过继性治疗论文_韩雅丽

导读:本文包含了过继性治疗论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:肿瘤,细胞,抗原,受体,胃癌,免疫,疗法。

过继性治疗论文文献综述

韩雅丽^[1]（2018）在《应用嵌合性抗原受体T细胞过继性治疗实体瘤的临床前研究》一文中研究指出研究背景胃癌(Gastric Cancer,GC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,是世界上发病率排名第5位、死亡率排名第3位的恶性肿瘤,尤以东亚地区最高。中国是胃癌高发国家,多数病人初诊时已无法手术或发生转移,预后较差。虽然目前有化疗、放疗、手术联合的胃癌综合治疗,但无法手术的晚期胃癌的死亡率仍然不容乐观。人表皮生长因子受体 2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)在多种恶性肿瘤中过表达,并在肿瘤的发生、发展中起着重要作用。研究表明胃癌患者中HER2过表达率从9%到23%不等,HER2在胃癌中过表达的发现为胃癌提供了新的靶向治疗策略。曲妥珠单抗是HER2阳性、晚期或转移性胃癌的首例靶向治疗药物。但是曲妥珠单抗的临床获益仍然有限,且其昂贵的成本、心脏毒性以及获得性耐药都限制了其广泛的临床应用。因此,胃癌亟需新的有效治疗手段,为晚期胃癌患者探寻靶向HER2的主动免疫治疗策略具有重要的临床意义。嵌合性抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞是近年来肿瘤免疫治疗的热点,也是最有前景的抗肿瘤治疗手段之一。表达CAR的T细胞可以通过胞外的单链可变结构域(single-chain variable fragment,scFv)直接识别肿瘤细胞表面的肿瘤相关性抗原(Tumor associated antigen,TAA),通过胞内信号传导激活T细胞,释放穿孔素、颗粒酶及干扰素-γ、肿瘤坏死因子等多种细胞因子,诱导肿瘤细胞的凋亡坏死。因此,CART细胞的作用模式是无MHC限制性的,并且巧妙地结合了抗体特异性识别抗原的能力和T淋巴细胞的细胞毒作用。CART细胞疗法首先在血液系统肿瘤中获得了伟大的成功,此后在实体瘤的临床试验及临床前研究中同样展现出其优势以及令人振奋的结果。与单克隆抗体治疗相比,CART细胞治疗具有抗肿瘤作用更持久、抗瘤谱广、作用精准、不良反应少、耐药风险低等优势。以HER2为靶点的CART细胞治疗已在多种肿瘤中被广泛探究,包括乳腺癌,卵巢癌,胆管癌和胰腺癌,髓母细胞瘤,胶质母细胞瘤,骨肉瘤等,部分HER2特异性的CART细胞治疗已进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验。但是目前CART细胞对胃癌的治疗潜能尚未被广泛研究和报道。研究目的本研究旨在构建HER2特异性的chA21 scFv-4-1BBz CAR并转染人T淋巴细胞;探究chA21 scFv-4-1BBz CART细胞在体外特异性识别和杀伤HER2高表达肿瘤细胞的能力,及其在体内抑制HER2高表达的胃癌的生长和进展的作用,以期为晚期胃癌提供一种新的免疫靶向治疗策略。研究方法1.流式细胞仪分析人胃癌细胞株表面HER2受体的表达水平。2.应用重迭延伸 PCR 技术(overlap extension PCR,OE-PCR)连接构建 CD8a leader-chA21 scFv-CD8ahinge-4-1BB-CD3z 质粒。将构建好的 chA21-4-1BBz CARDNA接入pSin慢病毒骨架形成pSin-GFP-chA21-4-1BBz质粒,并使用脂质体转染法包装慢病毒。3.利用慢病毒载体转染chA21-4-1BBz CAR至人T淋巴细胞,流式细胞术分析chA21-4-1BBz CAR在T细胞表面的表达效率。4.通过流式多因子检测法检测chA21-4-1BBzCART细胞在体外与表达不同水平HER2的肿瘤细胞共培养时分泌Th1型(IL-2、TNF-α、INF-γ)、Th2型(IL-4、IL-6、IL-10)、Th17型(IL-17A)共七种细胞因子的情况。5.设置1:1,3:1,10:1,30:1四种不同的效靶比(T细胞:肿瘤细胞),利用LDH释放实验评价在体外chA21-4-1BBz CART细胞对不同HER2表达水平的肿瘤细胞的特异性杀伤能力。6.选择NOD-SICD雌性小鼠背部左右两侧分别皮下接种HER2高表达的NCI-N87细胞和HER2低表达的MKN-28细胞从而建立自对照人胃癌小鼠皮下移植瘤模型;40天后分组给予chA21-4-1BBz CART细胞或未转染的T细胞(Untransduced T cells,UTT cells)尾静脉输注治疗并监测两组T细胞输注对胃癌皮下移植瘤生长的影响。7.T细胞治疗30天后,从小鼠内眦静脉取血,分离小鼠外周血单个核细胞,行抗人CD3抗体染色。流式细胞术分析评估chA21-4-1BBz CAR T细胞在小鼠外周血中的生存情况。8.收集各组小鼠剥离的肿瘤,OCT包埋制备冷冻组织切片,免疫组化分析人CD3+T细胞在各组肿瘤组织内的聚集情况,评价chA21-4-1BBz CART细胞在肿瘤位点的浸润聚集。9.选取NOD-SCID雌性小鼠腹腔内注射NCI-N87细胞建立人胃癌小鼠腹膜移植瘤模型;肿瘤接种后第7、10天分组给予腹腔注射chA21-4-1BBz CAR T细胞或UTT细胞,并监测两组T细胞输注对胃癌腹腔种植瘤的疗效。研究结果1.人胃癌细胞系 NCI-N87 高表达 HER2,HGC-27、MKN-45、BGC-823 中度表达HER2,MKN-28表达极低水平的HER2。2.成功构建了 HER2特异性的chA21-4-1BBz CAR,慢病毒转染人T淋巴细胞后,CAR表达效率高于50%;chA21-4-1BBzCAR转染的T细胞及UTT细胞均在体外培养体系中扩增良好。3.chA21-4-1BBz CAR T细胞在体外能特异性识别HER2高表达的SKOV3、NCI-N87细胞并释放高水平的IL-2、TNF-α、INF-γ等Th1型细胞因子,对HER2中度表达的HGC-27、MKN-45、BGC-823细胞的识别及应答能力相对较弱,而对HER2极低表达的MKN-28细胞无明显应答。chA21-4-1BBz CART细胞分泌的IL-2、TNF-α、INF-γ细胞因子的浓度与靶细胞表面HER2表达水平呈正相关。4.chA21-4-1BBz CAR T细胞可特异性杀伤HER2高表达的SKOV3、NCI-N87肿瘤细胞,随着效靶比升高杀伤效率增强,对中度表达HER2的MKN-45细胞的杀伤能力相对较弱,对HER2极低表达的MKN-28细胞无明显杀伤作用。5.成功建立人胃癌小鼠皮下移植瘤自对照模型。相较于UTT细胞治疗,chA21-4-1BBz CART细胞治疗明显抑制了 NCI-N87肿瘤的生长,差异有统计学意义(P<0.05),接受不同T细胞治疗的MKN-28移植瘤生长无明显差异(P>0.05);统计分析各组肿瘤重量得出,chA21-4-1BBzCART细胞治疗较UTT细胞治疗的小鼠NCI-N87肿瘤负荷明显减小(268 ± 50 mg vs 648 ± 18 mg,P<0.001),而 MKN-28 肿瘤负荷无明显差异(718±79mgvs 678 ±72mg,P>0.05)。6.荷瘤小鼠接受T细胞治疗30天后,在小鼠外周血中成功检测到输注的chA21-4-1BBzCART细胞的存活,但未见检测到UTT细胞;免疫组化结果显示,对于HER2高表达的NCI-N87肿瘤组织,仅有chA21-4-1BBz CART细胞治疗的肿瘤病灶内检测到明显的人CD3+ T细胞聚集。对于HER2极低表达的MKN-28肿瘤组织,两组T细胞治疗的肿瘤组织均未检测到人CD3+T细胞聚集。7.成功建立人胃癌小鼠腹膜移植瘤模型,对照组UTT细胞治疗的小鼠腹腔内均观察到血性腹水和多发肿瘤病灶;而chA21-4-1BBz CART细胞腹腔注射有效抑制了 HER2高表达的NCI-N87腹膜种植瘤的生长进展,解剖查见极少量的肿瘤结节,无血性腹水。chA21-4-1BBzCART细胞腹腔注射明显延长了荷瘤小鼠的生存期,差异具有统计学意义(P<0.001)。研究结论1.chA21-4-1BBzCART细胞在体外能特异性识别HER2阳性肿瘤细胞并释放高水平的Th1型细胞因子,并且能特异性杀伤裂解HER2高表达的肿瘤细胞。2.chA21-4-1BBz CAR T细胞静脉输注到小鼠体内后可特异性识别HER2抗原,在肿瘤位点浸润聚集,有效抑制HER2高表达的胃癌皮下移植瘤的生长进展,而对HER2低表达的肿瘤无明显作用。3.chA21-4-1BBzCART细胞腹腔注射能有效抑制HER2高表达的人胃癌小鼠腹膜种植瘤的进展并延长荷瘤小鼠的生存期。4.我们构建的HER2特异性的chA21-4-1BBz CART细胞对于HER2阳性晚期胃癌是一种很有前景的治疗手段,为下一步临床试验的开展奠定了基础。研究背景叁阴性乳腺癌(Triple negative breast cancers,TNBC)是一种人表皮生长因子受体2(HER2),雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)均不表达的乳腺癌,约占所有乳腺癌病理类型的15%～20%。TNBC具有独特的临床及病理学特征,肿瘤异质性很高,具有高度侵袭性,易发生局部复发和远处转移,预后很差。迄今为止仍没有针对TNBC的标准治疗,主要依赖于手术、化疗和放疗,临床获益有限,常规的内分泌治疗和靶向治疗无效,亟需为TNBC患者探寻有效的治疗策略。NKG2D(natural-killer group 2,member D)是 NK 细胞表面主要的活化性受体,同时发现其在CD8+T细胞、NKT细胞、巨噬细胞等其他免疫细胞上也有表达,这些发现使其越来越成为肿瘤免疫机制的研究热点。NKG2D配体(NKG2D Ligands,NKG2DLs)主要包括 MIC(MHC classI-related chain)家族的 2 个成员和 ULBP/RAET(UL16-binding protein,or retinoic acid early transcript)家族的6个成员。研究已证明了许多上皮源性恶性肿瘤细胞上都有NKG2D配体的广泛表达,如叁阴性乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、白血病、多发性骨髓瘤等。科学家们将NKG2DL作为一种CAR T细胞治疗的靶点,已在动物实验和临床试验中均取得了初步成功。早在2005年时Sentman等人已经证明了使用CART细胞靶向NKG2DLs的可行性。他们利用全长NKG2D作为胞外识别域,胞内由Dap10提供共刺激信号,链接CD3z构成胞内信号传导域,在体内外实验中证明了 NKG2D CAR T细胞对表达NKG2DLs的肿瘤细胞的识别和杀伤作用。后来我们课题组及其他科学家分别已经尝试构建过嵌入4-1BB或CD28共刺激信号的NKG2D CAR T细胞,并在动物实验中取得了成功。NKG2D CAR与大多数传统的CAR不同的是,它使用的胞外结构域是人NKG2D受体,而多数CAR使用的是小鼠单克隆抗体来源的scFv,因此NKG2D CAR因不携带任何外来种属来源的蛋白结构,大大降低了被患者免疫系统排异的风险。研究报道NKG2DLs在TNBC中有广泛表达,我们推测NKG2D CART细胞疗法对于TNBC可能是一种有前景的靶向治疗手段,国内外尚无此方面的研究报道。研究目的本研究旨在构建4-1BB或CD27共刺激的NKG2D CAR T细胞,探究其在体外对表达NKG2DLs的叁阴性乳腺癌细胞的特异性识别和杀伤作用,及其在体内小鼠皮下移植瘤模型中对叁阴性乳腺癌的生长和进展的抑制作用。同时探究共刺激信号4-1BB、CD27对NKG2DCART细胞在体内外的扩增及生存的作用,以期为叁阴性乳腺癌提供一种新的免疫靶向治疗策略。研究方法1.利用流式细胞仪技术检测人TNBC细胞系表面NKG2DLs的表达。2.以原有的CAR骨架为基础,应用NheI和Sa11双酶切技术连接构建NKG2D CAR。以CD8α引导链连接人NKG2D片段(aa 82-216),以CD8α铰链和跨膜区连接CD3z,或4-1BB串联CD3z,或CD27串联CD3z叁种胞内结构域,并在CAR序列之前以2A序列连接GFP。将构建好的GFP-CAR的DNA接入pELNS 慢病毒骨架构建 pELNS-GFP-NKG2D-z,pELNS-GFP-NKG2D-4-1BBz,pELNS-GFP-NKG2D-CD27z质粒,并利用脂质体转染法制备慢病毒颗粒。3.通过慢病毒载体转染激活的人T淋巴细胞,构建一代NKG2D-z,二代NKG2D-BBz、NKG2D-27z CAR T细胞。利用流式细胞仪分析T细胞表面CAR的表达效率。4.将叁种NKG2D CAR T细胞与NKG2DLs高表达的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞共培养,以NKG2DLs阴性的AE17细胞作对照,通过ELISA法检测NKG2D CART细胞在体外遇到TNBC肿瘤细胞刺激后分泌INF-γ细胞因子的情况,评价其在体外特异性识别NKG2DLs阳性肿瘤细胞的能力。5.设置1:2,1:1,2:1叁种不同的效靶比(T淋巴细胞:肿瘤细胞),利用生物荧光细胞毒性检测法来评价NKG2D CART细胞对表达NKG2DLs的TNBC细胞系MDA-MB-231细胞的杀伤作用。6.设置含有或不含有外源性IL2(50 IU/ml)的体外培养条件,流式分析持续监测NKG2D CAR T细胞的计数和CAR的表达水平,评价外源性IL2对NKG2D CAR T细胞在体外扩增和CAR富集的作用。7.磁性分离筛选出CD25高表达和低表达的NKG2DCART细胞群,流式分析持续监测NKG2D CAR T细胞的计数和CAR的表达水平,评价外源性IL2与CD25的相互作用在促进一代NKG2D CART细胞的富集中发挥的作用。8.选择NSG雌性小鼠皮下注射萤光素酶标记的MDA-MB-231细胞,建立小鼠人TNBC皮下移植瘤模型;肿瘤接种第40和45天后分组给予尾静脉注射PBS,UTT 细胞,NKG2D-z,NKG2D-BBz 或 NKG2D-27zCAR T 细胞治疗,游标卡尺测量肿瘤体积并通过生物荧光成像系统监测各组小鼠肿瘤的生长情况。9.T细胞治疗10天后和20天后,两次收集小鼠外周血,流式分析输注的人T细胞在小鼠外周血循环中的生存情况以及CD4+、CD8+T细胞的比例,同时流式分析人T细胞群组中CAR的表达情况。研究结果1.人TNBC细胞系广泛表达NKG2DLs。MICA/B在BT549细胞表面高水平表达,而在MDA-MB-436细胞表面仅低水平表达。ULBPs在TNBC细胞系中的表达水平不一:只有MDA-MB-468细胞低水平表达ULBP1,而ULBP-2/5/6在除BT549以外的TNBC细胞系中均有较高水平的表达;ULBP-3和ULBP-4仅在MDA-453和MDA-MB-231上有表达。2.成功构建了 NKG2D-zCAR、NKG2D-BBz、NKG2D-27zCAR。慢病毒转染人T细胞后体外扩增2周,检测到叁种CAR的表达效率均达到90%左右。3.NKG2D CAR T细胞在体外有效识别和杀伤表达NKG2DLs的TNBC细胞系并分泌高水平的IFN-γ;当效靶比低至1:2时,NKG2DCART细胞的杀伤效率超过60%,随着效靶比的升高其杀伤效率明显增强,但对NKG2DLs阴性细胞系AE17无应答。相较于一代的NKG2D-z CAR T细胞,二代的NKG2D-27z和NKG2D-BBz CART细胞分泌更高水平的IFN-y且表现出更强的细胞毒性。4.流式分析确定了未转染的T细胞激活后表达NKG2DLs(～10%)。在分组给予或撤退外源性IL2的体外培养中,结果显示使用含IL-2的培养基培养时,NKG2D-z,NKG2D-BBz和NKG2D-27z CAR T细胞均扩增良好并高度富集CAR+细胞,在第5天仅有约30%的CAR+T细胞,20天培养后CAR+T细胞富集到95%以上;而使用无IL-2的培养基培养时,NKG2D-z,NKG2D-BBz和NKG2D-27z CAR T细胞均没有有效扩增,只有NKG2D-BBz和NKG2D-27z CAR转染的T细胞高度富集CAR+ T细胞,而NKG2D-z CAR T细胞在培养体系中CAR+比例稳定在～30%。说明IL2促进NKG2D CART细胞在体外的扩增和富集。5.在有外源性IL-2的体外培养中,CD25高表达的NKG2D-z,NKG2D-BBz和NKG2D-27z CART细胞均有CAR富集至约75%～90%,而在CD25低表达的NKG2D CAR T 细胞中,二代 NKG2D-BBz 和 NKG2D-27z CAR T 细胞能达到80%～90%的CAR富集,一代NKG2D-z CAR T细胞仅有30%左右的CAR富集。说明IL2促进一代NKG2D CAR T细胞的富集依赖于T细胞表面CD25的表达。6.以萤光素酶标记的MDA-MB-231细胞成功建立高表达NKG2DLs的小鼠人TNBC皮下移植瘤模型。接受PBS或UTT细胞处理的小鼠MDA-MB-231肿瘤生长迅速,接受NKG2D-z CART细胞治疗的小鼠其肿瘤生长有一定延缓,而相较于 NKG2D-z CAR T 细胞,NKG2D-BBz 或 NKG2D-27z CAR T 细胞注射表现出明显更强的抑制肿瘤生长的作用(P<0.001)。7.第一次T细胞注射10天后,流式检测小鼠外周血循环中人CD4+T细胞计数高于CD8+ T细胞的计数,并且NKG2D-z,NKG2D-BBz和NKG2D-27z CAR T细胞的数量与UT T细胞数量相比明显较少;NKG2D-BBz和NKG2D-27z CAR T细胞组中CAR的的表达率(～20%)明显高于NKG2D-zCART细胞组中CAR的表达(～10%)。第一次T细胞注射20天后,小鼠外周循环中人CD8+T细胞计数高于CD4+ T细胞的计数,NKG2D-BBz或NKG2D-27z CAR T细胞的数量明显增多,而UTT和NKG2D-zCART细胞数量明显少于10天前的检测结果;NKG2D-BBz和 NKG2D-27zCART细胞组中的 CAR 高度富集(75%-95%),明显高于NKG2D-z CAR T细胞组中CAR的表达(～20%)。研究结论1.人TNBC细胞系广泛表达NKG2DLs。NKG2D CART细胞在体外有效识别和杀伤表达NKG2DLs的TNBC细胞系,但对NKG2DLs阴性的细胞系无明显应答。相较于一代的NKG2D-z CAR T细胞,二代的NKG2D-27z和NKG2D-BBz CART细胞分泌更高水平的IFN-γ并且表现出更强的细胞毒性。2.外源性IL2可促进NKG2D CART细胞在体外的扩增和富集;二代NKG2D-BBz和NKG2D-27z CART细胞可通过共刺激信号的作用在体内外保持良好的扩增、存活和自我富集,而无共刺激信号的一代CART细胞的富集依赖IL2和CD25之间的相互作用。3.NKG2D CAR T细胞静脉输注抑制了小鼠人TNBC皮下移植瘤的生长,二代的NKG2D-BBz或NKG2D-27z CAR T细胞抗肿瘤作用显着优于一代NKG2D-z CART细胞。4.4-1BB和CD27共刺激信号可增强CD8+T细胞在体内的存活和扩增。4-1BB或CD27共刺激的二代NKG2D CAR T细胞在体内能够可有效扩增和存活,并维持高水平CAR的表达;不含共刺激信号的一代NKG2D CART细胞在体内存活不佳,不能有效维持CAR的稳定表达和富集。5.我们构建的4-1BB或CD27共刺激的二代NKG2D CAR T细胞对于叁阴性乳腺癌是一种很有前景的治疗手段,为下一步临床试验的开展奠定了基础。(本文来源于《山东大学》期刊2018-05-25）

马良,钟鉴宏,黎乐群^[2]（2011）在《肝细胞性肝癌根治性治疗后过继免疫治疗效果的Meta分析》一文中研究指出目的:评价肝细胞性肝癌(HCC)术后过继免疫治疗(AIT)对预防复发及提高总生存率的疗效和安全性。方法:计算机检索Medline、Embase和Cochrane图书馆数据库中的相关文献。检索所有关于HCC术后AIT治疗的随机对照试验。结果:共纳入4个随机对照试验,合计423例患者。Meta分析结果显示,1)1年复发率:4个试验(n=423)表明,辅助AIT治疗组与单纯手术或射频消融治疗组比较,两组差异有统计学意义(RR=0.51,95%CI=0.36～0.71,P=0.000 1)。2)2个试验报道了3年复发率,两组差异无统计学意义(RR=0.76,95%CI=0.56～1.02,P=0.07)。3)死亡率:报道1年死亡率的2个研究显示,两组差异无统计学意义(RR=0.70,95%CI=0.31～1.61,P=0.41);3年死亡率结果亦显示差异无统计学意义(RR=0.76,95%CI=0.38～1.49,P=0.42)。4)不良反应:3篇研究报道了与辅助AIT治疗相关的不良反应,主要为寒战发热、头痛、头晕、恶心或心动过速。尚未见与AIT相关的感染、肝功能衰竭、自身免疫性疾病或死亡的报道。结论:辅助AIT治疗能降低HCC患者术后1年的复发率,但对改善生存率及远期复发率无明显作用。由于本研究纳入病例数较少,无法确定偏倚对结论可靠性的影响程度,因此,有必要开展多中心大样本及长期随访的随机对照试验来进一步证实。(本文来源于《中华肿瘤防治杂志》期刊2011年19期）

杨波^[3]（2010）在《阻断TGF-β信号通路增强NK-92细胞过继性治疗的抗肿瘤效应》一文中研究指出目的通过oligo化学合成及PCR扩增法合成人显性抑制TGF-βⅡ型受体(Dominant-negative transforming growth factor-βreceptorⅡ, DNTβRⅡ)目的基因,构建pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ真核表达质粒；利用Nucleofector技术将质粒转染NK-92细胞,观察阻断TGF-β信号通路的NK-92细胞的体外抗肿瘤效应；建立裸鼠荷Calu-6人肺癌细胞皮下移植瘤模型,观察阻断TGF-β信号通路的NK-92细胞过继性治疗的体内抗肿瘤效应。方法(1)根据Genebank数据库确定DNTβRⅡ目的基因,利用化学合成法进行单链oligo的合成,PCR法将合成的oligo拼接成完整的序列,装入PMD18-T载体并转染感受态细胞DH5α,经XhoI和EcoRI酶切后连接至目的载体pIRES2-AcGFP中,酶切电泳和DNA测序鉴定,转染COS-7细胞,倒置荧光显微镜观察GFP表达。(2)流式细胞术检测NK-92细胞TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体表达情况,ELISA法检测Calu-6、A-549、MDA-MB231和HT-29四种肿瘤细胞系的TGF-β1分泌水平；采用Nucleofector技术将pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒和pIRES2-AcGFP对照质粒转染NK-92细胞,流式细胞术、RT-PCR法及倒置荧光显微镜检测DNTβRⅡ在NK-92细胞的转染及表达,western blot险测转染后NK-92细胞Smad2蛋白的活化状态；将分泌水平最高的Calu-6细胞系与TGF-β1(终浓度10ng／m1)共孵育24小时,CCK-8法比较转染后的NK-92细胞对Calu-6人肺癌细胞系的体外杀伤活性。(3)采用细胞悬液接种法,将Calu-6细胞(1×106)接种于裸鼠背部皮下；成瘤实验同期经尾静脉分别输注转染pIRES2-AcGFP的NK-92细胞(B组)和转染pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ的NK-92细胞(C组),A组不予另外处理,接种后第10天比较各组成瘤率；抑瘤实验于接种后第10天、17天经尾静脉进行2次过继性输注,分为生理盐水组(a组)、NK92／pIRES2-AcGFP组(b组)和NK92／pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ组(c组),接种第56天处死动物；比较各组皮下移植瘤体积、生存期变化及外周血IFN-γ水平,肺转移情况。结果(1)合成DNA经测序验证与目的基因一致,真核表达质粒pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ转染后,倒置荧光显微镜证实DNTβRⅡ在COS-7细胞的表达。(2)Calu-6细胞系在四种肿瘤细胞系中TGF-β1表达水平最高；流式细胞术证实了NK-92细胞表面TβRⅠ、TβRⅡ的高表达；采用Nucleofector技术,pIRES2-AcGFP和pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒对NK-92细胞的转染效率分别为28.53%和18.86%,RT-PCR和倒置荧光显微镜证实了DNTβRⅡ的表达,western blot显示虽有TGF-β的刺激,转染pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒的NK-92细胞未见Smad2蛋白的活化。Calu-6细胞与TGF-β1共孵后,NK-92细胞对Calu-6细胞的杀伤活性较共孵前明显减弱(p<0.001)：转染DNTβRⅡ阳性质粒的NK-92细胞对Calu-6细胞杀伤活性明显高于GFP转染组(p<0.001)。(3)成瘤实验显示3组间成瘤率存在差异,C组成瘤率低于A组(p<0.05)。抑瘤实验表明转染DNTβRⅡ阳性质粒的NK-92细胞(c组)过继性治疗后裸鼠皮下移植瘤体积缩小,肺转移率下降,生存期明显延长,外周血IFN-γ水平明显增高。结论(1)成功构建pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ真核表达质粒,为阻断NK-92细胞的TGF-β信号通路提供了载体；(2)Nucelofector核转染技术实现了pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒在NK-92细胞的有效转染和表达；(3)pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒的转染在受体水平阻断了NK-92细胞的TGF-β信号通路；(4)阻断TGF-β信号通路的NK-92细胞能够在体外抵抗TGF-β的免疫抑制作用；(5)阻断TGF-β信号通路能够明显增强NK-92细胞过继性治疗的体内抗肿瘤效应；(6)改善肿瘤微环境中的免疫抑制作用,可能增强过继性免疫细胞治疗的临床疗效。(本文来源于《中国人民解放军军医进修学院》期刊2010-05-26）

过继性治疗论文开题报告

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

目的:评价肝细胞性肝癌(HCC)术后过继免疫治疗(AIT)对预防复发及提高总生存率的疗效和安全性。方法:计算机检索Medline、Embase和Cochrane图书馆数据库中的相关文献。检索所有关于HCC术后AIT治疗的随机对照试验。结果:共纳入4个随机对照试验,合计423例患者。Meta分析结果显示,1)1年复发率:4个试验(n=423)表明,辅助AIT治疗组与单纯手术或射频消融治疗组比较,两组差异有统计学意义(RR=0.51,95%CI=0.36～0.71,P=0.000 1)。2)2个试验报道了3年复发率,两组差异无统计学意义(RR=0.76,95%CI=0.56～1.02,P=0.07)。3)死亡率:报道1年死亡率的2个研究显示,两组差异无统计学意义(RR=0.70,95%CI=0.31～1.61,P=0.41);3年死亡率结果亦显示差异无统计学意义(RR=0.76,95%CI=0.38～1.49,P=0.42)。4)不良反应:3篇研究报道了与辅助AIT治疗相关的不良反应,主要为寒战发热、头痛、头晕、恶心或心动过速。尚未见与AIT相关的感染、肝功能衰竭、自身免疫性疾病或死亡的报道。结论:辅助AIT治疗能降低HCC患者术后1年的复发率,但对改善生存率及远期复发率无明显作用。由于本研究纳入病例数较少,无法确定偏倚对结论可靠性的影响程度,因此,有必要开展多中心大样本及长期随访的随机对照试验来进一步证实。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。