董洁[1]2004年在《金属结合肽的微生物展示与筛选及生物吸附作用研究》文中指出重金属已成为全球重要的环境污染物之一。微生物修复治理重金属污染是一条有效、生态的途径，它避免了目前治理中难以解决的二次污染问题。目前相关研究的重点和难点在于获得高亲和力和特异性的金属结合肽。 本研究以镍螯合板条形式的靶标，从噬菌体限制性七肽库和随机十二肽库中筛选出共有序列为“HHHH”的镍结合肽。将这些结合肽展示于大肠杆菌表面，显着提高了重组菌镍结合力。进一步从细菌鞭毛展示十二肽库筛选出具有组氨酸偏性的镍结合肽，确立了细菌肽库筛选的微孔板法。 在已获得的结合肽序列和计算机模拟的基础上，设计、构建了两个细菌表面展示的偏性肽库SGL1(“XXHHXXX”)和SGL2(“XXHXHXX”)，并从中筛选出结合力强的镍结合肽。得到的肽序列具有“HHH”保守序列，而且His侧翼Arg出现频率高。筛选得到的细菌克隆在109Cd聚集实验中显示出较强的吸附能力。 本研究建立了微孔板法筛选金属结合肽的方法，尝试了以细菌鞭毛蛋白为锚定蛋白展示金属结合肽的可行性，探索了通过构建偏性肽库优化金属结合肽序列的途径，达到了预期的结果，有助于研究金属结合肽结构与功能的关系及生物吸附的方式。
茆灿泉[2]2001年在《金属结合肽的噬菌体随机肽库筛选和酵母细胞表面展示》文中指出包括放射性核素在内的重金属污染一直是世界普遍存在的环境问题,采用生物修复(Bioremediation)的方法可望实现环境污染物的有效、简便和低费用防治,促进社会与经济的可持续发展。考虑传统的生物(微生物)修复技术常常不能满足重金属污染治理的要求,与生物文库和细胞表面展示相关的微生物基因工程技术引起了广泛的关注。最近的研究显示,研制重金属高效结合肽展示的微生物工程菌,有望在重金属修复,尤其在大流域低浓度有害的重金属污染治理中发挥重要作用。 目前用于微生物展示的金属结合肽主要来源于6×His类的金属结合肽、天然金属结合蛋白或其结构域的模体以及肽库筛选等;而宿主微生物主要集中在各种细菌(包括G~-和G~+)。通过细菌表面展示和工程细菌的重金属结合试验,已显示微生物工程菌在重金属修复中的潜在作用。考虑噬菌体随机肽库技术在配基筛选中的巨大潜力和酵母菌的安全性以及其本身对重金属的高吸附能力,我们就金属高效结合肽的筛选和微生物表面展示开展了以下方面的工作: 首先应用固定化金属离子亲和层析(IMAC)树脂和噬菌体肽库展示技术,就丝状噬菌体肽库对重金属离子(Co~(2+);Ni~(2+))的结合特性进行了研究。采用分段筛选和梯度洗脱的方法从丝状噬菌体随机十二肽库中筛选和富集金属结合肽,同时研究了不同区段和洗脱浓度对噬菌体P/N值(金属螯合树脂咪唑(ID)洗脱液的噬菌体滴度/去除金属离子的螯合树脂ID洗脱液的噬菌体滴度)、相对富集水平以及噬菌体克隆数的影响。结果显示:随着筛选轮数的增加,各ID洗脱浓度下的噬菌体P/N值呈现增长的趋势;对于不同区段(20-100;100-200;200-400 mmol/L的ID浓度)、不同浓度(100;200:400 mmol/L的ID)以及每一轮筛选,均以在100 mmol/L的ID洗脱浓度下的噬菌体克隆数为最高;并且,收集的各段噬菌体用叁种浓度的ID洗脱,呈现各洗脱浓度下的噬菌体相对富集,这种克隆数的相对富集与噬菌体的P/N值增减趋势具有一定的相关性。 在此基础上对结合有噬菌体肽库的Co~(2+)离子螯合树脂用200 mmol/L的ID直接进行淘洗,经五轮筛选,噬菌体文库的P/N值从1.4倍提高至140倍,从第3,4,5轮以及前述不
茆灿泉, 薛沿宁[3]2001年在《微生物展示技术在重金属污染生物修复中的研究进展》文中指出自然界对环境金属污染物的迁移和转化具有微妙而复杂的选择控制机理 ,生物修复技术以其投资少、效率高、可以原位处理低浓度有害污染物的特性而在环境治理中具有极大潜力。考虑传统的生物修复技术常常不能满足重金属治理的要求 ,基于重金属离子高效结合肽的微生物展示技术 ,有望在重金属生物修复中发挥重要作用。
佟鑫[4]2007年在《Ni～（2+）高效结合肽的筛选与作用研究》文中提出各种环境中重金属的污染已经严重威胁人类的健康。许多重金属元素如汞、砷、镉、铅、铬等通常对生物有较高毒性，甚至某些生物所必需的痕量元素铜、锌、镍等在较高浓度时也能对生物体产生明显的毒性效应。这些重金属元素可与蛋白质结合引起其活性丧失或结构破坏，取代某些必需微量元素从而导致营养缺乏，以及诱导自由基或活性氧的生成。研究发现，在多种微生物、动物和植物细胞内普遍存在对金属离子具有亲和能力的多肽，称为金属结合肽。目前在国内外，有许多关于金属结合多肽(蛋白质)的研究报道，但主要是集中在自然界原有的多肽(蛋白)，如植物络合素(PCs)和金属硫蛋白(MTs)，而关于金属结合多肽的专门报道则相对较少。针对重金属污染的生物修复技术，因其特有的优势，越来越受到重视，其中一个重要的研究领域是利用金属离子和金属结合蛋白(肽)之间存在的强亲和力特性进行的生物修复研究。本论文利用噬菌体展示技术，从噬菌体随机十二肽库中筛选对重金属Ni~(2+)具有强亲和能力的多肽。扩增噬菌体十二肽库，将扩增噬菌体加入到结合有金属Ni~(2+)的树脂中，通过噬菌体和树脂的结合、1％TBST的洗涤和200mM咪唑溶液的洗脱等步骤进行筛选。经过六轮的筛选，成功地从噬菌体十二肽库中筛选和富集到对重金属离子Ni~(2+)结合能力的十二肽。随机从第五轮和第六轮筛选物中挑选了多个噬菌体克隆，经过扩增、单链DNA的制备和DNA测序，确定相应的氨基酸组成。经过分析比较，发现筛选得到的4条十二肽氨基酸序列均含有4-5个His，表明多肽中His含量和Ni~(2+)结合能力的强弱有一定的关系。通过实验确定所获得的金属结合肽对不同金属的亲和能力和专一性，以及展示有金属肽的噬菌体对重金属离子具耐受和降毒作用。采用噬菌体展示筛选技术，金属抑菌实验和结合金属多肽克隆重金属螯合树脂的形态观察，测定重金属螯合树脂(Ni~(2+)，Cd~(2+)，Cr~(3+)，Cu~(2+)，Zn~(2+)，Co~(2+))对展示有Ni~(2+)金属多肽的噬菌体克隆的亲和能力(或专一性)。经分析比较，可以确定制备的金属螯合树脂可用于金属结合肽的亲和力的测定；获得的十二多肽对其它金属也有作用；Cu~(2+)、Ni~(2+)、Co~(2+)、Zn~(2+)金属离子比Cd~(2+)、Cr~(2+)等金属离子对Ni~(2+)金属结合多肽的亲和力要高；多肽中His的含量与Ni~(2+)结合能力的强弱有关；展示金属结合多肽的噬菌体对重金属离子Ni~(2+)具有一定的耐受和降毒作用；同时，树脂螯合金属结合多肽后对树脂粘性有影响。高效或专一的金属结合肽的获得对于研究金属-多肽相互作用以及环境重金属修复等均具有重要意义。本论文同时对基于金属结合蛋白的细菌构象型随机展示肽库的构建进行了初步的探讨。考虑目前从噬菌体随机肽库中筛选获得的金属结合肽未发现含有Cys等重要氨基酸，而从MTs、锌指结构等已知金属结合蛋白(多肽)中我们早已了解Cys在金属结合中的重要作用。本论文首次提出利用C2H2型锌指结构骨架模型，初步完成了寡核苷酸随机肽库的DNA设计、合成、细菌质粒空载体pLBB9的制备等工作，设想将锌指片段插入载体构建重组质粒而在细菌表面展示，目的是插入的目的序列在外膜蛋白LamB中展示，从而构建锌指蛋白基本骨架结构的细菌肽库，实现细菌随机肽库筛选与细菌表面展示的同步进行。并且，期望通过骨架随机肽库的筛选，获得Cys—His的结合肽序列，为更好的了解锌指蛋白中多肽与高效结合的重金属的作用机制以及金属结合肽—金属离子的相互作用研究，提供理论基础。
马春燕[5]2007年在《重金属离子Cd～（2+）结合肽的噬菌体随机肽库筛选与研究》文中研究指明重金属污染一直是世界普遍存在的环境问题，微生物修复治理重金属污染是一条有效和生态的途径，其中一个重要的研究领域是利用金属离子和金属结合蛋白或结合肽之间存在的强亲和能力特性进行的生物修复研究。表面展示技术的蓬勃发展为此方面的研究提供了高效便利的手段。目前相关研究的重点和难点在于获得高亲和力和特异性的金属结合肽和了解金属结合肽与金属的相互作用关系。本研究的主要内容是利用噬菌体随机十二肽库和固定化金属离子亲和层析(IMAC)树脂技术筛选针对Cd~(2+)特异结合的多肽，分析多肽序列，寻找Cd~(2+)结合肽的模式序列；对筛选得到的Cd~(2+)结合肽进行细菌金属解毒实验，确定它们的解毒作用；最后尝试利用细菌表面展示技术，构建重组细菌，研究将Cd~(2+)结合肽融合于细菌外膜蛋白并成功展示的可行性，为重组Cd~(2+)结合肽工程菌的构建建立基础。实验方法主要是应用IMAC和噬菌体随机肽库展示技术，就丝状噬菌体随机肽库对重金属离子(Cd~(2+))的结合特性进行研究。采用不同洗脱液[Ⅰ：ID(咪唑)；Ⅱ：Gly(甘氨酸)]从丝状噬菌体十二肽库中筛选和富集重金属结合肽。对洗脱的噬菌体扩增，提取噬菌体单链DNA，随机挑选克隆进行DNA序列测定。采用GeneBank Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)对所得Cd~(2+)结合肽寻找同源序列。采用Clustal X 1.81对本研究组筛选得到的Cd~(2+)、Ni~(2+)序列以及文献报道收集的Cd结合肽进行多重序列比对。噬菌体单克隆经扩增、纯化和滴度测定后，对重金属离子(Cu~(2+)、Ni~(2+)、Co~(2+)、Zn~(2+)、Cd~(2+)、Cr~(3+))螯合树脂进行以P／N值为代表的相对亲和力测定。噬菌体单克隆经扩增、感染大肠杆菌ER2738和铺板培养后，利用E．coli抑菌圈实验测定含Cd~(2+)结合肽的噬菌体对重金属离子(Cu~(2+)、Ni~(2+)、Co~(2+)、Zn~(2+)、Cd~(2+)、Cr~(3+))的抑菌解毒作用。采用基因重组的方法，通过酶切位点的设计和Xpress标签的引入，寡核苷酸序列的合成，完成插入片段的准备。利用细菌展示技术，以质粒pLBB9为载体，E. coli pop6510为宿主菌，以期构建含Cd~(2+)结合肽的重组工程菌。实验结果显示：经ID五轮筛选和Gly四轮筛选，洗脱的噬菌体滴度均呈增长趋势。测序共得到两条序列，其中一条序列KSLSRHDHIHHH出现频率高，为两种洗脱条件下所共有；另一条序列IFMESLPRLGMH只出现一次，为ID洗脱所得。序列分析未发现模式序列，GeneBank Blast未发现其与已知的金属蛋白或结构域存在着任何同源性。Clustal X1.81多重序列比对发现Cd~(2+)结合肽含有多个His，含有少量Gly，不含有Cys。No.1(3)结合肽(KSLSRHDHIHHH)对各种重金属离子树脂的亲和力远远大于No.2结合肽(IFMESLPRLGMH)的亲和力，但是两种结合肽对重金属离子的抑菌解毒作用相似。基因重组实验制备和初步鉴定了载体质粒以及含Cd~(2+)结合肽序列的寡聚核苷酸的质量，为基因工程菌的构建奠定了基础。通过以上工作，初步获得以下几点结论：(?)应用固定化金属离子亲和层析树脂和噬菌体展示技术，从丝状噬菌体随机十二肽库中获得一组对重金属离子Cd~(2+)高亲和力的肽序列和目的噬菌体克隆，其中组氨酸残基在Cd~(2+)结合肽中占有很高的比例，半胱氨酸残基不存在。(?)通过目的噬菌体单克隆与固定化金属离子亲和层析树脂的亲和测定，筛选得到的Cd~(2+)结合肽对其它重金属离子(Cu~(2+)、Co~(2+)、Ni~(2+)、Zn~(2+)、Cr~(3+))也有亲和作用，对Cd~(2+)和Cr~(3+)的亲和力相似，但均远远低于重金属离子Co~(2+)、Ni~(2+)、Cu~(2+)和Zn~(2+)，且No.1(3)结合肽(KSLSRHDHIHHH)对金属离子的亲和力普遍高于No.2结合肽(IFMESLPRLGMH)。(?)抑菌圈实验表明Cd~(2+)结合肽对多种重金属离子(Cd~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Ni~(2+)、Zn~(2+)、Cr~(3+))有解毒作用，对Cr~(3+)的解毒作用最大，Cd~(2+)的解毒作用最小，且两条Cd~(2+)结合肽对不同金属的解毒作用无明显差异。(?)Cd~(2+)结合肽对多种金属的亲和力和解毒效果有一定差异，这可能与金属离子外层电子结构、Cd~(2+)结合肽的表达形式以及金属的毒性和金属溶液浓度相关。两条Cd~(2+)结合肽的解毒效果无明显差异，可能因为作为金属螯合剂，只含有一个组氨酸的多肽与含有多个组氨酸的多肽在功能上可能相似。(?)通过对No.1(3)结合肽(KSLSRHDHIHHH)的设计与合成，质粒pLBB9的转化、扩增、提取和酶切回收，制备了寡核苷酸和空质粒pLBB9，为最后构建重组大肠杆菌工程菌奠定了基础。
曹晓婉[6]2017年在《基于噬菌体随机肽库研制新型酿酒酵母表面吸附剂》文中指出重金属镉的污染问题是困扰科研工作者的严重问题。与传统重金属污染治理的方式相比,生物修复方式更为有效、方便、节约。然而,单纯地利用微生物修复的方式往往满足不了整治环境中重金属的要求。于是,我们利用生物展示肽库与细胞表面的展示技术结合建立新型的细胞表面吸附剂。噬菌体展示肽库用于金属离子特异性肽的筛选,它是无限金属结合肽的来源。对文库进行淘选,我们可以得到亲和力比较强的配体分子。酿酒酵母作为研究菌株,本身就是一种良好的重金属离子生物吸附材料,再利用酿酒酵母细胞凝集素表面展示工程技术将镉离子亲和的金属结合肽展示在其细胞表面,使它的吸附效率得到提高。研究中将镉离子螯合树脂作为靶分子,它与噬菌体十二肽库进行筛选实验,最终得到与该重金属离子具有亲和能力的短肽。在筛选进行到第叁轮时P/N值达到56,说明了筛得的噬菌体克隆已经有较强的特异性。对这些噬菌体克隆进行序列测定与分析,最终得到了四条可用的金属结合肽。然后将镉离子结合肽以pYD1质粒作为载体,运用醋酸锂热激转化法转入酿酒酵母菌中。吸附效率测定结果表明,加入相同质量镉时,工程菌的吸附量优于对照菌EBY100,其中插入序列3的酿酒酵母对镉金属吸附效率最高,比对照菌的吸附率提高35%。运用海藻酸钠对重组菌进行固定化。固定化条件研究实验结果表明,当氯化钙浓度2%,海藻酸钠浓度为3%,温度为25℃时,固定化菌的吸附性能最为优异。在固定化菌的吸附性性能测定实验中发现重组菌较对照菌株的吸附效率有很大提升可达55.7%。
参考文献：
[1]. 金属结合肽的微生物展示与筛选及生物吸附作用研究[D]. 董洁. 中国人民解放军军事医学科学院. 2004
[2]. 金属结合肽的噬菌体随机肽库筛选和酵母细胞表面展示[D]. 茆灿泉. 中国人民解放军军事医学科学院. 2001
[3]. 微生物展示技术在重金属污染生物修复中的研究进展[J]. 茆灿泉, 薛沿宁. 生物工程进展. 2001
[4]. Ni～（2+）高效结合肽的筛选与作用研究[D]. 佟鑫. 西南交通大学. 2007
[5]. 重金属离子Cd～（2+）结合肽的噬菌体随机肽库筛选与研究[D]. 马春燕. 西南交通大学. 2007
[6]. 基于噬菌体随机肽库研制新型酿酒酵母表面吸附剂[D]. 曹晓婉. 河南大学. 2017
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