Q78;Q55

    DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.001042

    总页数: 71

    文件大小: 5438K

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