肺炎链球菌PspAs蛋白疫苗佐剂筛选和体外评价方法研究

论文摘要

肺炎链球菌是一种常见的呼吸道病原体,主要定植于鼻咽处的呼吸道粘膜中。据统计,每年有几百万人死于肺炎链球菌感染,婴幼儿和老年人所占比例较高。虽然荚膜多糖疫苗和荚膜多糖蛋白结合疫苗已经进入市场,但因血清型限制,导致其保护性有限且容易引起血清型替代现象。肺炎链球菌表面蛋白A（PspA）是一种存在于所有肺炎链球菌中的具有高免疫原性的表面蛋白,分为3个家族和6个亚类,可诱导机体产生较高的免疫反应。在本实验室的前期实验结果中,我们构建了一种PspA蛋白联合疫苗PspAs,它包括PsaA-PspA23蛋白和PspA4蛋白,相比于Ppv23疫苗,其产生了较好的免疫原性及免疫保护性。然而,PspAs疫苗对一些菌株没有很好的保护能力。本研究的目的是通过筛选并加入有效的佐剂以提高PspAs疫苗的有效性。我们选择四种佐剂（氢氧化铝、MF59、AS03、AS02）与PspAs蛋白进行联合免疫,并进行佐剂剂量优化和免疫评价,测定了小鼠抗体效价、抗体IgG分型、血肺菌载量、存活率和细胞因子水平。结果表明,所有疫苗在抗原特异性免疫球蛋白G（IgG）效价方面均显示出佐剂剂量依赖性的改善,同时,用PspAs蛋白与各种佐剂联合免疫的小鼠菌肺及菌血载量明显减少。而在这些联合免疫疫苗中,AS02佐剂PspAs疫苗诱导的IgG效价高于其他佐剂,且对不同家族、不同亚类的病原菌具有较好的保护作用。此外,只有AS02组显示了高水平的细胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4。这些结果表明,AS02与PspAs蛋白联合应用有望成为下一代肺炎疫苗。调理吞噬实验能够有效的评价荚膜多糖疫苗的有效性。但肺炎蛋白疫苗却缺少有效的体外评价方法。本论文评价了被动免疫实验、调理吞噬实验和补体抑制实验三种体外方法。在被动免疫实验中,首先确定了实验流程,即采用兔血清腹腔注射小鼠,注射6小时后,进行攻毒实验。然后,利用被动免疫实验方法评价了两株不同的肺炎链球菌的攻毒保护能力。结果显示随着血清稀释倍数的增大,小鼠的存活率逐渐下降。在调理吞噬和补体抑制实验中,评价了4株不同的肺炎链球菌。根据实验结果,调理吞噬实验不能准确的评价PspAs疫苗的有效性,与之相比,补体抑制实验更适合。但是补体为什么能够在PspAs抗体存在时对肺炎链球菌产生抑制作用的机制还不清楚。为了进一步探究PspA蛋白对补体抑制效果的影响,我们构建了PspA蛋白缺陷的肺炎链球菌并进行了补体抑制实验。结果显示,PspA蛋白缺陷的菌株与野生型菌株相比,荚膜多糖疫苗的免疫血清组的抑制效果有了明显的提升,这表明PspA具有阻碍补体介导的菌体生长抑制的作用,这一发现为肺炎链球菌PspA蛋白疫苗体外评价方法的建立提供了新的思路。

论文目录

中文摘要

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缩略词表

第1章前言

1.1 肺炎链球菌疫苗

1.1.1 肺炎链球菌简介

1.1.2 肺炎链球菌疫苗研究现状

1.1.3 PspA蛋白和PsaA蛋白介绍

1.2 佐剂

1.3 被动免疫实验

1.4 调理吞噬实验和补体抑制方法

1.4.1 调理吞噬实验

1.4.2 补体抑制实验

1.5 论文设计

1.5.1 论文目的

1.5.2 论文实验设计

第2章 PspAs肺炎蛋白疫苗的佐剂筛选

2.1 材料与仪器

2.1.1 菌株,实验动物

2.1.2 主要仪器

2.1.3 试剂

2.1.4 主要溶液的配制

2.2 实验方法

2.2.1 PspAs蛋白纯化和与氢氧化铝佐剂的吸附率测定

2.2.2 PspAs蛋白与氢氧化铝佐剂解吸附方法

2.2.3 PspAs蛋白疫苗肌肉免疫

2.2.4 SDS-PAGE

2.2.5 ELISA法测定血清中抗体效价

2.2.6 PspAs疫苗攻毒保护实验

2.2.7 菌血菌肺清除实验

2.2.8 细胞因子检测

2.3 实验结果与讨论

2.3.1 免疫原制备

2.3.2 PspAs蛋白与氢氧化铝佐剂的吸附率测定

2.3.3 特异性抗体IgG效价检测和比较

2.3.4 清除肺炎链球菌的能力比较

2.3.5 攻毒保护能力的比较

2.3.6 特异性抗体IgG分型测定

2.3.7 不同佐剂组的细胞因子分泌水平比较

2.4 本章小结和讨论

第3章 PspAs肺炎蛋白疫苗体外评价方法研究

3.1 材料与仪器

3.1.1 菌株与样品

3.1.2 主要仪器

3.1.3 主要质粒、酶和细胞

3.1.4 主要试剂

3.1.5 主要试剂配制

3.2 实验方法

3.2.1 免疫

3.2.2 菌体Western blot

3.2.3 ELISA法检测血清中的特异性抗体效价

3.2.4 PspA蛋白缺陷菌同源重组质粒的构建

3.2.5 肺炎链球菌转化方法

3.2.6 PspA蛋白缺陷菌株鉴定

3.2.7 被动免疫

3.2.8 HL60 细胞培养和分化

3.2.9 调理吞噬

3.2.10 补体抑制

3.3 实验结果与讨论

3.3.1 被动免疫实验方法的建立

3.3.2 PspAs肺炎蛋白疫苗被动免疫实验评价结果

3.3.3 肺炎链球菌补体抑制实验和调理吞噬实验评价

3.3.4 PspA蛋白缺陷肺炎链球菌菌株构建及鉴定

3.3.5 PspA蛋白缺陷菌株补体抑制实验评价和机理研究

3.4 本章小结及讨论

本文总结及结论

参考文献

作者简介及在学期间所获得的科研成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈晓瑞

导师: 吴永革

关键词: 肺炎链球菌,佐剂,被动免疫,调理吞噬,补体

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 吉林大学

分类号: R392

总页数: 78

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