李虹[1]2003年在《肌肉注射可调控胰岛素基因对糖尿病小鼠降糖作用的研究》文中研究表明目的 基因治疗糖尿病是一种从分子水平上控制和缓解糖尿病的治疗方法，通过导入外源胰岛素基因可补充体内胰岛素的不足。但持续性的基因表达会导致严重低血糖。因此，胰岛素基因表达的调控问题，即如何使基因的表达随血糖变化，符合生理需要是治疗成败的关键。目前使用的几个生理性调控序列都存在缺陷。四环素调控系统是一种广泛应用的安全、有效的调控手段。通过加入/撤除四环素或其衍生物可启动/关闭目的基因的表达。已有应用于胰岛素基因调控的体外实验报道，但鲜有体内实验资料。另外，选择适宜的靶组织，安全、高效的基因转染手段是基因治疗成功的基本保障。肝脏细胞具有葡萄糖调节的“感受器”，是外源胰岛素基因表达的理想宿主。但进行肝细胞的基因转染多需要病毒、脂质体等的介导，操作复杂，安全性亦难以保证。肌肉组织已被证实是多种目的基因的良好靶细胞，转染条件宽松，在无需病毒、脂质体介导的条件下即可进行，安全性和实用性均较高。本实验通过构建质粒prTA-tet4-rhINS，并采用肌肉注射的方式将人胰岛素原基因转移至小鼠体内，旨在证实在动物活体内四环素调控系统调控胰岛素基因表达的可行性及肌肉组织作为胰岛素基因表达宿主的可行性。 方法 1．采用DNA重组技术构建质粒prTA-tet4-rhINS。2．采用碱裂解法提取、获得大量质粒。3．以链脲佐菌素(STZ)诱导Balb/C小鼠成糖尿病模型并分为3组。4．将质粒溶解于无菌去离子水中，每只小鼠以300μg直接注射至股部肌肉内，并同时喂强力霉素(Dox)水，3组浓度分别为：2mg/ml，0.5mg/ml，0mg/ml。5．葡萄糖氧化酶试纸法检测小鼠末梢血糖，放免法检测小鼠血清人胰岛素，免放法检测C肽水平来评价质粒的降糖效果。6．RT-PCR方法证实人胰岛素原基因在小鼠肌肉组织中mRNA水平上的表达。 结果 1．采用DNA重组技术构建质粒prTA-tet4-rhINS，特点为：重组人胰岛素原基因(rhINS)由四环素启动子(Ptet4)驱动表达，人类巨细胞病毒启动子(hCMV)启动四环素反式作用因子rtTA基因表达；通过DNA测序证实所插入片段为重组人胰岛素原基因。2．采用STZ成功诱导Balb/C小鼠成为稳定的糖尿病动物模型。3．在外加强力霉素(Dox)存在的条件下，糖尿病小鼠注射质粒后，血糖平稳下降持续近两周，体重增加，尿量减少，获得了良好的降糖效果。4.降糖效果与饮水中Dox浓度相关:在3组中，Dox Zmg/m1组显示最大降糖效果，持续时间最长;Dox0.smg/m1组血糖下降程度不及前者，且持续时间短:Dox omg/m1组小鼠未见血糖下降，与Dox Zmg/ml组比较，两者具有显着差异(p<0.01)。5.Dox Zmg/m1组小鼠血清人胰岛素、C肤水平增高，与Dox omg/m1组比较，具有统计学差异(p<0.01)。6.RT一PCR方法检测到Dox Zmg/m1，Dox 0.smg/ml组小鼠肌肉组织中存在人胰岛素原基因mRNA的表达，其表达程度亦随着饮水中Dox浓度的增加而增强。 结论1.本实验所构建的质粒prTA一tet4一rhINs对于由STz诱导的糖尿病小鼠的高血糖起到明显的缓解作用。2.四环素调控系统在糖尿病小鼠肌肉组织内很好地调控了人胰岛素原基因的表达。3.小鼠的肌肉组织能够作为人胰岛素基因表达的宿主细胞，使人胰岛素原基因获得稳定表达。
李鸿, 苏本利, 刘海霞, 张雪扬, 吕申[2]2004年在《肌肉注射可调控胰岛素基因对糖尿病小鼠降糖作用》文中研究指明为研究四环素调控的胰岛素表达载体肌肉直接注射后对实验性糖尿病小鼠的降糖作用 ,构建了质粒 prTA tet4 rhINS .以链脲佐菌素 (STZ)诱导Balb/C小鼠成糖尿病模型 ,30 0 μg质粒注射至小鼠的股部肌肉 ,并同时在饮水中加入不同浓度强力霉素 (Dox) ,监测小鼠末梢血糖、体重 ,测定血清人胰岛素、C肽水平 .用RT PCR检测小鼠肌肉注射部位组织中人胰岛素原mRNA水平的表达情况 .结果表明 :质粒prTA tet4 rhINS注射后 ,给予Dox可显着降低糖尿病小鼠的血糖 ,血清人胰岛素、C肽水平相应升高 ,体重增加 .效果持续大约二周 .小鼠肌肉组织中有人胰岛素原mRNA表达 .降糖效果和基因表达程度随Dox浓度增加而增强 .质粒 prTA tet4 rhINS对STZ诱导的糖尿病小鼠高血糖起到明显的降低作用 .在糖尿病小鼠肌肉组织能很好地表达 ,并受Dox调控 .
参考文献：
[1]. 肌肉注射可调控胰岛素基因对糖尿病小鼠降糖作用的研究[D]. 李虹. 大连医科大学. 2003
[2]. 肌肉注射可调控胰岛素基因对糖尿病小鼠降糖作用[J]. 李鸿, 苏本利, 刘海霞, 张雪扬, 吕申. 生物化学与生物物理进展. 2004