论文摘要
非编码小分子RNA（Small non-coding RNA,sRNA）是广泛存在于微生物体内的一类重要调控因子,参与了许多生理过程与物质代谢的调控。腐胺是细菌中存在的主要多胺类化合物,不仅可在细胞膜上与生物分子发生相互作用,参与各种生理功能,还可在特定条件下,作为非主要碳氮源被微生物代谢。大肠杆菌可通过PuuDRCBE组成的谷氨酰胺化腐胺途径,将腐胺降解为琥珀酸,供细胞生长,抵抗环境压力。但是,有关小分子RNA是否参与了腐胺的代谢调控,尚不清楚。本研究以大肠杆菌为研究对象,构建了大肠杆菌小分子RNA的敲除突变菌库,筛选和预测了不同小分子RNA的潜在靶标与途径;鉴定了调控腐胺代谢途径的小分子RNA,Spot 42,确定了其作用靶标基因,解析了其作用分子机制。通过生物信息学预测,我们确定了大肠杆菌DY329菌株中含有的49种小分子RNAs的序列,并预测了可能的靶标基因。利用同源重组系统对其敲除,成功获得了含有28种小分子RNAs单敲除突变株的大肠杆菌小分子RNA敲除突变库。通过菌株的温度耐受性、生物膜产量、氧化胁迫耐受性等性状筛选和荧光定量PCR检测,确定了多个调控不同性状的小分子RNA。大肠杆菌DY329菌株中的小分子RNA Spot 42,由长度为109个碱基的spf基因编码,序列比对与二级结构预测等分析显示Spot 42高度保守,且特异性存在于γ-变形菌门,含有5个loop区。CopraRNA软件预测Spot 42与大肠杆菌谷氨酰胺化腐胺代谢途径中的基因puuE的上游非编码区存在碱基互补配对,可能参与puuE的表达调控。荧光定量PCR显示,葡萄糖可诱导spf基因的转录,葡萄糖缺乏会抑制其转录;腐胺则可诱导puuDRCBE基因和spf基因的转录。敲除回补等实验显示,PuuR作为主要的转录调控因子,直接调控了puuDCBE等基因的转录,但不调控spf基因的转录;Spot 42不会在转录水平上对puuE进行调控。针对spf与puuE可能的结合位点我们构建了一系列突变Spot 42突变体。荧光蛋白报告系统结果显示,过量转录的Spot 42可显著抑制puuE的表达水平;在Spot 42的50-57nt（UAAUCGGA）进行突变,可解除该抑制作用,推测该位点可能是Spot 42与puuE的5’非翻译区发生直接碱基互补配对的关键位点。Spot 42可通过该反义调节机制调控puuE的表达,实现腐胺代谢调控与主次碳源的切换。综上所述,本工作构建了大肠杆菌小分子RNA敲除突变库,明确了Spot 42可通过碱基互补配对抑制PuuE的翻译,直接参与腐胺代谢调控。本工作不仅为大肠杆菌小分子RNA研究搭建了技术平台,还完善了腐胺的代谢调控网络,阐明了Spot 42在主次碳源利用及碳氮源切换中的重要作用。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 孙欣
导师: 梁如冰
关键词: 小分子,腐胺代谢,碳源代谢抑制
来源: 上海交通大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 上海交通大学
分类号: Q78
DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.002858
总页数: 88
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