高殿帅[1]2003年在《在成年具有神经生发功能的大鼠脑室下区形态学研究》文中认为成年哺乳动物脑侧脑室外侧壁脑室下区(subventricular zone, SVZ)由于持续有神经生发现象而表明存在有神经干细胞,明确鉴定出此处的神经干细胞对研究神经系统可塑性及修复具有重要意义。已有研究描述了SVZ 的细胞类型及其组构方式,在SVZ 和室管膜区鉴定出四种以上的细胞,但尚不能确定哪一种是成年神经干细胞。通过对该区域细胞外源性因子的探讨,发现该部位的不同分子包括分泌性因子、膜蛋白和细胞外基质成分,以及不同类型细胞之间的相互作用的微环境对维持成年神经干细胞的生存和功能起重要作用。成年大鼠脑室下区的组织学特征研究为研究位于成年哺乳动物侧脑室外侧壁脑室下区(subventricular zone, SVZ)的整体结构特征,本研究采用光镜观察半薄切片Nissl 染色、扫描电镜观察并结合形态计量分析技术,研究了侧脑室外侧壁不同部位以及内侧壁、第四脑室底壁和脊髓中央管壁的组织学形态并做了相互比较。结果显示,仅侧脑室外侧壁存在有SVZ,主要由呈未成熟特征的细胞组成;此处血管丰富。嘴侧段SVZ 明显厚于中间段和尾侧段,位于嘴侧段SVZ 部位的室管膜室腔面纤毛数明显多于其他部位。研究表明SVZ 有其独特的组织学特征,这种特征可能与成年动物的神经生发
周鑫[2]2010年在《成体神经再生及轴突病变研究》文中研究表明应激是成体海马神经再生最强有力的抑制因子之一,这已在多种哺乳动物得到证实,比如小鼠、大鼠和绒猴等。尽管应激抑制神经再生的效应众所周知,但确切机制未明。本文在成功构建大鼠大脑中动脉闭塞缺血模型的基础上,首先研究了脑缺血后应激激素皮质酮水平的变化对海马、室管膜区等主要神经生发区及脑皮质糖皮质激素受体表达、分布的影响,以及由此所引起的神经再生的改变,以揭示成体神经再生受糖皮质激素水平调控的可能机制。通过选取9-10周龄成年wistar大鼠,使用线栓法致其大脑中动脉闭塞0.5小时,脑缺血损伤诱导成功后重复腹膜下注射细胞增殖特异性标记5-溴脱氧尿苷,灌流大鼠前取心血、分离血清检测皮质酮水平,鼠脑切片应用多种免疫染色方法(单标及双标),检测GR及新生神经细胞的变化。结果发现正常大鼠血清皮质酮水平稳定,皮质、室管膜及海马仅有少量BrdU+、Nestin+和DCX+单标/双标细胞散在。MCAO术后大鼠血清皮质酮水平逐渐升高,3周达峰值,此时,大脑皮质、室管膜及海马GR+细胞数量最低；BrdU+、Nestin+和DCX+单标/双标细胞数量在脑缺血后第1、2周显着增加,MCAO术后第3周时数量明显减少,第4周时主要散布于缺血侧皮质和室管膜。假手术组大鼠血清皮质酮水平术后即明显升高,其后逐渐降低,第3周时接近正常水平；假手术后第1、2周,GR+细胞正常分布,皮质、室管膜及海马可见一定数量的BrdU+、Nestin+和DCX+单标/双标细胞存在；第3周时皮质、室管膜及海马GR+细胞数量减少,而BrdU +、Nestin+和DCX+单标/双标细胞数量较多。MCAO大鼠血清皮质酮水平逐渐升高,GR+细胞数量减少,神经再生受抑制,说明糖皮质激素受体受其激素水平负反馈调节是影响成体中枢神经再生的关键因素之一。假手术对照组大鼠皮质酮水平虽然快速升高,但GR+细胞数量及分布并未受到影响,皮质、室管膜及海马存在一定数量的神经干细胞/前体细胞及其迁移现象,提示在正常状况下,或许存在某些机制能调节或者抑制高浓度皮质酮对糖皮质激素受体及神经再生的直接影响。进一步在大鼠大脑中动脉闭塞缺血模型的基础上,应用生物素葡聚糖胺(BDA)神经示踪技术观察并研究脑缺血后时序性的神经细胞轴突病变,探讨脑缺血轴突损伤的特点。在脑缺血损伤诱导成功后分别于术后第2小时、6小时、24小时,第1-4周断头处死实验Wistar大鼠,在体神经示踪组术前72小时脑内注射BDA,离体示踪组则迅速取脑并采用死亡后脑细胞轴突转运功能恢复方法,注射BDA示踪,无脑缺血病变的正常大鼠作为在体对照及离体对照组。鼠脑标本连续冠状冰冻切片后使用ABC免疫组织化学方法显色。实验结果显示大鼠脑缺血后出现轴突病变,表现为轴突肿胀和轴突膨体,受损神经元轴突直径增加,对照组大鼠未发现轴突病变。脑缺血后大鼠脑轴突的病理改变及其程度、数量与损伤经过时间相联系,呈现出一定的时效性。文中最后分析了因眼外伤致视神经受损共23例29眼的视觉诱发电位资料,研究伤后不同时期刺激模式空间频率、P100波幅变化与视神经损伤再生修复之间的联系,探讨将视觉诱发电位技术应用于视神经损伤再生修复评估的可行性。实验确定刺激模式空间频率及P100波幅作为检测指标,以志愿合作受检者的视力表视力为参照,记录全部受检眼的实验检测结果,在此基础上,分析视神经损伤后不同时期视觉诱发电位变化与视神经再生修复之间的关系。结果发现一定的视觉刺激模式空间频率大小与视神经损伤再生修复表现出一致性,P100波幅与视力水平呈正相关。视神经损伤后前叁个月,再生修复眼视觉诱发电位检测结果呈现动态变化,如视力恢复、刺激模式空间频率减小及P100波幅增大预示视神经损伤再生修复；若视力减退、刺激模式空间频率增大(或无变化)及P100波幅减小(或无变化)则提示视神经损伤严重,无明显再生修复。
黄兵[3]2005年在《通络救脑注射液促进去皮层血管大鼠室管膜下区（SVZ）细胞增殖、分化和迁移作用的研究》文中进行了进一步梳理长期以来,普遍认为哺乳动物中枢神经系统的再生仅限于胚胎时期和出生后早期,这意味着成年动物脑和脊髓内的神经细胞只能逐渐减少而不能被更新或替代。然而,中枢神经系统细胞再生现象及具有增殖能力的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的发现向这一理论提出了挑战。室管膜下区(subventricular zone, SVZ)是产生神经干细胞(NSCs)的一个主要区域。研究表明,SVZ 的 NSCs 产生后,沿着一条高度局限的迁移通道——喙侧迁移流(rostral migratory stream, RMS)朝嗅球迁移,到达嗅球中央后,分别朝周边的颗粒细胞层和球周细胞层迁移到达各自的终点,分化形成颗粒细胞和球周细胞。在本实验中采用免疫组织化学方法研究去皮层血管促进 SVZ 神经细胞祖细胞和胶质细胞祖细胞增生,分化并形成迁移路至损伤部位参与修复的机制。1 去大脑皮层血管对成年大鼠侧脑室管膜下层神经干细胞影响及通络救脑注射液的作用 本研究采用 Wistar 成年雄性大鼠,去除大鼠左侧大脑皮层血管,应用免疫组化方法观察去皮层血管对 SVZ 神经干细胞增殖、分化和迁移的影响,以及通络救脑注射液的作用。通过连续切片的免疫组化结果显示去皮层血管后侧脑室 SVZ 的 PCNA、Vimentin、GFAP 阳性细胞均明显增多,反应增强,表象改变显着。此种损伤刺激引起了相对静止的 SVZ 神经干细胞增殖、分化,给予通络救脑注射液后促进以上各种阳性细胞表达增多、增强,提示通络救脑注射液可能通过上调内源性促神经生长因子的表达促进去皮层血管后成年大鼠 SVZ 神经干细胞增殖、分化。2 成年大鼠去皮层血管引起室管膜下层细胞增殖形成迁移流至损伤部位 本实验观察到:成年大鼠去皮层血管后不仅促进侧脑室前角 SVZ 细胞及RMS 增殖,也引起下角 SVZ 增殖并形成迁移流经胼胝体到达皮质损伤区,其中H 链起自下角上壁;L 链起自下角外侧壁,来自 RMS 的细胞成分也参与了 L 链;同时 A 链为侧脑室内侧壁。迁移流的细胞成分包括 GFAP 阳性的成熟星状胶质细胞、Vimentin 阳性的不成熟星形胶质细胞,到达损伤部位可能起再生及修复作用。3 去大脑皮层血管脑损伤区神经干细胞的表达及通络救脑注射液的作用 实验结果表明,去皮层血管后 SVZ 的 PCNA、Vimentin、GFAP 阳性细胞由
赵振强[4]2004年在《电针对大鼠局灶脑缺血/再灌注后神经干细胞增殖、迁移的影响》文中进行了进一步梳理背景：传统观念认为神经元损伤后不可能再生，这一观点近年已经受到许多研究的挑战[1]。越来越多的研究显示，成年哺乳动物脑内有两个独立的神经生发中心：侧脑室室下带(SVZ)和齿状回的颗粒下层(SGZ)。大量资料显示这两个神经生发中心保留了终生产生神经元的能力，也就是说这两个区域存在成体神经干细胞（adult neural stem cells）。脑梗塞后通常由于神经细胞的死亡引起神经功能缺失，因而脑梗塞后神经发生对已丧失的神经功能的补偿和修复显得尤其重要。人们期望神经发生具有补偿和修复中枢神经系统因中枢疾患而丢失的神经功能的能力。在成年哺乳动物脑内，神经发生在内源性神经营养因子的补充、强化环境、抗抑郁治疗、癫痫、脑梗塞等情况下增加[2-6]。在应激、兴奋性氨基酸补充、肾上腺激素等条件下下降。成年脑中枢神经系统的神经发生受到病理和病理生理机制的调节，可激活神经发生，例如脑损伤后齿状回（DG）的神经干细胞可分裂和分化为神经元[6-11]。然而，人们对在体条件下这个潜在治疗机制的启动和促进因素知之甚少。在被认为有关联的神经生长因子和神经营养素中，碱性成纤维生长因子（FGF-2）被认为是最有潜力<WP=7>的一个。在仅有FGF-2 的培养条件下，海马前体细胞即可进行分裂[12]。科学家们证实，脑损伤诸如局灶脑梗塞、癫痫后海马神经发生过程中，FGF-2 是促使其上调的关键因子[11]。针灸作为一种传统临床治疗手段，被用来治疗多种疾病。众所周知，它可以产生许多影响，诸如非药物性麻醉、调节内环境、改善微循环网络、改善脑循环等[13-15]。Kim 等[16]实验证实，针灸可以影响沙土鼠齿状回神经干细胞的增殖。许多脑损伤模型都可以使生发中心的神经发生增加，但这些区域仅仅占整个脑组织的一小部分。脑损伤后其它区域自我修复的前景怎样呢？内源性神经干细胞的自我补充提供了一个可能的解决方法。如何促进内源性神经干细胞的增殖呢？成体神经干细胞来自何方，去向何处以及中间过程是我们最为关心的问题。目的：（1）本实验通过电针局灶脑缺血/再灌注后大鼠“合谷” 穴（LI 4），结合 Brdu（5-溴脱氧尿嘧啶核苷，其阳性细胞被看成是有增殖活性的细胞）腹腔注射和巢蛋白 (Nestin，又称神经上皮干细胞样蛋白；一种神经干细胞早期标记物) 观察大鼠脑中两个主要的生发中心海马齿状回和室下带的神经干细胞增殖情况和这两个区域 FGF-2 mRNA 的表达水平，以了解电针后神经干细胞增殖增加的机制。（2）通过冠状位切片和矢状位切片相结合，“立体”观察增殖神经干细胞的迁移轨迹，了解局灶脑缺血/再灌注成体神经干细胞迁移的“时空”变化规律。<WP=8>方法：雄性 Wistar 大鼠 88 只，通过改良线栓法制备大脑中动脉局灶脑缺血 1 h/再灌注模型（MCAO 模型），随机分为梗塞组(1、7、14、21、28d 5 个时间点，每个时间点 8 只)和电针-治疗组(1、7、14、21、28d 5 个时间点，每个时间点 8 只)。假手术组和正常对照组每组 4 只。另外，在 1、6、13、20、27d 时腹腔注射 Brdu 来标记增殖的细胞。取大鼠双侧“合谷”穴作为刺激部位，用电针治疗仪作连续刺激，每次刺激时间为 15min，每天一次，7d 为一疗程。通过 TTC 染色和 HE 染色来了解脑梗塞后脑组织的病理学变化。通过免疫组织化学方法动态检测 DG 和 SVZ 区这两个神经生发中心增殖细胞 Brdu 和 Nestin 阳性细胞随时间点和干预手段不同的表达变化，同时结合冠状位切片和矢状位切片上阳性细胞的表达情况，明确神经干细胞迁移的“时空”变化规律。用原位杂交法来检测局灶脑缺血/再灌注后 SVZ 和 DG 这两个神经生发中心 FGF-2 mRNA 的表达变化情况，了解电针后神经干细胞增殖增加的机制。通过显微图像分析系统对阳性结果进行分析。结果：（1）电针刺激可以使脑梗塞灶体积明显减少。（2）免疫组织化学结果分析：在正常脑组织中和假手术组中，海马DG 区和 SVZ 区只存在少量 Brdu 阳性细胞(细胞核表达阳性反应)和 Nestin 阳性细胞（细胞浆表达阳性反应），而且排列稀疏，脑梗塞后 1d 梗塞侧海马 DG 区和 SVZ 区 Brdu 和 Nestin 阳性细胞开始增加，7d 达到高峰，与对照组相比，阳性细胞数较对照组分别<WP=9>增加约 6 倍和 7 倍（P<0.05）；14d 后开始下降，28d 后接近正常。在连续电针“合谷”穴后，电针-治疗组海马 DG 区和 SVZ 区的 Brdu 阳性和 Nestin 阳性细胞数量都在 1d 时开始增加，7d 时达到高峰，与 R7d 组相比，阳性细胞数增加约 1.5 倍（P<0.05）。在局灶脑缺血/再灌注后，梗塞灶附近出现 Nestin 阳性细胞，呈梯度分布：离梗塞灶越近，Nestin阳性细胞越多；离梗塞灶越远，Nestin 阳性细胞越少。电针“合谷”穴不仅引起 DG 区和 SVZ 区阳性细胞数量增加，而且还引起了细胞形态学变化。电针刺激 1d 后，部分室管膜细胞由原来的单层柱状上皮变成两层；电针刺激 7d 后，DG 出现双核仁细胞。以上结果显示电针使细胞增殖旺盛。通过结合冠状位切片和矢状位切片的观察，我们发现在冠状位切片上 SVZ 区神经干细胞可以沿胼胝体腹侧逐渐向缺血灶延伸；在矢状位切片上出现一个更加有趣的现象，SVZ 区
刘方舟, 杨宁, 雷志年, 曾水林, 李涛[5]2005年在《成年大鼠脑室下层细胞表达GFR-α_1的免疫组织化学研究》文中研究表明观察胶质细胞源性神经营养因子受体-α1 (GFR -α1 )在成年大鼠脑室下层(SVZ)细胞的表达,探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对SVZ细胞的作用。成年大鼠SVZ组织冰冻切片,采用GFR -α1 结合5- 溴脱氧尿苷(BrdU)的免疫组织化学单标记与双标记方法,对成年大鼠SVZ进行观察。在成年大鼠SVZ可见GFR- α1 阳性细胞、BrdU阳性细胞和GFR- α1 /BrdU双标记细胞,且叁种阳性细胞的分布趋势相似。结果提示GDNF可能参与调节成年哺乳动物脑内SVZ细胞的增殖、分化和迁移。
隋立森[6]2008年在《大鼠颅脑损伤后神经干细胞原位诱导、增殖分化及Notch信号通路调控机制的实验研究》文中研究表明研究背景随着社会的发展,创伤性疾病的发病率呈不断上升的趋势,颅脑损伤的发病率也逐年增高,而有关颅脑损伤后的修复机制尚不完全清楚。大量研究资料显示,对于大多数颅脑损伤患者而言,神经元死亡、神经功能的缺失不可避免。神经元功能丧失后,聚集于大脑内静息状态下的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)将被激活。神经干细胞是能自我更新,具有分化成神经元、神经胶质细胞的一类细胞群,可参与修复缺损的神经功能。大量的体内外实验已经证实,成年中枢神经系统(central nerve system,CNS)内有NSCs的存在,这些细胞在一定条件下可以进行增殖、迁移和分化并且发挥一定的功能。但对颅脑损伤后内源性NSCs原位诱导、增殖、分化、迁移及其规律,以及相关调节机制研究尚未完全清楚,研究结果亦各不一致;而以往已证实的Notch信号传导途径在NSCs增殖、分化调控机制中所起的重要作用,是否也调控着颅脑损伤后NSCs的原位诱导、增殖、分化及迁移等,目前尚不清楚。为此,本研究拟通过建立的Feeney's自由落体实验模型,并通过损伤后大鼠神经行为学评分,从大体及病理学角度,在细胞水平上对损伤模型进行判定;利用免疫组织化学及免疫荧光化学方法研究颅脑损伤后自体NSCs原位增殖、迁移和分化的变化,从而揭示大鼠脑损伤后自体NSCs在颅脑组织修复过程中原位增殖、分化规律;并联合应用免疫学荧光组织化学及蛋白表达检测法观察颅脑损伤后Notch信号通路中Notch1蛋白表达的动态变化,分析该信号蛋白与自体NSCs原位增殖、分化的关系。探讨与NSCs原位增殖分化相关的可能调节机制,为未来临床利用自体NSCs原位诱导、增殖、分化规律促进颅脑损伤后神经功能恢复与重建提供理论依据、奠定重要的实验基础。第一部分大鼠颅脑损伤模型的建立及鉴定目的:通过Feeney's自由落体实验方法,建立一个便于观察及施加处理因素、控制性好、重复性好,可分级并能反映人类脑损伤特点的颅脑损伤实验动物模型;通过损伤后大鼠神经行为学评分及病理学检测,为进一步研究受损伤脑内的NSCs原位动员规律奠定模型基础。方法:实验采用Feeney's自由落体硬膜外撞击方法,致大鼠中型颅脑损伤。致伤冲击力为600g.cm;术后按不同的实验分组时间处死动物,于损伤后1～14d连续进行神经行为学观察,测定其神经行为学评分(参照Wayne Clark方法);并从大体及显微镜下观察对照组、假手术组及实验组损伤灶与正常皮层之间的形态差异,以重复测量数据的方差分析统计学方法分析实验结果,判定中型颅脑损伤大鼠模型的成功建立,为下一步颅脑损伤后不同时期的内源性NSCs自身动员、体内增殖分化等研究提供模型保障。结果:实验损伤24小时组同假手术组及对照组的神经行为学评分分别为20.3±3.8、4.8±2.1和2.0±0.8,有显着性差异(F=120.478;p＜0.001);各组之间的组织形态结构有明显差异,实验损伤各组主要表现为低倍镜下见局部组织碎裂、片状出血,损伤灶周围形成明显的水肿带,血管受压变形;高倍镜下见损伤灶周围胶质细胞及神经细胞明显肿胀,细胞核偏移,微血管外间隙扩大,证实了颅脑损伤实验动物模型的成功建立。结论:通过改进的Feeney's自由落体硬膜外撞击实验,建立了大鼠颅脑损伤模型,并通过神经学行为及组织学变化对模型进行进一步鉴定,提示所建立的大鼠颅脑损伤模型完全达到实验要求,为下一步颅脑损伤后不同时期内源性NSCs自身动员、体内增殖分化规律等研究提供了脑损伤模型依托和保障。第二部分颅脑损伤后神经干细胞原位诱导、增殖分化的实验研究目的:通过建立的颅脑损伤动物模型,以Nestin/NSE、Nestin/GFAP、BrdU/NSE和BrdU/GFAP双标阳性细胞为主要评估指标,利用免疫组织化学及免疫荧光化学方法研究损伤后不同时间点的伤侧脑室下区(Subventricular zone,SVZ)、海马齿状回(Dentate gyrus,DG)区及损伤灶周围的NSCs原位诱导、增殖、分化及迁移的变化规律,为自体原位动员NSCs促进颅脑损伤后神经功能恢复与重建提供可借鉴的理论依据。方法:取对照组、假手术组和实验组不同时间伤侧DG、SVZ区及损伤灶周围的脑组织切片,以巢蛋白(Nestin)和溴脱氧尿苷(Bromodeoxy uridine,BrdU)为NSCs的标记蛋白,采用免疫组织化学方法分别以anti-Nestin、anti-BrdU不同蛋白单抗进行免疫组化染色;以神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific endase,NSE)和胶质原性纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)分别作为神经元和神经胶质细胞的特异标志蛋白,采用免疫荧光化学方法分别进行Nestin/NSE、Nestin/OFAP、BrdU/NSE和BrdU/GFAP双标蛋白抗体免疫荧光染色,以检测脑损伤后、分化自NSCs的神经元和神经胶质细胞;置光镜和激光共聚焦显微镜下观察,计数脑损伤后不同时间点伤侧DG、SVZ区和损伤灶周围皮层的双标阳性细胞数。以重复测量数据和析因的方差分析统计学方法分析实验结果。结果:激光共聚焦显微镜下,各实验组在伤侧DG、SVZ区均出现不同染色强度的Nestin/NSE、Nestin/GFAP、BrdU/NSE和BrdU/GFAP双标抗体细胞染色,Nestin阳性染色主要位于胞质,BrdU主要位于位于胞核。在TBI后的伤侧DG、SVZ、损伤灶周围神经干细胞增殖分裂,均以伤后第3天时最明显,伤侧DG区Nestin、BrdU标记阳性细胞较对照组标记阳性细胞明显升高,分别达到对照组的2～7倍左右,其中以BrdU标记的增殖分裂阳性细胞升高最显着,高于对照组7倍多,提示DG区是神经干细胞增殖分化的重要生发中心,在TBI后,动员了伤侧的DG中神经干细胞,使其增殖分化,并且以增殖分裂细胞成分为主;伤侧SVZ区Nestin、BrdU标记阳性细胞较对照标记阳性细胞明显升高,均达到高于对照组2倍左右,标记阳性细胞数量远多于伤侧SVZ区,其中以Nestin及BrdU标记的代表神经干细胞及增殖分裂阳性细胞升高趋势相同,提示SVZ区是神经干细胞增殖分化的另一生发中心;损伤灶Nestin、BrdU标记阳性细胞较对照组标记阳性细胞明显升高,大部分以增殖细胞标记物BrdU标记阳性细胞为主,且以BrdU/GFAP双标阳性细胞占大部分比例,到伤后第14天时,下降至接近正常水平,统计学上有显着差异(p＜0.001),提示脑损伤后一定时间内,分化自NSCs的胶质细胞可能参与了脑损伤修复过程中的胶质瘢痕形成。结论:本实验条件下,在颅脑损伤后的伤侧DG、SVZ区及损伤灶周围组织Nestin/NSE、Nestin/GFAP、BrdU/NSE和BrdU/GFAP双标阳性细胞均大量表达,均在伤后第3天达到峰值,说明伤侧DG、SVZ区组织中有大量的NSCs增殖分化,增殖分化高峰在伤后第3天。其中,伤后第3天伤侧DG区BrdU/NSE和BrdU/GFAP双标的增殖阳性细胞升高倍数最显着,达对照组7倍多,提示TBI动员了伤侧的DG中神经干细胞,使其增殖分裂,并且以增殖细胞为主;而伤后第3天的伤侧SVZ区Nestin/NSE、Nestin/GFAP、BrdU/NSE和BrdU/GFAP双标阳性细胞的基数明显多于伤侧DG区阳性细胞,伤侧SVZ区神经干细胞及增殖细胞阳性增高趋势一致,提示TBI有效动员了伤侧SVZ中的神经干细胞,使其发生明显的增殖并分化;伤后第3天损伤灶周围BrdU/NSE和BrdU/GFAP双标的增殖阳性细胞升高亦很显着,尤以BrdU/GFAP双标阳性细胞占大部分比例,达对照组6倍多,提示TBI诱导NSCs增殖分化成GFAP标记阳性的胶质细胞为主,并可能参与胶质瘢痕的形成。实验各组到伤后第14天时,Nestin/NSE、Nestin/GFAP、BrdU/NSE和BrdU/GFAP双标阳性细胞数下降至接近正常水平。上述结果提示,DG、SVZ区是NSCs增殖分化的重要的生发中心,且SVZ区是NSCs最重要的生发中心,提示TBI后损伤灶周围以GFAP标记阳性的胶质细胞为主,并与损伤灶周围胶质瘢痕形成密切相关。第叁部分大鼠颅脑损伤后神经干细胞原位诱导的Notch信号传导机制研究目的:本实验部分利用免疫学荧光组织化学和蛋白免疫印迹方法测定颅脑损伤后脑室下区及海马的Notch1蛋白基因表达动态变化,并以Notch1/Nestin双标抗体为主要指标,分析Notch1蛋白基因与自体NSCs原位增殖、分化的可能关系。初步探讨与NSCs增殖分化相关的Notch信号通路在NSCs原位诱导中的调控机制,为自体NSCs原位激活治疗颅脑损伤提供实验依据。方法:采用免疫荧光化学及蛋白免疫印迹方法,分别对照组、假手术组及实验各时间点伤侧的DG、SVZ区Notch1/Nestin双标抗体阳性细胞数、Notch1蛋白基因表达动态变化进行定性、定量检测。首先,取实验各组伤侧DG、SVZ区的不同脑组织切片,行Notch1/Nestin免疫荧光双标染色,激光共聚焦显微镜下观察,计数伤侧DG、SVZ区的Notch1/Nestin双标抗体阳性细胞数;然后用Western-blot方法检测实验各组Notch1蛋白基因表达动态变化情况。结果采用析因的方差分析统计学方法分析实验结果。结果:免疫荧光化学结果显示,在TBI后的伤侧DG、SVZ区Notch1/Nestin双标阳性染色细胞,均以伤后第1天时升高最明显,达对照组2～3倍左右;伤后第7天,Notch1/Nestin双标阳性染色细胞仍维持较高水平;到伤后第14天时,下降至接近正常水平,统计学上有显着差异(p＜0.001);Western Blot蛋白免疫印迹方法显示,TBI后的各实验组大鼠伤侧DG、SVZ区组织中Notch1蛋白基因均呈免疫反应阳性,在相对分子量约110KD(Notch1的NICD)处出现阳性条带,在大鼠TBI后第1天时,其海马组织及脑室下区组织Notch1蛋白表达最明显,达峰值,TBI后第7天,Notch1蛋白表达仍维持较高水平。结论:本实验结果提示,TBI后的伤侧DG、SVZ区Notch1/Nestin双标阳性细胞及Notch1蛋白基因表达均在伤后第1天明显上调,达峰值;伤后7天仍维持在较高水平。结合第二部分实验NSCs增殖分化结果,提示TBI后激活Notch信号,在伤后第1天信号活性最强,Notch信号通路激活促进NSCs增殖,在伤后第3天达高峰;伤后第7天Notch信号有所减弱,NSCs增殖减慢;伤后第14天Notch1表达接近正常水平,NSCs增殖接近正常水平。提示TBI激活了Notch信号通路并促进脑内NSCs的原位增殖,参与了脑损伤后NSCs发挥功能修复作用的调控过程。
陈前伟[7]2017年在《大鼠继发性脑室出血损伤机制及辛伐他汀干预研究》文中进行了进一步梳理脑室出血(intraventricular hemorrhage,IVH)是指脑室系统周围或脑室内出血,常继发于物理性脑创伤、高血压脑出血和动脉瘤破裂蛛网膜下腔出血等疾病。IVH是脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)患者的最常见同时也是最严重并发症之一,与ICH患者高死亡率和高致残率密切相关,严重危害着公众健康。既往研究报道,约40%的成人自发性ICH患者会合并IVH的出现,这部分病人罹患脑积水的几率高达51%-89%。新近临床研究已经证实,IVH及其诱发的继发性脑积水是导致ICH患者预后的两项独立危险因素,因此,如何缓解IVH后脑积水已经逐渐成为ICH救治的重要干预靶点。然而,既往IVH动物模型仅仅展示出了原发性IVH的特点,而临床IVH绝大多数为继发性,尤其是继发于脑出血破入脑室形成脑室积血。一些回顾性临床分析提示,继发性IVH出现远期分流依赖的脑积水的几率要明显高于原发性IVH,但这一临床现象尚未得到证实。基于此,课题组在国际上首次建立了继发性IVH(脑出血破入脑室)大鼠模型,并对模型的可靠性、稳定性和可重复性进行了评价;此外,我们还比较了继发性IVH大鼠模型和原发性IVH大鼠模型脑损伤和脑积水发生情况,进一步验证上述临床现象。越来越多的研究证据指出血液的分解代谢产物-铁离子可能是导致出血后脑积水和脑损伤的关键因素。据此我们推测:ICH破入脑室会引起脑-脑脊液屏障结构完整性破坏,脑实质内的血肿可能成为持续的铁离子来源,通过屏障缺口不断的浸入到脑室系统,造成脑实质和脑脊液铁离子蓄积,最终加重脑积水和脑损伤。他汀类药物,即3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A(3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A,HMG-Co A)还原酶抑制剂,是广泛使用的降脂药物,临床上主要用于心脑血管疾病的一级和二级预防。大量研究报道,他汀类药物除了具有较好的降低胆固醇的功效,还发挥了保护BBB、免疫调节、抗氧化和促血管再生等多种中枢神经保护多效性。近年来,几项大型回顾性队列研究结果显示:他汀类药物的使用能够有效地减少ICH患者死亡率,改善远期预后,可能具有良好的临床应用前景。然而,国际上尚无权威的随机、对照临床试验验证上述功效,尤其是在ICH合并IVH的患者中。辛伐他汀作为一种发酵来源的天然他汀类药物,具有高度的亲脂性和血脑屏障透过性。新近研究提示辛伐他汀可能有促进血肿吸收的功效。但相关的机制不清,辛伐他汀对继发性IVH的潜在治疗效果有待进一步的观察。因此,基于上述发现,我们推测:辛伐他汀有望通过加速脑内血肿清除缓解继发性IVH后脑损伤。综上,本研究主要从以下叁部分实验内容进行展开:首先,建立并评估继发性IVH大鼠模型的稳定性、可靠性和可重复性。其次,将原发性IVH大鼠模型与继发性IVH大鼠模型进行比较,观察继发性IVH是否会出现更为严重的脑损伤和脑积水,以验证上述临床观点;同时进一步探讨脑内血肿在继发性IVH后脑积水发生发展中的作用。最后,验证早期系统性辛伐他汀治疗能否加速脑内血肿清除缓解继发性IVH后脑积水,改善神经功能障碍。一、大鼠继发性脑室出血新模型的建立和评估目的自发性脑出血合并脑室出血是一种严重的临床疾病,但缺乏相应的研究。到目前为止,尚无满意、有效的动物模型能够模拟脑出血合并脑室出血的临床特点。鉴于此,本实验拟建立实验性脑出血合并脑室出血大鼠模型,同时对出血后脑积水以及血肿周围组织损伤进行检测以评估模型的稳定性和可靠性。方法在课题组前期建立的IVH大鼠实验模型基础上,通过调整血液注射坐标,利用立体定位仪将200μl自体血缓慢注入大鼠右侧纹状体区(坐标为:前囟后0.2mm,旁开2.2mm,深5.0mm)。24h后,采用组织形态学等方法检测血肿及血肿周围组织损伤。损伤后第4周,利用小动物MRI观察脑室扩张情况、脑组织丢失情况、海马体积大小以及大脑皮层厚度;通过Morris水迷宫实验评价大鼠神经认知功能。结果1.自体血纹状体注射后,大鼠形成了稳定可重复的脑内血肿和脑室扩张,较好的模拟了ICH合并破入脑室患者的临床特点;2.模型大鼠在表现出了急性期的脑水肿、BBB破坏和典型的血肿周围脑组织损伤的病理特征;3.术后第4周时,T2WI扫描观察到了显着的脑积水和脑组织丢失,Morris水迷宫测试揭示了大鼠出现了严重的学习、记忆功能障碍。结论该模型成功地再现了ICH合并IVH患者的临床病理生理特点,可用于对出血后慢性脑积水及血肿周围脑组织损伤发生的病理生理机制的进一步探索。二、大鼠继发性与原发性脑室出血模型脑损伤比较及机制研究目的有研究报道称,脑出血合并脑室出血的患者发生脑积水的几率较高,会进一步加重脑出血患者的不良预后。但是,介导上述临床现象的对应机制仍然没有得到合理的解答。鉴于此,本实验拟通过在体动物实验探讨继发性脑室出血后脑积水发生发展机理,初步阐明上述临床现象的潜在机制。方法本部分实验首先通过自体血注射法建立了脑出血合并脑室出血大鼠模型和原发性脑室出血大鼠模型两种实验性脑室出血动物模型。然后,分别采用了小动物磁共振扫描成像、Morris水迷宫实验、脑含水量检测、伊文思蓝渗出检测、免疫组化染色、免疫蛋白印迹、铁离子定量检测和电镜等技术和手段对两组模型大鼠进行了评价和比较。最后,通过给予去铁敏(一种铁螯合剂)治疗初步阐明铁离子在继发性脑室出血后脑积水发生中的作用。结果1.尽管两组脑室出血模型接受了同等剂量的脑组织血液注射,与原发性脑室出血组相比,继发性脑室出血大鼠出现了更为严重的脑室扩张、室管膜纤毛损伤和铁超载,以及更加异常的急性脑损伤和神经功能障碍;2.系统性去铁敏治疗更加显着、有效地缓解了继发性脑室出血组大鼠所并发的脑积水。结论我们的研究结果提示,继发性的脑室出血比原发性的脑室出血损伤更严重,主要表现为更加典型的慢性脑积水和脑铁超载。脑内血肿可能通过加剧铁离子持续性的蓄积影响了继发性脑室出血后慢性脑积水的进展。叁、辛伐他汀对大鼠继发性脑室出血后脑损伤的干预效应和机制研究目的我们在第二部分研究中发现了,脑内血肿通过加剧铁超载诱发室管膜纤毛损害,进而加重脑室出血脑积水。因此,我们推测:加速脑内血肿自吸收可能成为治疗脑室出血的研究新靶点。新近文献提示,辛伐他汀可能具有加速血肿吸收的功效,因此,本实验拟观察辛伐他汀对脑室出血大鼠的治疗效果。方法采用自体血注射法建立脑出血合并脑室出血SD大鼠实验模型。模型动物在术后第1d随机接受辛伐他汀或溶剂治疗,然后连续给药1周。利用小动物磁共振成像技术于术后1天、3天、7天、14天和28天动态观察并计算大鼠侧脑室体积。期间,在术后1-7天和术后23-28天分别进行大鼠运动功能和神经认知功能的评估。然后剥离脑组织样本,先后进行铁沉积检测、铁相关蛋白检测以及室管膜损伤检测等。最后,在脑室出血接受连续3d的辛伐他汀治疗后,采用免疫蛋白印迹和免疫荧光技术检测清道夫受体CD36(能够加速细胞吞噬)在脑组织中的表达与分布;同时,采用荧光素标记红细胞脑内注射模拟脑出血,分别给予生理盐水、辛伐他汀、辛伐他汀+CD36中和抗体治疗,3d后采用免疫荧光双标技术观察和分析小胶质细胞对红细胞的吞噬情况。结果1.辛伐他汀显着升高了血肿吸收速度,减小了脑室体积,并有效缓解了脑室出血大鼠的神经功能障碍;2.与对照组相比,辛伐他汀组大鼠脑铁蓄积更轻、室管膜纤毛存活率更高;3.辛伐他汀治疗后上调了血肿周围小胶质细胞CD36表达,并促进了小胶质细胞对红细胞的吞噬。结论辛伐他汀有效增强了脑室出血后脑内血肿的吸收,缓解了脑积水,同时促进了大鼠神经功能修复;其可能机制是通过上调小胶质细胞CD36加速红细胞吞噬实现。上述的研究结果提示,住院早期服用辛伐他汀有望成为脑室出血患者治疗的新方法。
江山[8]2006年在《行为训练对大鼠海马梗死后齿状回区神经干细胞增殖、迁移能力的影响》文中研究指明脑缺血是危害人类健康的常见病、多发病，患者常有相应的运动、感知觉及学习记忆功能障碍。它对中枢神经系统的损伤源于血流中断所引起的神经细胞死亡。随着1992年Reynolds从成鼠纹状体内分离并培养出神经干细胞，人们发现多潜能的神经干细胞不仅终生存在于各类哺乳动物包括人的中枢神经系统内，而且成体脑内也存在持续的神经发生。研究发现，各种攻击包括脑缺血能刺激内源性神经干细胞在神经生发区或正常情况下不存在神经发生的脑区增殖，并迁移到损伤区，分化为神经元，这也是脑可塑性的重要基础。这些发现使人们利用神经干细胞治疗脑缺血性疾病成为可能。但内源性神经干细胞的数量较小，同时它的增殖、迁移分化过程受到各种因素的制约，故如何能够激活内源性神经干细胞已经成为目前研究的重点，也是神经干细胞用于治疗脑缺血性疾病的难点之一。 海马是研究脑损伤的重要脑区，在全脑缺血时经常累及。海马损伤所引起的学习记忆能力障碍在大脑缺血损伤所引起的各种功能障碍中最为持久，也最难恢复。同时，海马是一个具有可塑性的脑区，海马的齿状回区是成体脑内主要的干细胞池。故本研究应用光化学法制作大鼠海马梗死模型，以观
万凤[9]2017年在《基于干细胞巢调控的人参皂苷对缺血/再灌注神经干细胞增殖、分化的作用及其机制》文中认为目的研究人参皂苷通过作用于神经干细胞巢(NSCs niche)内的神经干细胞(NSCs)、星形胶质细胞(AC)和脑微血管内皮细胞(EC),对缺血/再灌注(OGD/R)后的NSCs增殖、分化的影响以及HIF-1α-VEGF信号通路的调节机制。方法1孕15-17d的SD大鼠,体外分离培养胎鼠海马NSCs,采用免疫荧光染色法对NSCs特异性标志物Nestin进行鉴定,NSCs增殖标记物BrdU进行增殖鉴定,神经元祖细胞特异性标记物Tuj-1及星形胶质细胞的祖细胞特异性标记物Vimentin对NSCs进行分化鉴定。新生1-3d SD大鼠,体外分离培养星形胶质细胞,采用免疫荧光染色法对星形胶质细胞的特异性标志物GFAP进行鉴定。新生1-3d SD大鼠,体外分离培养脑微血管内皮细胞,采用免疫荧光染色法对脑微血管内皮细胞的特异性标志物Factor Ⅷ进行鉴定。2 MTS法测定人参皂苷促进NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞增殖的最佳剂量及最佳给药时间点。3携带GFP基因的慢病毒转染NSCs,观察GPF的阳性表达率来确定NSCs的转染率,筛选出慢病毒转染NSCs的最佳转染指数MOI值及最佳转染时间。按照课题组先前的造模方法,采用氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型模拟脑缺血/再灌注损伤,以缺氧缺糖4h为NSCs损伤的最高时间点。Western Blot检测慢病毒转染后NSCs核内HIF-1α蛋白表达,观察转染后HIF-1α蛋白表达情况,并计算出HIF-1α蛋白沉默率;免疫荧光及细胞核染色检测HIF-1α基因在NSCs的表达位置情况;免疫荧光染色法对转染后NSCs进行鉴定,并且检测转染后NSCs的增殖、分化情况。4实验分为6组,设立NSCs正常组、NSCs模型组、NSCs人参皂苷组(1.OOμg/ml)、慢病毒转染的NSCs(LV-NSCs)正常组、LV-NSCs模型组、LV-NSCs人参皂苷组(1.OOμg/mL),OGD/R模型模拟脑缺血/再灌注损伤,于OGD模型4h后分别复氧2h、4h和6h叁个时间点,分别收集处理NSCs和培养液,免疫荧光染色技术分析NSCs的增殖、分化情况,Western Blot分析NSCs核内HIF-1α蛋白表达情况,ELISA检测培养液VEGF含量。5采用Transwell共培养装置,将NSCs、LV-NSCs分别与星形胶质细胞共培养,实验分为6组,设立NSCs/AC正常组、NSCs/AC模型组、NSCs/AC人参皂苷组(12.50μg/mL)、LV-NSCs/AC 正常组、LV-NSCs/AC 模型组、LV-NSCs/AC 人参皂苷组(12.50μg/mL),采用OGD/R模型模拟脑缺血/再灌注损伤,于OGD模型4h后分别复氧2h、4h和6h叁个时间点,分别收集处理NSCs、星形胶质细胞和共培养液,MTS检测各组NSCs存活率,免疫荧光双标染色分析NSCs的增殖和分化情况,Western Blot分析星形胶质细胞核内HIF-1α蛋白表达情况,ELISA检测共培养液VEGF含量。6采用Transwell共培养装置,将NSCs、LV-NSCs分别与脑微血管内皮细胞共培养,实验分为6组,设立NSCs/EC正常组、NSCs/EC模型组、NSCs/EC人参皂苷组(12.50μg/mL)、LV-NSCs/EC 正常组、LV-NSCs/EC 模型组、LV-NSCs/EC 人参皂苷组(12.50μg/mL),采用OGD/R模型模拟脑缺血/再灌注损伤,于OGD模型4h后分别复氧2h、4h和6h叁个时间点,分别收集处理NSCs、脑微血管内皮细胞和共培养液,MTS检测各组NSCs存活率,免疫荧光双标染色分析NSCs的增殖和分化情况,Western Blot分析脑微血管内皮细胞核内HIF-1α蛋白表达情况,ELISA检测共培养液VEGF含量。结果1 胎鼠海马NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞的分离培养和鉴定体外成功分离培养胎鼠海马NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞,经鉴定,其纯度达95%以上。2人参皂苷促进NSCs、胎鼠海马NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞增殖的最佳剂量和最佳给药时间点①人参皂苷促进NSCs增殖的最佳剂量为1.00μg/mL,促进NSCs增殖的最佳给药时间点为24h。②人参皂苷促进星形胶质细胞增殖的最佳剂量为12.50μg/mL,促进星形胶质细胞增殖的最佳给药时间点为72h。③人参皂苷促进脑微血管内皮细胞增殖的最佳剂量为12.50μg/mL,促进脑微血管内皮细胞增殖的最佳给药时间点为24h。3慢病毒转染NSCs筛选最佳MOI值及最佳转染时间成功采用慢病毒转染NSCs,慢病毒转染NSCs的最佳MOI值为10,最佳转染时间为144h。与对照组相比,NSCs转染率为90.47%(P<0.01)。4 Western Blot检测OGD后慢病毒转染NSCs核内HIF-1α蛋白表达情况与NSCs正常组和转染阴性对照组相比,NSCs转染组HIF-1α蛋白表达显著降低(P<0.01)。经计算,HIF-1α 沉默率为 88.5%。5免疫荧光及细胞核染色检测OGD后HIF-1α在NSCs内的表达情况在缺氧条件下,NSCs正常组显示HIF-1α能够在NSCs核内表达;NSCs转染组显示GFP绿色荧光能够在细胞核内表达,并且HIF-1α不表达,表明慢病毒能够成功转染NSCs,并使HIF-1α表达沉默。6免疫荧光染色鉴定慢病毒转染NSCs后的Nestin及NSCs增殖、分化情况慢病毒转染后的NSCs均表达Nestin、BrdU、Tuj-1、Vimentin阳性,慢病毒转染后的NSCs仍能够增殖,并且分化为神经元的祖细胞和星形胶质细胞的祖细胞,但其增殖、分化能力明显降低。7免疫荧光染色技术检测OGD后NSCs增殖和分化情况①NSCs各组:NSCs正常组、NSCs模型组和NSCs人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1及Vimentin阳性表达;复氧2h、4h和6h,与NSCs正常组相比,NSCs模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与NSCs模型组比较,NSCs人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。②LV-NSCs各组:LV-NSCs正常组、LV-NSCs模型组和LV-NSCs人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1及Vimentin阳性表达;复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs正常组相比,LV-NSCs模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与LV-NSCs模型组比较,LV-NSCs人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数少量增加,差异无统计学意义。8 Western Blot检测OGD后各组NSCs核中HIF-1α蛋白的表达①NSCs各组:NSCs正常组细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与NSCs正常组相比,NSCs模型组HIF-1α蛋白含量增多(P<0.01);与NSCs模型组相比,NSCs人参皂苷组HIF-1α蛋白含量增多(P<0.01)。②LV-NSCs各组:LV-NSCs正常组细胞核中的HIF-1α蛋白少量表达或几乎不表达;与LV-NSCs正常组相比,LV-NSCs模型组HIF-1α蛋白表达少量增加或不增加,差异无统计学意义;与LV-NSCs模型组相比,LV-NSCs人参皂苷组HIF-1α蛋白表达少量增加或不增加,差异无统计学意义。③与NSCs人参皂苷组相比,LV-NSCs人参皂苷组细胞核中的HIF-1α蛋白表达明显减少(P<0.01)。9 ELISA检测OGD后各组细胞培养上清液中VEGF的含量①NSCs各组:NSCs正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与NSCs正常组相比,NSCs模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.01);与NSCs模型组相比,NSCs人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.01)。②LV-NSCs各组:LV-NSCs正常组细胞培养液中VEGF含量很低;与N LV-NSCs正常组相比,LV-NSCs模型组细胞培养液中VEGF含量少量增加或几乎不增加,差异无统计学意义;与LV-NSCs模型组相比,LV-NSCs人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量少量增加或几乎不增加,差异无统计学意义。③与NSCs人参皂苷组相比,LV-NSCs人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显减少(P<0.01)。10 MTS检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的各组NSCs存活率①NSCs/AC各组:分别复氧2h、4h和6h,与NSCs/AC正常组相比,NSCs/AC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与NSCs/AC模型组比较,NSCs/AC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。②LV-NSCs/AC各组:分别复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与LV-NSCs/AC模型组比较,LV-NSCs/AC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。11免疫荧光双标染色检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的NSCs增殖、分化情况①NSCs/AC各组:NSCs/AC正常组、NSCs/AC模型组和NSCs/AC人参皂苷组均有 Nestin、BrdU、Tuj-1 及 Vimentin 阳性表达;复氧 2h、4h 和 6h,与 NSCs/AC 正常组相比,NSCs/AC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与NSCs/AC模型组比较,NSCs/AC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。②LV-NSCs/AC 各组:LV-NSCs/AC 正常组、LV-NSCs/AC 模型组和 LV-NSCs/AC 人参皂苷组均有 Nestin、BrdU、Tuj-1 及 Vimentin 阳性表达;复氧 2h、4h 和 6h,与 LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与LV-NSCs/AC模型组比较,LV-NSCs/AC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。12 Western Blot检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的各组星形胶质细胞核中HIF-1α蛋白的表达①NSCs/AC各组:NSCs/AC正常组星形胶质细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与NSCs/AC正常组相比,NSCs/AC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.01);与NSCs/AC模型组相比,NSCs/AC人参皂苷组HIF-1α蛋白表达明显增多(P<0.01)。②LV-NSCs/AC:LV-NSCs/AC正常组星形胶质细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.01);与LV-NSCs/AC模型组相比,LV-NSCs/AC人参皂苷组HIF-1α蛋白表达明显增多(P<0.01)。13 ELISA检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的各组细胞培养上清液中VEGF的含量①NSCs/AC各组:NSCs/AC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与NSCs/AC正常组相比,NSCs/AC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05);与NSCs/AC模型组相比,NSCs/AC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。②LV-NSCs/AC各组:LV-NSCs/AC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05);与LV-NSCs/AC模型组相比,LV-NSCs/AC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。14 MTS检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的各组NSCs存活率①NSCs/EC各组:分别复氧2h、4h和6h,与NSCs/EC正常组相比,NSCs/EC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与NSCs/EC模型组比较,NSCs/EC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。②LV-NSCs/EC各组:分别复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与LV-NSCs/EC模型组比较,LV-NSCs/EC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。15免疫荧光双标染色检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的NSCs增殖、分化情况①NSCs/EC各组:NSCs/EC正常组、NSCs/EC模型组和NSCs/EC人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1、Vimentin 阳性表达;分别复氧 2h、4h 和 6h,与 NSCs/EC 正常组相比,NSCs/EC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与NSCs/EC模型组比较,NSCs/EC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。②LV-NSCs/EC各组:正常组、模型组和人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1、Vimentin阳性表达;分别复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与LV-NSCs/EC模型组比较,LV-NSCs/EC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。16 Western Blot检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的各组脑微血管内皮细胞核中HIF-1α蛋白的表达①NSCs/EC各组:NSCs/EC正常组脑微血管内皮细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与NSCs/EC正常组相比,NSCs/EC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.05,P<0.01);与NSCs/EC模型组相比,NSCs/EC人参皂苷组HIF-1α蛋白表达明显增多(P<0.05,P<0.01)。②LV-NSCs/EC各组:LV-NSCs/EC正常组脑微血管内皮细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.05,P<0.01);与 LV-NSCs/EC 模型组相比,LV-NSCs/EC 人参皂苷组 HIF-1α 蛋白表达明显增多(P<0.05,P<0.01)。17 ELISA检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的各组细胞培养上清液中VEGF的含量①NSCs/EC各组:NSCs/EC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与NSCs/EC正常组相比,NSCs/EC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05,P<0.01);与NSCs/EC模型组相比,NSCs/EC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。②LV-NSCs/EC各组:LV-NSCs/EC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05,P<0.01);与LV-NSCs/EC模型组相比,LV-NSCs/EC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。结论人参皂苷通过调节NSCs niche内的NSCs、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞,通过调控HIF-1α-VEGF信号通路,以自分泌和旁分泌的共同方式,促进缺血/再灌注后NSCs增殖,并且诱导NSCs分化为神经元和星形胶质细胞的祖细胞。
詹焱[10]2006年在《雪旺细胞与神经干细胞共培养共移植对阿尔茨海默病的治疗作用》文中进行了进一步梳理关于阿尔茨海默病(AD)的治疗目前尚无行之有效的方法，近年来干细胞治疗作为一种新兴的治疗方法，正逐步被人们认识。尤其是在骨髓干细胞移植治疗血液系统疾病的治疗上已取得了相当可喜的疗效后，细胞治疗已经成为国内外学者关注的焦点。目前关于AD的发病机理尚无定论，近年来已有学者发现在AD患者的脑内尤其是海马内的异常改变：如星形胶质细胞的增多、细胞色素C含量升高、细胞凋亡的存在等，尽管其具体机制尚不十分清楚，但为AD的诊断和治疗提供了有益的帮助。 我们分别从胚胎大鼠的海马内获取神经干细胞(NSCs)、新生大鼠坐骨神经内获取雪旺细胞(SCs)，进行体外和体内实验。在体外对NSCs进行单独培养以及与SCs的共培养。我们发现：NSCs与SCs共培养后NSCs生长、分化、增殖速度明显优于NSCs的单独培养组。体内实验是将NSCs、NSCs与SCs、生理盐水分别注入AD模型大鼠脑内，同正常组共四组从行为学、病理学、免疫组化、分子生物学等不同方面进行比较观察。我们发现：NSCs与SCs共移植组的AD模型大鼠上述实验指标无论是学习记忆能力、海马区细胞凋亡情况、胶质纤维酸性蛋白、S-100β、细胞色素C等改变均最接近于正常组，AD模型大鼠的痴呆症状恢复的最好。以上实验结果证明了SCs对NSCs的生长发育有促进作用。我们认为可能和SCs分泌的神经生长因子、细胞外基质等多种神经营养成分有关，它们为NSCs的生存提供了一个适宜生长条件，从而使NSCs的生长增殖达到一个相对良好的阶段，提高了的NSCs的存活、增殖和分化，其具体作用机制尚需进一步探讨。希望通过本实验可以为NSCs脑内移植后更好的存活提供一个新的方法，同时为AD的治疗提供了一个较为有效的治疗方法。
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[10]. 雪旺细胞与神经干细胞共培养共移植对阿尔茨海默病的治疗作用[D]. 詹焱. 吉林大学. 2006
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