导读:本文包含了感染性分子克隆论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:病毒,感染性,全长,转染,基因,分子,肝炎。
感染性分子克隆论文文献综述
张海丽[1]（2015）在《牛肠道病毒的分离鉴定及HLJ-3531株感染性分子克隆的建立》一文中研究指出牛肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属成员,为单股正链RNA病毒。病毒粒子无囊膜,为二十面体球形结构,粒子直径约为25~30nm,基因组长度约为7500bp。2011年第9次国际病毒分类委员会分类报告将牛肠道病毒分类为EV-E和EV-F,其中EV-E分为EV-E1~E4,EV-F分为EV-F1~F6。牛肠道病毒的首次发现是在上世纪50年代末,由Kunin和Mc Ferran分别从健康牛粪便中分离得到,随后世界各地陆续有该病毒的分离报道,但中国关于此病毒的流行报道较少。牛肠道病毒的病原性并不明显,但由于其有时会侵犯其他器官而导致临床上各种综合征的出现。牛肠道病毒的感染宿主较广,包括牛、羊、马、犬、羊驼等动物。本研究从奶牛场采集两批粪便样本,第一批样本采自诊断为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阳性的患病奶牛,第二批样本采自患有消化道疾病症状的奶牛,同时从该牛场采集获得9份牛血清,血清经BVDV抗原及抗体检测均为阴性。两批病料共先后分离得到10株病毒,经BVDV巢式RT-PCR检测均为阴性。因此,本研究对分离病毒按未知病毒进行鉴定,核酸型鉴定为RNA病毒;蚀斑纯化后电镜观察病毒粒子形态为无囊膜球形,直径约25~30nm,符合小RNA病毒形态学特征;理化特性鉴定结果表明分离病毒具有耐酸、抗有机溶剂、对热敏感等特性;RT-PCR鉴定结果表明,两批病料分离毒株分别属于牛肠道病毒EV-E与EV-F,且同一批分离毒株同源性均在99%以上。故选取两批中最早出现病变的分离病毒继续后续试验并分别命名为HLJ-3531与HLJ-4149。血清中和试验研究表明,采自同一牛场的牛血清中2份含有HLJ-3531中和抗体,5份含有HLJ-4149中和抗体,免疫电镜试验进一步揭示了抗原抗体反应复合物的存在。病毒细胞嗜性分析显示,两株病毒均可感染牛、猪、兔、非洲绿猴、鸡、犬、仓鼠、猫等多种动物细胞,但对牛、仓鼠、非洲绿猴的细胞嗜性较强,对兔、犬、猪源的细胞嗜性较弱。重组牛IFNa/β/λ等对两株病毒的繁殖均有抑制作用。为分析两株病毒的基因序列及进化树关系,参考NCBI已公布序列,设计简并引物,采用重迭RT-PCR技术扩增HLJ-3531及HLJ-4149基因组。为确保基因序列的真实性及精确性,两株病毒的5’UTR均采用RACE法扩增,其余片段则采用高保真酶扩增。经序列拼接得到,HLJ-3531病毒株全基因序列为7448bp,HLJ-4149病毒株全基因序列为7437bp,均由5’UTR、开放阅读框(ORF)、3’UTR及ploy(A)尾巴组成。两株病毒全基因组核苷酸同源性为68.40%,ORF氨基酸同源性为73.40%。以VP1序列绘制进化树,分析显示HLJ-3531属EV-E2分支,与56/59/1株核苷酸同源性最高(77.71%),与SD1182 II株氨基酸同源性最高(95.65%);HLJ-4149属EV-F1分支,与IL/alpaca核苷酸同源性最高(81%),与BEV-261氨基酸同源性最高(96%)。本研究以分离得到的两株病毒为研究对象建立了ICR乳鼠感染模型。两株病毒经BHK-21细胞连续传代3次后,取50μL病毒液(滴度为108TCID50/0.1m L)分别经腹腔注射感染乳鼠,在感染后4、7、14、21d取感染小鼠心、肝、肠、肺组织,进行半定量RT-PCR及HE染色检测,同时在感染后7、14、21d取感染小鼠血清分析小鼠体内抗体水平。结果表明,肉眼观察时,HLJ-3531株感染小鼠在21d可观察到肠黏膜出血症状,而HLJ-4149株感染小鼠在整个观察周期都未引起肉眼可观的病理变化;RT-PCR检测结果显示,两株病毒均不能感染心组织,可感染肝、肠、肺组织,HLJ-3531株感染小鼠整个检测周期中在肝、肠、肺中均能扩增到病毒特异性目的条带,而HLJ-4149株在感染后4、7、14d在肝、肠、肺中可检测到特异性条带,但病毒含量逐渐变少,21d已检测不到;HE染色结果显示,乳鼠在分别感染两株病毒后心组织都未出现病变,HLJ-3531株感染组小鼠在整个观察周期中肠、肝、肺组织都出现明显病变,且随感染时间的推移病变逐渐加剧,HLJ-4149株感染组小鼠肠、肝、肺组织出现病变,但其病理变化先随着时间的推移加剧(0→4→7d),之后又开始慢慢恢复(7→14→21d);血清中和试验显示,两株病毒感染组小鼠在第7d均已产生抗体,之后逐渐升高(14d),HLJ-4149株感染组小鼠21d血清中抗体水平下降,而HLJ-3531组小鼠血清中依然存在较高滴度的中和抗体。致病性实验结果显示,两株病毒均可感染小鼠且引起组织病理变化,但引起病变的程度及持续时间存在差异。由于两株病毒分离自同一牛场,血清中和试验检测到同一牛血清中含有两种病毒的中和抗体,故怀疑牛场存在多重感染的现象。为验证两株病毒是否可以混合感染同一个体动物且引起病理变化,本研究以ICR乳鼠为动物模型模拟了多重感染。取等体积混合的病毒液50μL腹腔注射感染乳鼠,乳鼠在整个周期外观上与对照组相比都无明显差异,组织解剖时在14d与21d可观察到小鼠有肠黏膜出血的症状,且症状逐渐加强,21d时亦观察到肝脏肿大症状。组织RT-PCR与HE染色分析结果显示,两株病毒可同时感染同一个体且引起组织病理变化,所引起的病理变化强于单独感染组,病程亦比单独感染组较长,表明HLJ-3531株与HLJ-4149株在病毒感染过程中有协同效应。血清中抗体水平分析显示,同一个体中同时存在两株病毒的抗体,且随着感染时间的推移逐渐升高。本研究在国内外首次成功建立了牛肠道病毒乳鼠感染模型,初步研究了牛肠道病毒的致病性,为牛肠道病毒致病机制的深入研究提供了动物模型及物质基础。根据HLJ-3531全基因克隆序列拼接结果,设计全长c DNA构建引物,以pBluescript SK(-)为克隆载体,采取融合PCR与经典酶切法相结合的策略进行全长构建。HLJ-3531全基因序列分为两大片段3531-A与3531-B,在全序列5’端引入T7启动子序列。3531-A片段分为叁个小片段,融合PCR获得。3531-B分为两个小片段,并在两片段重迭部分通过引物引入分子标记Nae I酶切位点(氨基酸同义突变)。含全长c DNA的重组质粒p BSK-3531鉴定正确后,线性化并转染能稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR细胞系,产生病变后连续传代。RT-PCR、分子标记测序、间接免疫荧光、免疫电镜等鉴定结果显示重组病毒r HLJ-3531拯救成功,r HLJ-3531与亲本毒株具有相似的宿主嗜性、TCID50及生长曲线。本研究成功构建了牛肠道病毒HLJ-3531株的感染性克隆,并拯救出带有分子标记的重组病毒,为牛肠道病毒基因组的结构与功能、分子致病机制的研究及载体疫苗的构建等奠定了物质基础与技术平台。(本文来源于《东北农业大学》期刊2015-06-01）
张志龙[2]（2014）在《鸭圆环病毒四川毒株的进化分析及感染性分子克隆的构建》一文中研究指出鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)是近年来新发现的水禽感染性病原,造成鸭生长迟缓,体重下降等症状。病毒主要侵染鸭淋巴器官,患鸭后会引发免疫抑制及可能的二次感染,对养殖业造成了较大的经济损失。因此,分析我国DuCV的遗传演化规律并构建体外转录的模型具有十分重要的科学意义。1.DuCV的分离、鉴定及全基因组序列分析本研究从疑似感染DuCV的病鸭体内分离到一株DuCV(命名为DuCV-GH01),通过PCR得到病毒全基因组进行序列分析表明,DuCV-GH01的核苷酸序列与目前GenBank登录的所有DuCV序列相似性高达81.8%～99.4%,根据PASC的p值/频率分布图获得,当不同基因组的p值大于0.170时,可分为DuCV1和DuCV2;当DuCVl和DuCV2的型间p值大于0.032或0.018时,可以将鸭圆环病毒细分为1a、1b、1c和2a、2b、2c 6个亚型。这个结果证明DuCV由一个共同祖先经过不同的进化过程分化为DuCV-1和DuCV-2。2. DuCV的基因重组及选择压力分析通过系统进化树分析发现利用全基因组进行分型时的3株DuCV-2a毒株(GenBank No.EU344802.EU344805和EU499309)在利用Rep基因进行基因分型时结果不同。通过分析发现,是由于这3株毒株的Rep基因的第71至581位碱基序列与DuCV-1a的相同区域的碱基序列发生了重组。利用基因重组分析软件获得DuCV的5个主要基因重组事件,且重组主要发生非结构蛋白Rep和结构蛋白Cap的编码区,DuCV利用基因重组增加其基因组的多样性。通过对DuCV1型和2型的抗原表位以及糖基化位点分析,表明DuCV1型和DuCV2型的氨基酸的差异,可能造成DuCV1型的抗原性稍强于DuCV2型的抗原性,使其所受到的免疫压力更大。此外,经分析选择压力中的净化选择压也在DuCV的进化中起到了重要的作用。3. DuCV反向遗传学平台的建立及其病毒拯救为了构建含有遗传标记的感染性克隆,进一步研究鸭圆环病毒的致病机制。本研究利用PCR扩增鸭圆环病毒GH01株全基因组CG,将2个基因组Ic-1、IC-2顺式连接插入到pUC19载体中获得串连双拷贝重组质粒pIC-2DuCV,并通过同义突变引入酶切标记位点Xho1获得pIC-Mu2DuCV。重组质粒pIC-Mu2DuCV经过EcoRI线性化,以1OOμg/kgDNA和200μl/kg的脂质体肌肉注射10日龄DuCV阴性雏鸭。结果显示,成功构建含有分子标记XhoI的串连双拷贝重组质粒pIC-Mu2DuCV,经肌肉注射雏鸭转染组于转染21d后检出血清阳性,并通过测序经XhoI标记位点将拯救出的病毒与野生毒株进行区分。本试验构建的DuCV全长基因组头尾串联二聚体感染性克隆DNA可以转染雏鸭并增殖出带标记的DuCV病毒,为进一步研究DuCV分子特性和致病机理打下了基础。4.拯救毒株的部分生物学特性研究采用本文构建的感染性克隆技术构建对鸭圆环病毒GH01株进行病毒拯救,拯救出病毒(命名为PMDC),与亲本毒株GH01进行增殖与致病性分析。对照组PBS组的平均日增重(ADWG)明显高于拯救毒株PMDC、亲本毒株GH0l感染组,统计学差异显着(p<0.05),而PMDC组的ADWG低于GH01组,但统计学差异不显着(p>0.05)；直肠温度监测表明,各实验组感染雏鸭均无任何体温表现,其直肠温度均在41.7℃-42.2℃之间；PMDC、GH01、PBS组的临床评价分别为12.6、15.6和0,说明PMDC组和GH01组无明显差异,且同时都与阴性对照PBS组差异显着；病毒血检测发现,PBS组无病毒血症出现,GH01、PMDC组分别于攻毒后10d和15d检测到病毒血的出现；同时,GH01、PMDC组分别于15d和21d开始出现DuCV特异性抗体。经过定量检测,血清中含量最低,病毒载量在2.75 x 103-7.06×103copies/μL之间,但出现较早,分别于10DPC和15DPC就在GH01组和PMDC组中检测到。在GH01组中法氏囊于10DPC首次检测到DuCV,病毒载量为8.73×103-4.39×104 copies/mg,PMDC组于15DPC时在BF中检测到病毒核酸,其载量为4.72×1O3-8.34×1O3 copies/mg。本研究证明,拯救的毒株PMDC与亲本毒株GH01的致病性和增值能力相似,但均低于亲本毒株。(本文来源于《四川农业大学》期刊2014-06-01）
朱艳梅,胡增垒,宋庆庆,段志强,顾敏[3]（2012）在《鸽源新城疫病毒JS/07/04/Pi株感染性分子克隆的构建及病毒拯救》一文中研究指出参照GenBank上公布的鸽源Ⅵb亚型新城疫病毒JS/07/04/Pi株基因组全序列设计9对引物,RT-PCR扩增目的片段后,依次亚克隆至TVT7/R转录载体,成功构建出含JS/07/04/Pi株基因组全长cDNA的转录载体TVT/071204。然后将其与叁个辅助表达质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染BSR-T7/5细胞,60h后将转染细胞及其上清接种鸡胚,收集死亡鸡胚尿囊液进行HA与HI试验。结果显示死亡鸡胚尿囊液HA呈阳性,并能被ND阳性血清所抑制,表明该病毒已成功拯救,且拯救病毒rNDV/071204在细胞上的生长增殖能力同母本病毒相似。该病毒的成功拯救为鸽源Ⅵb亚型NDV感染的宿主特异性及鸽用ND新型疫苗的研究提供了理想的生物材料。(本文来源于《病毒学报》期刊2012年01期）
李秀梅,江丽萍,郭立力,李颖,朱雅宁[4]（2011）在《鸡贫血病毒全长基因感染性分子克隆的构建》一文中研究指出PCR法扩增鸡贫血病毒全长基因组,将2个全长基因组顺向连接插入到pBluescriptΠSK(+)质粒载体中,获得Psk2CAV质粒并转染MDCC-MSB1细胞,盲传4代后,用间接免疫荧光抗体试验(IFA)能检测到特异性荧光。将Psk2CAV质粒DNA于腿部肌肉接种10羽1日龄CAV阴性SPF鸡。剖检结果显示,阳性对照组和Psk2CAV质粒组均有鸡只出现腿肌、胸肌轻微出血,胸腺出现萎缩或出血。组织病理学结果显示,阳性对照组和Psk2CAV质粒组胸腺小叶萎缩,出血、淤血,髓质部萎缩,淋巴细胞减少。通过PCR可以分别从体外感染MDCC-MSB1细胞和体内感染鸡只中扩增到病毒基因片段。本研究证明含有双拷贝CAV的重组质粒Psk2CAV在体内、外均具有感染性,能衍生出病毒,并产生符合自然感染CAV的大体病变和组织病理学变化。(本文来源于《动物医学进展》期刊2011年08期）
张善瑞,周艳君,朱建平,童武,姜一峰[5]（2011）在《高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定》一文中研究指出为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆,本实验根据 PRRSV HuN4 株基因组序列设计并合成 PRRSV 特异性引物,应用 RT-PCR 技术分6段扩增了 PRRS VHuN4 株全基因组 cDNA。将扩增的各个cDNA部分重迭片段分别克隆于 pBlueScriptⅡSK(+)载体中构建了感染性重组质粒 pHuN4。并在病毒 cDNA5'末端引入 sp6 启动子序列便于后期的体外转录获得病毒的转录本,在3'末段 Poly(A)尾引入 NotⅠ酶切位点用于线性化 pHuN4;此外,将 HuN4 基因组第14680位的A沉默突变为G产生一个 MluⅠ酶切位点作为鉴定拯救病毒的分子标记。pHuN4 通过酶切线性化后经体外转录及转染BHK细胞,并在 Marc-145 细胞中救获病毒。结果显示:救获的病毒能够在 Marc145 细胞引起明显的细胞病变;间接免疫荧光检测以及分子标记验证结果表明病毒拯救成功,而且拯救的病毒与亲本强毒生长曲线没有显着差异。利用拯救的第5代克隆病毒株对本动物进行致病性试验,结果显示实验猪在感染后第3d开始出现体温升高、厌食、消瘦等临床表现,发病率达100%,在感染后20d内陆续死亡,表明拯救的病毒保持了与亲本病毒株相一致的致病特征,以上研究证实我们成功的构建并获得 PRRSV 强毒 HuN4 株感染性克隆,为从基因水平上研究 PRRSV 的致病机制提供了技术平台。(本文来源于《中国预防兽医学报》期刊2011年07期）
王礞礞[6]（2011）在《猪源TTV：分子流行病学，全长序列分析及感染性分子克隆的构建》一文中研究指出输血传播病毒(Torque teno virus, TTV)是一种小的,无囊膜的,单股环状负链的DNA病毒,目前该病毒被归于圆环病毒科的指环病毒属。TTV是继甲、乙、丙、戊型肝炎病毒之后又发现的一种新型肝炎病毒。该病毒最早是由日本学者于1997年从一例输血后发生急性感染的非甲~戊型肝炎病人血清中发现的,因而被称输血传播病毒。调查发现TTV在人群中感染率很高,在猪、牛、羊、猫、狗等多种动物体内也相继发现有TTV的感染。猪源TTV在全世界大部分猪场都具有很高的感染率,引起了人们的广泛关注。目前的流行病学调查显示,猪源TTV和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒共感染可诱发猪的皮肤肾炎综合症,和猪圆环病毒共感染可诱发断奶仔猪代谢综合症,还可能与猪圆环病毒或猪戊型肝炎病毒共同诱发猪的传染性肝炎。由于猪源TTV具有潜在的危害,目前对此病毒的了解非常少,因此对其进行相关的研究是非常必要的。本文根据GenBank上发表的PCV2基因组序列和TTV1和TTV2的非编码区(UTR)序列设计合成引物,分别建立了用于检测PCV2和TTV1、TTV2的PCR及巢式PCR方法。对来自广东、福建和江西等7个省份的258份血液样品和组织样品进行了检测,结果表明猪群中TTV1和TTV2感染总阳性率分别为37.6%和82.6%,二者的混合感染率为34.5%。94份样品表现为PCV2和TTV1的混合感染,占样品总数的36.4%;193份样品表现为PCV2和TTV2的混合感染,占74.8%;另外,还有一些样品为叁重感染,占34.5%。挑选部分阳性样品用套式PCR引物扩增出TTV1和TTV2的部分UTR片段,并将扩增出的部分UTR基因与已报道的TTV1和TTV2的UTR序列进行比较分析。分析结果显示本研究获得的TTV1毒株之间的UTR核苷酸同源性为80.8%-98.5%,TTV2毒株之间的UTR核苷酸同源性为94.2%-100%,而与参考株相比同源性分别为82.7%-100%和95.5%-99.1%。本研究从基因水平证实我国猪群中存在TTV的感染,提示我们TTV对猪群是一个不容忽视的新病原,并且确定了猪群中PCV2与TTV1和/或TTV2混合感染情况。从流行病学调查为阳性样品中选取其中病毒滴度高的样品,进行全长序列的扩增,测序过程中发现,在TTV1和TTV2基因组中均存在一段高GC并且有特殊结构的区域,导致测序结果不理想。针对这一问题,分别设计了2对和3对覆盖TTV1和TTV2全长的套式PCR引物,对阳性样品进行扩增,获得了7株全长序列,3株TTV1,4株TTV2。将所得到的TTV序列与GenBank中的10株参考序列进行核苷酸和氨基酸的比对和分析,核苷酸比对结果显示,获得的猪源TTV1和TTV2之间的同源性不到10%,TTV1分离株之间的核苷酸同源性为94.6-96.5%,与参考序列的同源性为61.5-98.3%,TTV2分离株之间的核苷酸同源性为92.4-94.8%,与参考序列之间的同源性为85.4-96.2%。氨基酸比对结果显示,TTV1分离株的ORF1,2,3的氨基酸同源性均97.5%以上,但与参考序列的同源性则分成了两种情况,与AB076001和GU456383参考序列的同源性在97.5%以上,而与其他4株参考序列的同源性则不到50%。TTV2分离株的ORF1,2,3的氨基酸同源性均在88.3%以上,而和参考序列的同源性均在80%以上,只与参考序列GU88046 ORF3的同源性出现了低于50%的例外。通过比较分析也发现,TTV叁个ORF的氨基酸同源性普遍低于核苷酸的同源性。与此同时,还发现核苷酸同源性大于90%的TTV序列之间,存在高频率的G/A碱基互换,在TTV1的ORF1中,其互换率在40-57.6%之间,ORF2的互换率在50-60%之间,明显高于其他碱基之间的互换率,而在TTV2中核苷酸同源性大于90%的序列只有两株,其ORF1的G/A的互换率为27.7%和42.9%,高于其它碱基的互换,在ORF2中,互换率为60%,明显高于其他碱基的互换率。进一步的研究表明去甲基化能明显减小测序困难,其中对FJ/China/2010/TTV2/2的测序完全正常,对FJ/China/2010/TTV2/2的全长序列进行了GC岛、DNA二级结构的预测和甲基化水平分析,结果表明,在FJ/China/2010/TTV2/2的难测区和高GC区均存在复杂的茎环结构,但没有GC对的甲基化。对猪源TTV2中的假想蛋白ORF1,ORF2进行原核表达,由于ORF1 N端含有大量疏水氨基酸,因此对ORF1进行了截短,即ORF1a,表达结果显示ORF1a为包涵体,ORF2为可溶性蛋白。通过包涵体纯化和谷胱甘肽亲和层析(GST)纯化获得高纯度的可溶性重组蛋白,将纯化的ORF1a蛋白和ORF2蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,ELISA效价可达1:6000。另外,分别将TTV2的ORF1,ORF2和ORF3克隆到真核表达载体3×Flag中,构建了重组的真核表达质粒3×FLAG-ORF1,ORF2和ORF3。将其转染细胞,通过自制抗体的间接免疫荧光(IFA)试验证明了自制抗体的有效性,且通过3×FLAG标签抗体的IFA对叁个假想蛋白进行了细胞定位,结果显示ORF1蛋白是核定位的,ORF2蛋白分布在整个细胞,ORF3蛋白主要集中在核浆中,在核仁的外围尤为明显。由于猪源TTV在猪体内的含量比较低,目前还没有能够支持其复制的细胞系,所以其分子机制和生物学的研究一直受到限制。为了研究猪源TTV的一些关键的分子生物学活性(如转录和复制),本研究分段扩增了FJ/China/2010/TTV2/2的全长序列,该序列全长2796个核苷酸,与最早分离出的TTV2原型Sd-TTV2p (AY823991)的同源性为85.4%,用该序列构建出了分别含有1.0个,1.3个,2.0个全长基因组的载体为pSK的质粒。通过将构建质粒转染PK15细胞,48h后的Northern Blot实验,验证了叁个主要阅读框的存在和ORF3剪切的发生;通过基于酶切的Southern Blot实验进行了病毒复制的研究,没有检测到构建质粒在PK15细胞中的复制;用自制ORF1a,ORF2抗体,通过间接免疫荧光实验检测构建质粒的蛋白表达情况,在72h后能够用ORF1a抗体检测到ORF1的蛋白表达,但ORF2抗体没有检测到荧光。Northern Blot和IFA试验证明了我们所构建的猪源TTV感染性分子克隆的可行性。这些实验为研究TTV的分子生物学机制搭建了平台,也为找到可以培养TTV的细胞系奠定了基础。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2011-06-01）
邓小芸[7]（2011）在《网状内皮组织增生症病毒LAMP检测方法及感染性分子克隆的建立》一文中研究指出网状内皮组织增生症(Reticuloendotheliosis,RE)是禽类一种重要的免疫抑制性和致瘤性疾病。近年来,国内外鸡群中REV流行逐渐严重。REV与马立克氏病病毒(MDV)、鸡贫血病毒(CAV)和J-亚群禽白血病病毒(ALV-J)几种免疫抑制性病毒的混合感染在部分养鸡场中普遍存在,使得鸡群免疫力低下,导致禽流感、新城疫等重要疫苗免疫失败,并容易造成继发感染,使疫病的诊断和防控难度加大。另外,REV基因组易于整合到MDV和FPV基因组中,从而导致商品化疫苗受到污染。使用非SPF禽胚制备的疫苗也有污染REV的潜在危险。近来,RE的危害正逐渐被人们关注,但RE的诊断、流行病学以及基础研究仍不完善。为了更好地认识和防控RE,本文进行了如下方面的研究:1 REV LAMP可视化快速检测方法的建立借助新兴的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),设计了4条针对REV pol基因的6个位点的特异性引物,建立了一套简便、灵敏和特异的检测方法。该方法不与常见的感染鸡群的DNA病毒(MDV、CAV)及ALV-J发生交叉反应,比常规的PCR方法灵敏25倍;另外,该LAMP方法在临床样品方面的检测效率与传统的PCR方法相当;而且操作简单,不需要复杂的仪器,常规水浴锅即可进行,肉眼可直接观察检测结果。2 REV gp90蛋白的表达及多克隆抗体的制备利用PCR技术,从病料中扩增REV gp90基因,将其分别克隆至真核表达载体pFastBacHTA和原核表达载体pET-28a(+)中,从而构建了真核表达的供体质粒pF-gp90和原核表达质粒pET28-gp90。pF-gp90转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使gp90基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体Bacmidgp90。通过脂质体介导将其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacgp90。通过Western blot和IFA验证,rBacgp90可正确表达gp90蛋白,蛋白大小约为45kDa,变性和自然状态下均能够被识别,具有良好的生物活性。将pET28-gp90转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,进行gp90蛋白原核表达并通过Western blot检测,确定其以包涵体形式正确表达。纯化gp90蛋白并免疫6-8周龄Balb/c小鼠,制备抗gp90的多克隆抗体。免疫小鼠后获得的抗血清可与感染CEF细胞的REV发生特异性反应,ELISA效价达到1:12800。3 RE流行病学研究对我国9个省35个蛋鸡场进行了血清学调查,89%的鸡场REV抗体阳性,阳性率为1%-98%,平均阳性率为15%,说明REV在我国广泛流行,部分地区较为严重。将研磨后无菌处理的病料接种于CEF或DF1,置37℃CO_2培养箱培养,7d后收毒,连续盲传至少3代。做间接免疫荧光、PCR和电镜检测,确定是否分离到病毒。从东北地区的黑龙江、吉林、辽宁等省的一些鸡场分离到10株REV。以HLJR0901为例,测得其TCID_(50)为10~(5.2)/mL。通过绘制复制动力学曲线对其在CEF细胞上的增殖动态规律进行了研究,发现第六天和第七天REV增殖的滴度最高。将所分离的REV的主要保护性抗原基因-gp90基因,克隆至pMD-18T载体,测序并上传GenBank。以前病毒cDNA为模板,将HLJR0901基因组分六段进行了克隆和测序。最后确定:HLJR0901全长8284bp,GenBank登录号为GQ415646。序列分析结果显示:HLJR0901的LTR序列与FA株完全同源;与APC-566的同源性也高达99%。Pol是最稳定基因。LTR核苷酸、gag氨基酸、pol氨基酸、gp90氨基酸、env氨基酸以及全基因组核苷酸的遗传进化树显现了一个共同的特征:①所比较的毒株明显地分为叁个分枝,分别代表REV的3个亚型;②东北分离株形成一个独立的群体,与我国早期南方毒株HA9901(亚型I)同源性较低,可能源于不同的祖先;③我国至少存在两种REV亚型(I型和III型),III型REV是目前东北地区的流行毒株。④东北分离株与目前美国和台湾的一些流行毒株亲缘关系较近。4 REV感染性分子克隆的建立及应用通过重迭延伸PCR (SOE PCR)和酶切拼接将HLJR0901的全基因组克隆于pBluescript II载体中,并在基因组中通过改变核苷酸(C2250G)消除了其中的MscI酶切位点作为分子标签,构建了REV感染性分子克隆pBlu-mHLJR0901。将纯化的pBlu-mHLJR0901转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行病毒拯救,经间接免疫荧光(IFA)、PCR、测序及电镜鉴定,成功拯救出REV。拯救病毒rHLJR0901在CEF细胞上具有与亲本毒相似的复制特性。基于感染性分子克隆,开展了表达EGFP的重组REV的构建:在HLJR0901全基因组934位点(gag基因启动子上游)和7713位点(env基因终止子下游)插入了EGFP基因,转染CEF细胞后,前者EGFP能够瞬时高效表达,后者不能表达。但最终均没有拯救出重组病毒,其具体机制有待进一步探讨。本研究还发现,REV LTR的启动子功能具有广谱性,不仅在鸡源细胞上能够被识别,而且在哺乳细胞上也能被识别。这些结果为REV的基础研究提供了参考。5 REV动物感染实验将拯救的REV毒株rHLJR0901通过腹腔接种途径感染1日龄SPF雏鸡,进行REV的致病性研究。结果显示:2周龄时REV能够明显影响鸡的生长性能;REV对肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊等免疫相关器官均有一定程度的影响;感染后3w时血清开始阳转,但血清抗体阳性率一直是75%;整个实验周期内均可检测到病毒血症。动物感染实验为REV病毒感染模型的建立提供了必要的数据,并提示病毒血症可以作为REV病毒感染模型的稳定指标之一。(本文来源于《东北农业大学》期刊2011-04-06）
云涛[8]（2010）在《DHV-Ⅰ感染性分子克隆的建立及其衍生病毒的生物学特性研究》一文中研究指出鸭Ⅰ型病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus, DHV)引起的雏鸭的一种急性、高度致死性传染病,其特征以肝坏死为主。将肝组织病料碾磨液上清,接种BHK-21细胞,盲传3代后,该病毒可使BHK-21细胞病变,将细胞培养物裂解上清经浓缩、负染后电镜观察可见直径约30nm,无囊膜的球形病毒粒子;间接免疫荧光试验结果表明,该分离株与Ⅰ型鸭肝炎病毒阳性血清反应发出强特异性荧光;以特异性引物对分离的病毒进行RT-PCR,扩增出一条238bp的单一条带,序列比对分析也表明与已知DHV-Ⅰ序列同源性97.1%。结果表明,该分离株为鸭Ⅰ型肝炎病毒株,暂命名为ZJ-V/2006。实践证明,反向遗传学技术是深入开展RNA病毒分子生物学以及病毒致病机理等方面研究的最有效手段。我们利用基因工程技术在国内外首次建立了DHV-Ⅰ的反向遗传学操作系统,在体外实施DHV-Ⅰ的遗传拯救,并系统研究拯救病毒的生物学特性。1.根据DHV-ⅠZJ-V/2006株全基因组序列设计并合成5对特异引物,进而应用RT-PCR技术分5段扩增了DHV全基因组cDNA。将扩增的cDNA重迭片段A、B、C和DE片段分别克隆到载体pBluescriptⅡK S (+)中,获得了DHV全长基因组cDNA克隆pBLDHV。在扩增5′末端时,引入ApaⅠ酶切位点和SP6启动子序列;在基因组3′末段PolyA尾引入NruⅠ酶切位点,以供cDNA模板的线性化之用。核酸序列分析表明, DHV-Ⅰ毒株基因组全长为7 711个核苷酸,与DHV-ⅠZJ-V BHK-21细胞分离株的同源性为99.9 %;全长基因组中有6个核苷酸发生突变,均未导致对应的氨基酸发生改变,为沉默突变。2.我们利用NruⅠ将pBLDHV线性化后,以之为模板,利用SP6 RNA聚合酶系统在体外进行转录,获得病毒RNA。再通过脂质体介导法,将转录物RNA导入BHK-21细胞。观察致细胞病变(CPE)产生情况。观察结果表明,转染24h后,可在显微镜下看到DHV-Ⅰ的致细胞病变的效应,细胞表现为形态变圆、聚堆、折光率增大等现象;48h,CPE变得更加明显,并有细胞脱落现象;72h,70%的细胞脱落,收集细胞培养物。随后,再分别使用RT-PCR方法、限制性内切酶消化法、间接免疫荧光技术以及电镜观察等方法,对拯救病毒进行了综合鉴定。研究结果证明,在电镜下可观察到典型的病毒颗粒,直径在30nm左右;拯救病毒能与DHV-Ⅰ的阳性血清反应;从拯救病毒的核酸抽提物中不仅能扩增出DHV-Ⅰ的特异性基因组序列,而且用EcoRⅠ可切开PCR扩增产物,从而证明,我们获得的病毒是拯救病毒,而非污染了母本病毒。综上所述,我们在体外成功拯救到了DHV-Ⅰ。3.在上述研究基础上,我们又系统研究了拯救病毒(rDHV-Ⅰ)在BHK-21细胞中的生物学特性及增殖特征等。首先,用半数组织感染量(TCID50)法测定了rDHV-Ⅰ的滴度,并绘制了一步生长曲线,结果表明与DHV-Ⅰ在BHK-21细胞中的滴度相似,具有相近的增殖动力学特征。实时定量RT-PCR检测结果表明,rDHV-Ⅰ不仅能在BHK-21细胞中进行高水平复制,而且RNA的拷贝数与培养时间具有相关性,在接毒后病毒RNA的拷贝数逐渐增加,到第48 hr,RNA的拷贝数达到峰值(3.27×109拷贝/mL) ,随后病毒基因组的拷贝数逐渐降低。此外,通过毒力试验也证明了rDHV-Ⅰ与母本病毒在引起的临床症状没有明显不同,生存曲线也相似。结果表明,我们已利用反向遗传学技术在体外成功拯救到了DHV-Ⅰ,而且这种人工拯救病毒具有与母本毒具有相似的分子生物学特征。4.为了建立一种有效快速检测DHV-Ⅰ的方法,我们根据DHV-Ⅰ基因组中最保守的编码RNA依赖RNA聚合酶(RdRP)的3D基因,在其保守区设计合成了1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ模式的实时荧光定量PCR方法,用于检测DHV-Ⅰ。以pMD-3D质粒为阳性对照制作标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价。用该方法检测DBHV、DEDSV、DPMV、DPV、DRV和RA均呈阴性,表明该方法特异性良好;敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为1 TCID50 / 0. 1 mL;对20份临床疑似的DHV-Ⅰ病料的检测结果显示,该方法与病毒分离的符合率为100%。从而表明,建立的DHV-ⅠSYBR GreenⅠP CR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。我们建立的这种快速、敏感和特异的rPCR将为DHV-Ⅰ的临床检测,体内分布模式和分子流行病学调查提供一种强有力的工具。综上所述,我们成功地用BHK-21细胞分离得到了DHV-Ⅰ,命名为ZJ-V/2006株;首次成功构建了该毒株的感染性克隆cDNA;系统研究了该拯救病毒以及其衍生病毒的生物学特性;成功建立了一种DHV-Ⅰ快速准确的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法。这些的研究成果将为从细胞水平、分子水平上探讨DHV-Ⅰ的生物学特性、致病机理、鸡胚传代毒力减弱机理、新型疫苗以及分子流行病毒学调查等方面的研究提供了良好的技术平台。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2010-04-01）
于可响,马秀丽,李玉峰,吴静,林树乾[9]（2009）在《1型鸭肝炎病毒CL株感染性分子克隆的构建》一文中研究指出【目的】构建1型鸭肝炎病毒(DHV)的感染性克隆,用于研究其基因组的结构与功能。【方法】用RT-PCR方法扩增出覆盖整个1型鸭肝炎病毒CL株基因组3个忠实性片段,并按顺序组装进载体pBR322中,获得全长cDNA克隆(BR-CL)。将BR-CL在体外转录出的RNA转染鸭胚肾细胞,并传至第6代,利用RT-PCR方法和间接免疫荧光试验进行鉴定。将获得的子代病毒(CL-R)在SPF鸡胚上传代,观察鸡胚死亡及胚体病变情况。通过胶体金免疫电镜观察子代病毒粒子的形态。【结果】RT-PCR、间接免疫荧光和胶体金免疫电镜均检测到了子代病毒。通过感染SPF鸡胚试验发现,子代病毒能致死鸡胚。【结论】本研究成功构建出具有感染性的DHV全长cDNA克隆,这在国内外还是首次报道,为进一步揭示DHV基因组的结构和功能提供了良好的技术平台。(本文来源于《微生物学报》期刊2009年12期）
吕建亮,张永光,王永录,潘丽,刘力宽[10]（2009）在《口蹄疫病毒泛亚型O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建和感染性鉴定》一文中研究指出设计并合成了O型口蹄疫泛亚型代表毒株O/CHINA/99基因组9条引物,利用RT-PCR扩增各基因片段,酶切后连到pOK-12载体上,经酶切、PCR和序列测定表明,O/CHINA/99全基因组由8 200个核苷酸组成,构建的感染性cDNA与原毒株的序列同源性为99.1%;利用T7 RNA聚合酶系统进行体外转录,转录产物RNA用脂质体转入BHK-21细胞传代培养,可观察到典型的FMDV致细胞病变效应;拯救病毒接种2日龄乳鼠后,可出现典型的临床症状,并于16～48h内死亡。以上结果表明,O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建成功,并从构建的全长cDNA拯救出了口蹄疫病毒。(本文来源于《病毒学报》期刊2009年01期）
感染性分子克隆论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)是近年来新发现的水禽感染性病原,造成鸭生长迟缓,体重下降等症状。病毒主要侵染鸭淋巴器官,患鸭后会引发免疫抑制及可能的二次感染,对养殖业造成了较大的经济损失。因此,分析我国DuCV的遗传演化规律并构建体外转录的模型具有十分重要的科学意义。1.DuCV的分离、鉴定及全基因组序列分析本研究从疑似感染DuCV的病鸭体内分离到一株DuCV(命名为DuCV-GH01),通过PCR得到病毒全基因组进行序列分析表明,DuCV-GH01的核苷酸序列与目前GenBank登录的所有DuCV序列相似性高达81.8%～99.4%,根据PASC的p值/频率分布图获得,当不同基因组的p值大于0.170时,可分为DuCV1和DuCV2;当DuCVl和DuCV2的型间p值大于0.032或0.018时,可以将鸭圆环病毒细分为1a、1b、1c和2a、2b、2c 6个亚型。这个结果证明DuCV由一个共同祖先经过不同的进化过程分化为DuCV-1和DuCV-2。2. DuCV的基因重组及选择压力分析通过系统进化树分析发现利用全基因组进行分型时的3株DuCV-2a毒株(GenBank No.EU344802.EU344805和EU499309)在利用Rep基因进行基因分型时结果不同。通过分析发现,是由于这3株毒株的Rep基因的第71至581位碱基序列与DuCV-1a的相同区域的碱基序列发生了重组。利用基因重组分析软件获得DuCV的5个主要基因重组事件,且重组主要发生非结构蛋白Rep和结构蛋白Cap的编码区,DuCV利用基因重组增加其基因组的多样性。通过对DuCV1型和2型的抗原表位以及糖基化位点分析,表明DuCV1型和DuCV2型的氨基酸的差异,可能造成DuCV1型的抗原性稍强于DuCV2型的抗原性,使其所受到的免疫压力更大。此外,经分析选择压力中的净化选择压也在DuCV的进化中起到了重要的作用。3. DuCV反向遗传学平台的建立及其病毒拯救为了构建含有遗传标记的感染性克隆,进一步研究鸭圆环病毒的致病机制。本研究利用PCR扩增鸭圆环病毒GH01株全基因组CG,将2个基因组Ic-1、IC-2顺式连接插入到pUC19载体中获得串连双拷贝重组质粒pIC-2DuCV,并通过同义突变引入酶切标记位点Xho1获得pIC-Mu2DuCV。重组质粒pIC-Mu2DuCV经过EcoRI线性化,以1OOμg/kgDNA和200μl/kg的脂质体肌肉注射10日龄DuCV阴性雏鸭。结果显示,成功构建含有分子标记XhoI的串连双拷贝重组质粒pIC-Mu2DuCV,经肌肉注射雏鸭转染组于转染21d后检出血清阳性,并通过测序经XhoI标记位点将拯救出的病毒与野生毒株进行区分。本试验构建的DuCV全长基因组头尾串联二聚体感染性克隆DNA可以转染雏鸭并增殖出带标记的DuCV病毒,为进一步研究DuCV分子特性和致病机理打下了基础。4.拯救毒株的部分生物学特性研究采用本文构建的感染性克隆技术构建对鸭圆环病毒GH01株进行病毒拯救,拯救出病毒(命名为PMDC),与亲本毒株GH01进行增殖与致病性分析。对照组PBS组的平均日增重(ADWG)明显高于拯救毒株PMDC、亲本毒株GH0l感染组,统计学差异显着(p<0.05),而PMDC组的ADWG低于GH01组,但统计学差异不显着(p>0.05)；直肠温度监测表明,各实验组感染雏鸭均无任何体温表现,其直肠温度均在41.7℃-42.2℃之间；PMDC、GH01、PBS组的临床评价分别为12.6、15.6和0,说明PMDC组和GH01组无明显差异,且同时都与阴性对照PBS组差异显着；病毒血检测发现,PBS组无病毒血症出现,GH01、PMDC组分别于攻毒后10d和15d检测到病毒血的出现；同时,GH01、PMDC组分别于15d和21d开始出现DuCV特异性抗体。经过定量检测,血清中含量最低,病毒载量在2.75 x 103-7.06×103copies/μL之间,但出现较早,分别于10DPC和15DPC就在GH01组和PMDC组中检测到。在GH01组中法氏囊于10DPC首次检测到DuCV,病毒载量为8.73×103-4.39×104 copies/mg,PMDC组于15DPC时在BF中检测到病毒核酸,其载量为4.72×1O3-8.34×1O3 copies/mg。本研究证明,拯救的毒株PMDC与亲本毒株GH01的致病性和增值能力相似,但均低于亲本毒株。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
感染性分子克隆论文参考文献
[1].张海丽.牛肠道病毒的分离鉴定及HLJ-3531株感染性分子克隆的建立[D].东北农业大学.2015
[2].张志龙.鸭圆环病毒四川毒株的进化分析及感染性分子克隆的构建[D].四川农业大学.2014
[3].朱艳梅,胡增垒,宋庆庆,段志强,顾敏.鸽源新城疫病毒JS/07/04/Pi株感染性分子克隆的构建及病毒拯救[J].病毒学报.2012
[4].李秀梅,江丽萍,郭立力,李颖,朱雅宁.鸡贫血病毒全长基因感染性分子克隆的构建[J].动物医学进展.2011
[5].张善瑞,周艳君,朱建平,童武,姜一峰.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定[J].中国预防兽医学报.2011
[6].王礞礞.猪源TTV：分子流行病学，全长序列分析及感染性分子克隆的构建[D].中国农业科学院.2011
[7].邓小芸.网状内皮组织增生症病毒LAMP检测方法及感染性分子克隆的建立[D].东北农业大学.2011
[8].云涛.DHV-Ⅰ感染性分子克隆的建立及其衍生病毒的生物学特性研究[D].西北农林科技大学.2010
[9].于可响,马秀丽,李玉峰,吴静,林树乾.1型鸭肝炎病毒CL株感染性分子克隆的构建[J].微生物学报.2009
[10].吕建亮,张永光,王永录,潘丽,刘力宽.口蹄疫病毒泛亚型O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建和感染性鉴定[J].病毒学报.2009
论文知识图
