铁线蕨中氧甲基转移酶基因克隆与功能鉴定

铁线蕨中氧甲基转移酶基因克隆与功能鉴定

论文摘要

目的克隆并鉴定铁线蕨中参与黄酮及苯丙类化合物生物合成的氧甲基转移酶(OMTs)。方法以铁线蕨的叶片总RNA为模板,采用RT-PCR技术,从中获得两个OMTs cDNA全长,分别命名为AcOMT1和AcOMT2,并将其构建到蛋白表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21中进行蛋白表达,利用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白。在合适的反应条件下进行体外酶活分析。利用Swiss-model在线服务器分别生成AcOMT1和AcOMT2三维同源模型,通过PyMOL软件预测影响蛋白活性的关键氨基酸位点。利用MEGA v5.1和DNAMAN 7.0.2软件分别进行系统发育进化树分析和氨基酸多序列比对。结果从铁线蕨的转录组测序数据库中筛选并克隆得到两个OMTs,序列比对与进化树分析结果表明它们均属于Ⅰ型OMTs。酶活结果显示AcOMT1和AcOMT2均可催化多种底物,催化特点相似,其最适底物均为槲皮素。结论从铁线蕨中克隆并鉴定了两个OMT基因,对阐明蕨类植物中黄酮类化合物的甲基化修饰具有一定的理论指导意义。

论文目录

  • 1 材料与方法
  •   1.1 材料
  •     1.1.1 植物
  •     1.1.2 菌株与质粒
  •     1.1.3 主要试剂与仪器
  •   1.2 方法
  •     1.2.1 铁线蕨总RNA的提取和单链cDNA的合成
  •     1.2.2 生物信息学分析
  •     1.2.3 铁线蕨中目的基因cDNA全长序列克隆及原核表达载体的构建和蛋白表达纯化
  •     1.2.4 AcOMT1和AcOMT2体外酶活功能鉴定
  • 2 结 果
  •   2.1 铁线蕨中AcOMT1和AcOMT2基因克隆和生物信息学分析
  •   2.2 融合蛋白表达及纯化
  •   2.3 AcOMT1和AcOMT2体外酶活鉴定
  • 3 讨 论
  • 文章来源

    类型: 期刊论文

    作者: 倪荣,张晓双,程爱霞

    关键词: 铁线蕨,黄酮类化合物,氧甲基转移酶,基因克隆,功能鉴定

    来源: 山东大学学报(医学版) 2019年04期

    年度: 2019

    分类: 医药卫生科技,基础科学

    专业: 生物学

    单位: 山东大学药学院天然产物化学生物学教育部重点实验室

    基金: 山东省重点研发计划(2016GSF121032)

    分类号: Q943.2

    页码: 27-33

    总页数: 7

    文件大小: 3724K

    下载量: 156

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