陆春雪, 张淑兰, 林蓓, 高红[1]2004年在《分析人雄激素受体基因判断子宫颈癌及子宫颈上皮内瘤变组织的克隆状态》文中研究表明目的 通过分析人雄激素受体 (humanandrogenreceptor,HUMARA)基因 ,检测宫颈癌及宫颈上皮内瘤变 (CIN)组织的X染色体失活方式 ,从而判断其克隆状态。方法 对 2 6例宫颈浸润性癌 (宫颈癌组 )、31例CIN(CIN组 )及 33例正常宫颈 (正常宫颈组 )组织标本 ,提取其DNA ,经甲基化敏感性限制性核酸内切酶HhaⅠ消化后 ,对HUMARA基因片段行PCR扩增并电泳 ,通过观察电泳条带判断其克隆状态。结果 HUMARA基因的杂合率为 89%。宫颈癌组、CIN组及正常宫颈组组织的单克隆率分别为 92 %、38%和 10 % ,宫颈癌组分别与CIN组及正常宫颈组比较 ,差异均有极显着性 (P <0 0 0 1) ,CIN组与正常宫颈组比较 ,差异有显着性 (P =0 0 12 )。宫颈癌组中 ,临床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期组织的单克隆率分别为 6 / 7、90 % (9/ 10 )及 7/ 7,两两比较 ,差异均无显着性 (P >0 0 5 )。CIN组中 ,CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ组织的单克隆率分别为 2 0 % (2 / 10 )、38% (3/ 8)及 6 3% (5 / 8) ,呈逐级增高趋势 ,但各级CIN间比较 ,差异均无显着性 (P >0 0 5 )。结论 宫颈癌是癌细胞克隆性增殖的结果。对单克隆状态的CIN应给予积极干预或严密随访。HUMARA基因分析可能成为研究宫颈癌发生机制的一种分子生物学检测手段。
陆春雪[2]2003年在《HUMARA分析方法检测宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的克隆状态》文中进行了进一步梳理前言 在胚胎发育早期，女性体细胞的两条X染色体中，随机地有一条发生失活，因此正常女性组织的X染色体失活方式为随机性。理论上肿瘤是单个恶变细胞的克隆性增殖而形成，其X染色体失活方式应为非随机性。X染色体失活方式分析(简称X失活分析)是检测人类肿瘤克隆状态的最佳手段。人类雄激素受体基因(HUMARA)分析是目前分析X失活最常用的方法。本研究利用HUMARA分析检测宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(CIN)的克隆状态，以期为研究宫颈癌及CIN提供一种新的分子生物学手段。 材料与方法 一、标本与来源 采集2001年7月～2003年1月于中国医科大学第二临床学院及辽宁省肿瘤医院妇科门诊宫颈活检及住院手术病例的新鲜宫颈组织。其中实验组为宫颈浸润癌26例(Ⅰ期9例，Ⅱ期10例，Ⅲ期7例)；CIN31例(CINⅠ级12例，CINⅡ级10例，CINⅢ级9例)；对照组为正常宫颈33例。标本离体后，立即置-70℃冻存待测，所有病例均经病理学诊断核实。 二、实验方法 1．常规酚-氯仿-异戊醇方法提取组织DNA。 2．HhaI酶消化：取2只微量离心管，每管各加入10μl DNA溶液，实验管加入10U／μl的HhaI酶2μl，10×M Buffer 4μl，蒸馏水4μl，制成20μl反应体系；对照管加入10×M Buffer 4μl，蒸馏水6μl，制成20μl模拟反应体系。37℃水浴箱过夜孵育后，70℃加热20分钟以终止反应。 3．PCR扩增：PCR弓物为 5”－TCC AGA ATC TGT TCC AGAGCG TGC—3”和 5”一 GCT GTG AAG G’IT GCT Gh CCT CAT—3；扩增片段长度为255－315hp。25gi反应体系中含模板 DNA sgl，0．lug／PI弓物各 0．2…，2．SInM dNTPZ…，SU／… Taq酶0．2…，10 x Buffer 2．5…，dd·H。O 14．9…。扩增参数：94℃ 3 dn预变性，94t 45 s变性，60t Indn退火，72℃二 dn复性，40个循环后，72℃ 7min延伸。 4．6％变性聚丙烯酸胺凝胶200V电泳4－5 h，凝胶通过银染成像。 5．结果判定：组织DNA在未被酶切的状态下做PCR，产生两条带者为杂合子，对克隆状态分析可提供信息；只产生一条带者为纯合子，对克隆状态分析不能提供信息。杂合子病例的组织DNA被酶切后做利R，若产生两条带，且其信号强度比值＞O．3，则判定为多克隆状态；若只产生一条带，或两条带的信号强度比值SO．3，则判定为单克隆状态［’］。 6．统计学处理：采用 SPSS．0软件进行统计学处理。各组间比较采用 X‘检验或 Fishers确切概率法。 结 果 1．HUMARA的杂合率为88．9％。 2．gi．7％的宫颈癌38．5％的 CIN及 10％的正常宫颈呈单克隆状态，各组间比较人＜o．05，差异有显着性。 3．I、11、Ill期宫颈癌的单克隆率分别为 85．7％J0％及1＊阮，各组间比较，P＞o．05，差异无显着性。 4．CIN、11J级的单克隆率分别为 20％37．5％及 62．5％，呈逐级上升趋势，但各组间比较，P＞o．％，差异无显着性。 ·2· 讨 论 一、克隆状态分析与HUMARA分析 在胚胎发育早期，女性体细胞的两条X染色体中，随机地有一条发生失活，因此正常女性组织的X染色体失活方式为随机性。理论上肿瘤是单个恶变细胞的克隆性增殖而形成，其X染色体失活方式应为非随机性。X失活分析是评价人类肿瘤克隆状态的最佳手段。 HUMARA分析目前是大多数学者分析X失活最常用的方法。HUMARA定位于Xcen－ql3，其第1个外显子的编码区含有高度多态性的 CAG重复序列，编码门一31个甘氨酸残基，在这一多态性短串联重复瞩TR）上游100碱基对左右处，有甲基化敏感性限制性核酸内切酶Hpa 11和 Hha位点，该位点处于甲基化状态时，X染色体是失活的，因此可以通过分析HUMAM的甲基化状态来推测X染色体失活方式，从而判断组织的克隆状态。本研究中HUMARA的杂合率为 88．9％。HUMARA片段的高杂合率使得可以对绝大多数病例通过HUMARA分析检测其克隆状态。 二、宫颈癌的克隆状态及其意义 本研究中，宫颈癌组的单克隆率为gi．7％，明显高于CIN组及正常宫颈组，提示宫颈浸润癌是癌细胞克隆性增殖的结果。HUMARA分析作为目前检测克隆状态的最佳方法，可能成为宫颈癌诊断和鉴别诊断的又一辅助手段。各期宫颈癌的单克隆率比较无统计学差异，提示宫颈癌的癌细胞克隆性增殖先于其浸润性生长而发生。 叁人IN的克隆状态及其意义 本研究中，CIN组的单克隆率为38．5％，高于正常宫颈组，提示一部分CIN已具备了细胞异常增殖的能力。但大多数CIN仍 ·3·呈多克隆状态，提示大多数CIN中的异型细胞可能来源于不同的祖先细胞，这符合CIN多中心性的特点。CIN＊＊ 级的单克隆率分别为20％、37．5％及62．5％，有逐级增高趋势，推测可能单克隆状态的CIN异型细胞的异常增殖能力更强，发展为浸润癌的可能性更高；而多克隆状态的CIN，其细
韩扬[3]2007年在《宫颈鳞癌前驱病变的克隆性及HPV16E6基因整合和P16表达的研究》文中指出背景:宫颈癌是世界范围内威胁女性生命的第二大恶性肿瘤。近年来,我国宫颈癌发病率呈上升趋势,发病年龄趋于年轻化。宫颈癌的发生是多基因参与的多步骤的病理过程,其前驱病变称为宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN),包含CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ(含原位癌)。CIN的发生与进展存在着很多不确定因素,且临床表现多样性:(1)CINⅠ(低级别)中有20%病例可进展为CINⅡ/Ⅲ(高级别),50%-60%的可自发性消退;而40%-50%的CINⅡ/Ⅲ可进展为浸润癌。但细胞学和组织学难以鉴别自发性消退或发展为浸润癌的病变。(2)宫颈癌的发生与高危HPV感染有关。尽管大多数CIN患者有HPV感染,但仅有少数病例可发展为浸润癌。因此,紧密结合CIN病理诊断和临床治疗需要,评价促进CIN发生与进展的风险因子,使CIN分级更符合其生物学行为,以提高对CIN患者治疗的合理性、治愈率和生活质量,防止对CIN过度治疗或治疗不足,对实现宫颈癌的早期防治具有重要意义。目的:研究CIN的克隆性特征及人乳头瘤病毒HPV16(human papillomaviroustype16,HPV16)E6基因整合状态和P16蛋白表达情况,探讨这些分子变化与CIN病理分级的相关性及其意义。方法:从同济大学附属东方医院病理科存档的2000—2005年活检或手术切除的宫颈标本中,随机选取150例,其中CINⅠ33例,CINⅡ38例,CINⅢ34例,宫颈鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)45例。另选取非宫颈病变切除的宫颈组织20例为对照组。所有标本经4%中性甲醛溶液固定,石蜡包埋切片,单个位点显微切割病变组织及其间质,常规方法抽提基因组DNA。(1)巢式PCR扩增位于人类X染色体上的AR基因,PAGE电泳检测病变的克隆性。(2)以通用引物GP5+/GP6+扩增HPVL1区;多重PCR同时扩增HPV16的E2、E6基因,分析HPV16的存在状态。HPV16 E2或E6阳性提示HPV16感染,HPV16 E2/E6比值接近或大于1,为HPV16游离型;HPV16E2/E6比值明显小于1,为HPV16游离、整合混合型;仅为HPV16 E6阳性,为HPV16E6完全整合型。(3)免疫组织化学(Envision法)检测P16在CIN的表达,分析其分布特征。(4)采用SAS8.0软件进行统计分析。结果:本组150例样本中,成功扩增139例,其中纯合子12例,杂合子127例,杂合率91.4%。(1)各组病变单克隆率:对照组为0例、CINⅠ组为26.9%(7/26)、CINⅡ组为51.5%(17/33)、CINⅢ组为82.1%(23/28)、SCC组为85.0%(34/40),单克隆率随CIN病变级别增高而增加(χ~2=16.492,P=0.0003)。(2)各组HPV16阳性病变分别为:对照组2例、CINⅠ组8例、CINⅡ组13例、CINⅢ14例和SCC组29例;其中HPV16E6的整合率分别为:正常组为0、CINⅠ组25%(2/8)、CINⅡ组30.8%(5/13)、CINⅢ组64.3%(9/14)、SCC组79.3%(23/29),HPV16E6基因在各级CIN中的整合率不同,其差别有统计学意义(χ~2=6.747,P=0.034)。HPV16E6基因整合与CIN的单克隆性呈正相关(χ~2=7.768,P=0.0053,r=0.36)(3)P16在CIN病变中表达程度不一,在CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ中的阳性率分别为69.2%(18/26)、87.9%(29/33)和92.9%(26/28),其差别有显着统计学意义(χ~2=20.1,P＜0.0001)。其中CINⅠ组有50%(13/26)的病变为P16阳性细胞的局灶分布,CINⅡ组有42.5%(14/33)的病变为P16阳性细胞在上皮基底旁连续分布,而CINⅢ组67.9%(19/28)的病变中P16阳性细胞在上皮全层弥漫分布,该分布特征差别有统计学意义(χ~2=21.996,P＜0.001)。SCC组P16阳性率为97.5%(9/40),其中90%(36/40)为P16弥漫阳性。相关分析表明P16在各级CIN中的分布特征与HPV16的整合有关(χ~2=4.36,P=0.037,r=0.37)。结论:(1)单点显微切割克隆性分析结果表明,本组病例中少部分CINⅠ、绝大部分CINⅡ/Ⅲ是单克隆性病变;发现单克隆性特征与CIN分级密切相关,随着CIN由低级别向高级别CIN进展,单克隆性的发生频率增加,提示单克隆性CIN具有肿瘤属性。(2)HPV16E6基因整合与CIN分级相关,提示HPV16病毒癌基因的整合参与CIN的发生与进展,是宫颈SCC早期发生的关键步骤。(3)P16在CIN中表达增高,且呈不同的分布特征,与CIN的分级相关;P16阳性细胞的分布特征与HPV16的整合密切相关,提示P16是对CIN分级和宫颈鳞癌前驱病变生物学评价的有效标志物。
参考文献：
[1]. 分析人雄激素受体基因判断子宫颈癌及子宫颈上皮内瘤变组织的克隆状态[J]. 陆春雪, 张淑兰, 林蓓, 高红. 中华妇产科杂志. 2004
[2]. HUMARA分析方法检测宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的克隆状态[D]. 陆春雪. 中国医科大学. 2003
[3]. 宫颈鳞癌前驱病变的克隆性及HPV16E6基因整合和P16表达的研究[D]. 韩扬. 同济大学. 2007
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