赵鸿[1]2003年在《未成熟树突状细胞联合骨髓移植诱导大鼠异体肾移植免疫耐受的研究》文中研究表明器官移植作为现代医学的重大进步，已经广泛应用于治疗各种终末期器官功能衰竭的病人。然而移植排斥反应仍然是目前器官移植领域的最大难题。免疫抑制剂的使用虽然降低了排斥反应的发生率，但是却带来许多难以克服的副作用。目前移植学界普遍认为解决移植排斥反应的最终出路在于诱导受体产生免疫耐受。免疫耐受作为一种特殊的免疫应答，其诱导方式具有一定的复杂性。T细胞处于免疫排斥反应中心环节，其激活过程一方面需要TCR与MHC-多肽复合物的特异性结合，另一方面还需要共刺激通路的信号放大作用。未成熟树突状细胞表面缺乏B7-1、B7-2和CD40等共刺激分子，在异体移植时，不能有效递呈抗原，激活T细胞，导致免疫耐受的形成。未成熟树突状细胞被视为诱导免疫耐受的有效手段。另一方面，大量临床观察和实验已经证实异基因嵌合体与成功的免疫耐受之间关系密切。骨髓细胞中含有大量造血干细胞，具有很强的增殖与分化潜能，容易形成嵌合体而诱导免疫耐受。因此骨髓移植也被视为诱导免疫耐受的重要手段之一。鉴于此，我们考虑在大鼠异体肾脏移植模型上，利用供体来源的未成熟树突状细胞诱导受体T细胞低应答的特性，在这一短暂的免疫低反应期内，联合骨髓移植，使得异基因细胞在受体内生存并繁殖，从而建立稳定的免疫耐受状态，为临床延长移植肾脏存活时间提供新思路。第一部分 体外未成熟树突状细胞的培养、鉴定和功能评价目的：体外采用抑制性细胞因子白介素－10（IL-10）抑制树突状细胞成熟过程，观察未成熟树突状细胞的表型和体外免疫调节功能，为进一步诱导大鼠异体肾脏移植免疫耐受提供理论依据和治疗手段。方法：1. 大鼠骨髓细胞的制备：无菌取大鼠胫骨和股骨骨髓，0.83% Tris-NH4Cl溶液使红细胞充分溶解。离心后重复洗涤一次。调整细胞浓度为2×108/ml备用。<WP=7>2. 未成熟树突状细胞的培养：按上法取新鲜骨髓细胞，经小鼠抗大鼠系列单抗和补体，将剩余阴性选择的细胞加入正常人血清包板的培养皿中，1h后吸取上清中非贴壁细胞。含rrGM-CSF（10ng/ml）、rrIL-4（8ng/ml）的RPMI1640培养基调整细胞浓度至1×106/ml，置于1%明胶包板的6孔板中培养；培养至第5天，收集疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，按加入细胞因子不同分为两组：IL-4组， 继续在原培养基中培养；IL-10组，上述培养基中加入IL-10（10ng/ml），培养至第13天，收集细胞。3. 树突状细胞纯度和表型分析： 分别收集不同培养条件下树突状细胞，加入PE或FITC标记的抗大鼠CD80、CD86、OX6、OX62单克隆抗体，流式细胞仪（FACScan USA）进行表型分析。4. 树突状细胞吞噬功能分析：分别收集不同培养条件下树突状细胞，加入FITC-Dextran，置于4℃（对照组）和37℃（实验组）。2h后取出，流式细胞仪定量分析树突状细胞吞噬功能。5. 初次混合淋巴细胞反应：分别收集不同培养条件下Lewis大鼠树突状细胞，灭活增殖性，作为刺激细胞。取正常DA大鼠脾脏，尼龙毛吸附法制备纯化T细胞，作为反应细胞。刺激细胞与反应细胞按1:10、1:20和1:40混合培养，β-液体闪烁计数仪测定CPM值，计算刺激指数（SI）。6. 再次混合淋巴细胞反应：上述刺激细胞与反应细胞按1:10共同培养5天，作为再次反应细胞。Lewis、DA及无关第叁品系Wistar大鼠来源的脾淋巴细胞，灭活增殖性，作为再次刺激细胞。再次刺激细胞与再次反应细胞以1:1、1:2、1:4及1:8混合培养，做再次MLR。计算刺激指数（SI）。7. T细胞杀伤活性测定：利用51Cr释放实验测定CTL细胞毒效应。再次反应细胞作为效应细胞；Na251CrO4标记的Lewis、Wistar及DA大鼠来源的脾淋巴细胞作为靶细胞。效应细胞：靶细胞为20:1，γ计数仪测定CPM值，计算杀伤率。8. 树突状细胞培养上清IL-12水平检测:在树突状细胞培养不同时间分别收集IL-4组和IL-10组半量换液之离心上清，IL-12检测采用抗体夹心ELISA法。9. 初次反应细胞上清IL-2水平检测:细胞培养上清IL-2水平检测采用双抗体夹心ELISA法。结果：不同细胞因子刺激下和不同培养时间树突状细胞的生长情况和形态：大鼠树突状细胞呈现半悬浮生长状态。培养至第3天，可见部分细胞附壁生长，在第5天出现毛刺状细胞，随着培养时间的延长，IL-4组此类细胞数量增多，毛刺状突起更加明显，并逐渐脱壁；至第13天，可以观察到形态<WP=8>1. 均一、毛刺状聚集成簇的成熟树突状细胞；IL-10组树突状细胞毛刺状和聚集体不明显，仍停留在未成熟状态。2. 树突状细胞表型分析： IL-4组及IL-10组树突状细胞在培养结束时表面表达OX62（大鼠树突状细胞表面标志）的细胞比率分别为82.3%±6.7%和79.6%±4.6%，两组比较，无明显差异（P>0.05），说明利用IL-10不影响树突状细胞分化与扩增，可以获得较高纯度的未成熟树突状细胞。IL-4组共刺激分子CD80和CD86表达水平分别为60.2±7.1％和72.4±8.3％，MHC-II类分子OX6表达水平为61±4.5％；IL-10组树突状细胞表面CD80和CD86表达水平分别为25.3±4.6％和42.4±5.2％，OX6表达水平为32.3±9.6％；两组比较，差异具有显着性（P<0.01），说明IL-10能够抑制树突状细胞的成熟过程，阻断其表面共刺?
赵鸿, 王翔, 张元芳, 丁强, 瞿连喜[2]2005年在《未成熟树突状细胞联合骨髓移植诱导肾移植大鼠免疫耐受及其机制》文中研究说明目的 供体来源未成熟树突状细胞输注联合骨髓移植,诱导异体肾移植大鼠产生免疫耐受,并探讨其 机制。方法 肾移植大鼠分为5组:阴性对照组、未成熟树突状细胞组、骨髓移植组、联合诱导组、环磷酰胺组。 51Cr释放实验测定大鼠细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞毒效应;ELISA检测脾细胞培养上清IL-4、IFN-γ、TGP- β水平。结果 阴性对照组肾移植大鼠的平均存活时间(MST)为(7.12±1.25)d,未成熟树突状细胞组为(24.38 ±3.20)d,骨髓移植组为(7.87±2.1)d,环磷酰胺组为(18.13±2.36)d,而联合诱导组延长到(80.75±16.88)d, 与上述4组比较,均存在显着性差异(P<0.01)。耐受组大鼠(CTL)杀伤率低于排斥组(4.3±1.0)υs(39.6± 4.4),(P<0.01)。耐受组大鼠脾细胞培养上清IL-4和TGF-β水平为(185.44±32.17)ng／L和(716.82± 197.62)ng／L,高于排斥组(P<0.01);而IFN-γ水平为(532.78±34.54)ng／L,低于排斥组(P<0.01)。结论 术前供体来源未成熟树突状细胞输注联合骨髓移植,可成功诱导受体大鼠产生免疫耐受,其机制可能与特异性 CTL无能及TH1／TH2/TH3细胞因子网络的免疫偏离有关。
闫峰[3]2007年在《TGF-beta DC诱导调节性T细胞在角膜移植排斥反应中作用的实验研究》文中研究表明目的角膜移植是治疗不可逆性致盲性角膜病变的最有效的治疗手段,也是成功率最高的固体器官移植手术。尽管眼具有“免疫赦免”功能,但移植排斥反应仍是导致角膜移植手术失败的首要原因。由于角膜移植片在结构上直接与前房相连,移植片的存活时间被认为与植片中异体抗原诱发的前房相关性免疫偏离(anterior chamber–associated immune deviation ,ACAID)能力紧密相关。房水中含有多种免疫抑制因子,如TGF-β可促使树突状细胞(dendritic cells,DC)维持在不成熟状态,当这种不成熟型DC在眼内摄取异体抗原后迁移至脾脏内,在NKT细胞和B细胞存在的条件下,将促使某些抗原特异性T细胞转化成为调节性T细胞(regulatory T cells,Treg),抑制迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity, DTH)。近年来,人们对T细胞的免疫调节作用有了新的认识和兴趣,意识到抑制性调节性T细胞的存在,并认为这群调节性T细胞在诱发移植耐受和治疗自身免疫性疾病中起关键作用。目前Treg被定义为两类,一类为胸腺来源的天然Treg(natural regulatory T cells/nTreg or innate Treg);另一类为外周诱导产生的获得性Treg(inducible regulatory T cells/iTreg or adaptive Treg)。最近越来越多的过继转移实验研究认为,CD4+CD25+Treg可以推迟甚至治疗同种异体移植物排斥反应,在诱发移植免疫耐受中作用显着;因此,认为天然CD4+CD25+Treg被认为可以作为过继转移细胞,在治疗器官移植排斥反应和自身免疫性疾病方面具有巨大的临床应用潜能。但是目前主要有叁方面的原因限制了CD4+CD25+Treg的临床应用。首先,天然CD4+CD25+Treg的数量非常少,仅占外周CD4+T细胞的4%～10%;其次,关于CD4+CD25+Treg抗原特异性的研究仍很缺乏,具有抗原特异性的CD4+CD25+Treg可能达到更有效地治疗目的,并能减少免疫治疗中的副作用;最后,关于CD4+CD25+Treg诱导免疫耐受方面的机制还不十分清楚。而眼的结构特征,为局部地或系统地研究Treg的免疫调节作用提供了一个新的平台。本研究的目的是通过建立小鼠角膜移植模型,研究同种异体角膜移植排斥反应中的Treg变化特点,探讨TGF-βDC诱导抗原特异性Treg的可行性,比较不同来源Treg对角膜移植排斥反应免疫抑制作用的异同,为临床有效调控、治疗角膜移植排斥反应及其他自身免疫性疾病提供重要的理论依据。方法1.建立小鼠原位角膜移植模型,临床观察比较自体和同种异体移植片的存活时间和排斥曲线;RT-PCR检测同种异体移植术后不同时间点植片内细胞因子mRNA的表达水平;自体或同种异体角膜移植后3d,流式细胞术分析(flow cytometric analysis,FACS)分析颌下淋巴结(submandibular lymph node,SMLN)、颈浅淋巴结(superficial cervical lymph node、SCLN)及脾淋巴细胞(splenic lymphocytes,SPL)中Treg的数量和表型。2.未成熟的树突状细胞(immature dendritic cells,iDCs)来源于小鼠骨髓(bone marrow,BM),在低浓度粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)培养条件下诱导生成,并联合0.2ng/ml TGF-β2下使DC维持在不成熟状态。iDC通过与供体来源的可溶性抗原(soluble antigen ,sAg)共孵育摄取供体抗原。将这种已摄取供体抗原的自体TGF-β2 DC或PBS经尾静脉注射给小鼠,3d后FACS分析TGF-β2 DC对SPL中Treg数量和表型的影响。3. FACS分别分析正常小鼠脾脏中CD4+/CD4+CD25+/CD4+CD25-叁个细胞亚群的表型;采用二步磁性细胞分选法(magnetic cell sorting,MACS)纯化小鼠脾脏CD+CD25+Treg,并对分离后的细胞表型进行鉴定。4. Balb/c小鼠分别给予PBS、TGF-βDC、天然Treg和获得性Treg,尾静脉注射,3d后进行同种异体原位角膜移植,临床观察植片存活时间和排斥曲线;FACS分析移植术后3d小鼠SPL中Treg数目和表型的变化。结果1.①自体角膜移植不发生排斥反应;所有同种异体角膜移植片在术后8d~24d均被排斥,平均存活时间为17.8±4.66d。②细胞因子表达水平在术后3d～1wk达到高峰,在此期间以TNF-α增高最为显著。③与自体角膜移植相比较,同种异体角膜移植术后3d ,小鼠SCLN和SPL中CD4+CD25+Treg细胞数量显着增高(P<0.01),占CD4+T细胞的比例分别达到9.29%和8.82%;SMLN、SCLN及SPL内CD4+CD25+Foxp3+细胞比例明显上升(P<0.01),其中CTLA-4+的表达有上升,但无显着统计学差异(P>0.05),而CD28+的表达有明显下降(P<0.05)。2. TGF-βDC提高了CD4+CD25+Treg细胞数量和功能:TGF-βDC诱导后,SPL中的CD4+CD25+细胞比例由5.52%上升至16.19% ( P<0.01 ),CD4+CD25+Foxp3+细胞比例也明显明显上升(P<0.01);CD4+CD25+细胞中CTLA-4表达由69.49%上升至84.29%(P<0.01),而CD28的表达由89.71%下降至67.13%(P<0.01)。3.①在这些CD25表达水平不同而划分的叁群正常小鼠天然CD4+T细胞,呈现出其它细胞表型表达的不同。Foxp3、CTLA-4、GITR、CD69在CD4+CD25+细胞亚群呈显着性高表达(P<0.01),CD4+CD25+T细胞主要存在于CD45RB低表达细胞亚群,CD28的表达在CD4+CD25+细胞亚群明显下降(P<0.05)。②使用二步MACS法从正常小鼠脾脏中分离CD4+CD25+T淋巴细胞的得率为1%～1.2%,获得纯度为87.29%～92.04%。FACS分析结果显示,Foxp3优先地表达于CD4+CD25+T细胞亚群(66.6±1.033%),而在CD4+或CD4+CD25-T细胞亚群呈低水平表达( 23.97±1.997%,16.78±3.24%);CTLA-4在CD4+CD25+T细胞亚群表达(77.37±1.67%)明显高于在CD4+(21.97±2.39%)或CD4+CD25- (18.04±3.16%)T细胞亚群的表达;纯化的CD4+CD25+T细胞亚群表现为CD127的低表达。4.①获得性Treg注射组显着抑制了同种异体角膜移植排斥反应:PBS注射组,所有移植片在术后10d～22d均发生排斥反应;TGF-βDC注射组,术后34d时1例发生明显混浊,术后38d时所有植片均发生排斥反应;天然Treg注射组,术后38d内植片保持透明,术后46d时所有植片均出现明显混浊;获得性Treg注射组,直至术后60d所有移植片未发现明显的排斥反应。4组角膜移植片的存活时间分别为16.50±4.3d、37.8±2.04、41.5±2.59和>60d,采用NPar检验说明4组间均有差别(P<0.05)。②同种异体角膜移植术后3d,小鼠SPL中CD4+CD25+、CD4+CD25+Foxp3+、CD4+CD25+CTLA-4+细胞比例在PBS注射组、TGF-βDC注射组、天然Treg注射组、获得性Treg注射组间有显着性差异(P<0.01)。对T细胞抑制功能的调节以获得性Treg注射组为着(P<0.01)。结论1.同种异体抗原是引起角膜移植排斥反应的重要的启动原因;小鼠同种异体角膜移植后颈浅淋巴结和脾脏中Treg细胞比例增高,可能参与了ACAID的形成机制。TNF-α是角膜移植术后局部参与调控的主要因子,它与Treg参与调控ACAID形成之间的关系有待进一步研究。2. TGF-βDC在体内可以有效地扩增Foxp3+CD4+CD25+Treg的数目和功能;结合第四部分的研究结果进一步说明Treg也参与了DC对角膜移植排斥反应的免疫调节作用。国内外文献未见报道。3.以CD25表达水平不同而划分的叁群正常小鼠体内天然CD4+T细胞,呈现出一些细胞表型表达的不同,如Foxp3,CTLA-4, GITR,CD45RB,CD69,CD28。MACS阴性加阳性二步分选法避免激惹CD4分子,可以获得高纯度的且具有天然CD4+CD25+ Treg细胞表型及功能特征的细胞。国内无类似报道。4.经诱导产生、以间接方式获取异体抗原特异性的Treg具有更强的抑制功能,更有效地抑制了角膜移植排斥反应,而且这种方法在未来临床免疫治疗上具有实用性。这是国内、外首次在移植排斥反应中比较了经DC体内诱导产生的Treg与天然Treg免疫调节作用的异同。
周浩[4]2007年在《耐受性树突状细胞的产生机制及其诱导移植免疫耐受作用的实验研究》文中提出研究目的:研究树突状细胞获得耐受性,成为耐受性树突状细胞的机制;研究耐受性树突状细胞在诱导移植免疫耐受中的作用及临床意义研究方法:(1)通过体外实验研究多种免疫调节因子使树突状细胞(DCs)获得耐受性,诱导其成为耐受性树突状细胞的机制。通过逆转录病毒转染Foxp3基因,在幼稚CD4+CD25-T细胞内强制性表达FOXP3蛋白,以获得CD4+ Foxp3+T细胞模型。通过流式细胞术研究转染后的CD4+ Foxp3+T细胞对树突状细胞的免疫共刺激分子影响。通过混合淋巴细胞培养了解树突状细胞的免疫功能改变。(2)构建人HLA-G1真核表达载体转染K562细胞并与DCs共培养后,流式细胞术检测DCs表面CD80,CD86,ILT3和ILT4分子表达情况,采用氚胸腺嘧啶核苷掺入法检测DCs对T细胞免疫功能的影响。(3)构建了包含人ILT4基因启动子的荧光素酶表达载体pGL3-ILTP并转染THP-1细胞,以研究IL-10作用下THP-1细胞表面免疫抑制性受体ILT4的表达变化及其所涉及的基因转录启动子区的调节机制。(4)肾移植术前采集供者来源PBMC在体外细胞因子诱导培养下成为供者来源DCs,与肾移植手术受者PBMC中分离出来的CD8+T细胞共培养,考察供者来源DCs与受者来源CD8+ T细胞的相互作用研究结果:(1)逆转录病毒转染Foxp3基因转染幼稚CD4+CD25-T细胞,成功建立了表达Foxp3的CD4+CD25-T细胞模型。强制性表达Foxp3的CD4+CD25-T细胞可以在体外发挥免疫抑制作用,诱导DCs表面CD80和CD86表达水平下调。体外淋巴细胞增殖试验显示Foxp3转染小鼠CD4+CD25-T细胞可以抑制DCs对异基因淋巴细胞的活化。实验证实转染Foxp3的CD4+CD25-T细胞对树突状细胞发挥作用依赖于细胞之间的直接接触。(2)膜表达的HLA-G1分子与DCs作用后,DCs表面免疫共刺激分子CD80,CD86表达下调,而抑制性分子ILT3,ILT4表达上调。HLA-G1作用后DCs作为异基因抗原刺激淋巴细胞增殖的活性明显下降。(3)成功构建了包含人ILT4基因启动子的荧光素酶表达表达载体pGL3-ILTP,通过流式细胞术以及半定量RT-PCR方法揭示,IL-10对单核来源THP-1细胞的抑制性受体ILT4表达存在促进作用,这在蛋白质水平和转录水平都得到了证实。通过双荧光素酶报告基因检测系统检测结果显示IL-10有增强ILT4启动子活性的作用。(4)处于移植耐受状态的肾移植患者外周血分离得到的CD8+T细胞其Foxp3的mRNA水平较其移植手术前的水平明显升高。将处于移植耐受状态的肾移植患者外周血分离得到的CD8+T细胞与其对应的供者来源的DCs共培养后,供者来源的DCs的ILT3和ILT4表达增强,呈现耐受DCs表型。研究结论:(1)Foxp3转染小鼠多克隆CD4+CD25-T细胞在体外诱导耐受性树突状细胞产生,耐受性DCs出现特征性表型,其抑制功能与诱导T细胞免疫不应答有关。(2)HLA-G1分子可以在体外条件下,下调DCs表面免疫共刺激分子水平,促进ILT3、ILT4表达,诱导免疫耐受性树突状细胞产生。(3)IL-10可以通过影响人类单核细胞白血病细胞系表达的免疫抑制性受体ILT4的启动子区活性来诱导耐受性DCs产生。(4)肾移植术后免疫耐受状态稳定的患者外周血存在CD8+Foxp3+T细胞亚群,可以诱导耐受性DCs产生,CD8+Foxp3+T细胞对耐受性DCs的诱导作用有抗原特异性。
苏纪权[5]2007年在《RNAi干扰树突状细胞CD40基因对移植排斥反应影响的体外研究》文中研究指明目的:探讨RNAi (RNA interference)技术沉默树突状细胞CD40基因,建立DC(Dentritic cells)细胞培养及转染方法,对体外脾淋巴细胞的影响,对IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10分泌的影响,为寻求治疗急性移植排斥反应提供基础研究。方法:1.DC细胞培养:培养参照Giannoukakis等报道的方法[Molecular Therapy 2000;1(5):430-437]。从Dark Agouti (DA)供体大鼠股骨中获取的骨髓细胞在含2ml RPMI-1640的24孔培养板(2×106/孔)中培养,其中含抗生素10%(v/v)小牛血清FCS。加入基因重组大鼠GM-CSF(20ng/mL)以扩增未成熟DC。除GM-CSF外,加入基因重组大鼠IL-4 (20 ng/mL)以获得成熟DC。在选定的培养孔,于培养开始时分别加入pSilencer1:U6-CD40 siRNA和pSilencer空白质粒转染细胞,以鉴定siRNA-CD40抑制由IL-4诱导的DC成熟的能力和其抑制DC中CD40基因表达的能力。每2天更换富含细胞因子的培养液;轻微旋动培养板后,吸除一半旧培养液,再加入等量且含细胞因子的新鲜培养液。因此,非贴壁的粒细胞将被清除又可确保那些已生长出的松散地附在弹性帖壁巨嗜细胞单层上的DC细胞簇不被同时移除。10天后收集那些自动从DC细胞簇离开的未帖壁DC。2.大鼠Silencer2.1-U6- siRNA-CD40重组质粒的构建与鉴定(1)siRNA靶位点的选择及编码siRNA DNA模板的体外合成根据GeneBank(AF241231)大鼠CD40基因mRNA的已知序列,寻找符合特征的靶序列,合成分别针对其叁个编码区合成两条DNA寡核苷酸链(分别命名为CD40 -1,-2,-3)并用RNA structure 4.11软件对其二级结构预测,每条模板链的组成包括19个碱基正义链和与其互补的19个碱基的反义链,正反链之间有9个碱基(TTCAAGAGA)间隔,反义链之后有5个T作为转录终止信号,在模板链的两端加入Hind III及BamH I酶切位点。合成两条链在退火缓冲液(100mM K-acetate, 30mM HEPES-KOH pH 7.4, 2 mMMg-acetate)作用下退火(90℃,3min,37℃,1hr),形成双链结构。待连接。(2)pSilencer2.1-U6载体线性化及回收pSilencer?2.1-U6 neo质粒:全长4521bp,含有U6启动子,氨苄抗性,含NEO基因,可由新霉素筛选稳定转染。pEGFP质粒:带有增强绿色荧光蛋白的原核克隆和表达载体,全长3.4kb,含有LacZ启动子,氨苄抗性;同时与Silencer2.1-U6-siRNA重组共转染,估计细胞体系的转染效率。将pSilencer2.1-U6用BamH I及Hind III分别消化,对消化后产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,将含有线性化质粒的凝胶在紫外灯下切下,放入1.5ml离心管中,加入3倍体积的融胶液,45℃-55℃水浴5-10min,使胶完全融化,加入10μl玻璃奶(通常1μgDNA用1μl玻璃奶),混匀,45℃-55℃冰水浴5-10min,其间每隔2-3min混匀一次,5,000转/min离心30-60s,弃上清,加入400μl洗液,轻弹管底,5,000转/min离心30s,弃上清,重复上述步骤一次,吸净洗液,室温干燥,加入10-30μl无菌双蒸水,将玻璃奶悬起,45℃-55℃水浴5-10min,10,000转/min离心1-2min,回收上清用λDNA mark做标准品定量,待连接。(3)载体与siRNA模板链连接连接体系中模板与载体的摩尔数比约为3-5:1,充分混匀,加入T4连接酶16℃反应过夜。连接产物可立即转化感受态细胞或于-20℃保存。同时进行空载体自身环化作为阴性对照。(4)感受态细胞的制备与连接产物的转化取-70℃保存的GM109大肠杆菌接种于平板,次日挑取单菌落接种于LB固体培养基中,370C培养过夜。用无菌签挑取单菌落,转到3mlLB液体培养基中,37℃300rpm振荡2h,取1ml菌液接种到100ml LB培养基中,37℃继续培养待OD600大约为0.4时取出,冰浴10min。将菌液转到灭菌的预冷50ml离心管中,4℃4000g离心10min回收细菌,重悬于10mlCaCl2(0.1mol/L)中,冰浴30min , 4℃4000离心10min ,弃上清,加4 ml预冷的CaCl2(0.1mol/L),置于4℃,16h后用于转化试验,或加入甘油至终浓度10%,-70℃保存备用。取100μl的感受态细菌,加入5μl pSilencer2.1-U6与siRNA连接产物,用空载体作对照,轻轻旋转混匀,冰浴30min,42℃热休克90s,快速放置冰浴中2min,加入800μl LB培养基(不含Amp),37℃振荡培养60min,吸100μl培养液滴于含Amp的LB平板涂匀,待表面液体吸收后,倒置平皿37℃培养16-20h。(5)阳性重组克隆的筛选(碱裂解法)15,000rpm离心10min,弃上清,加入冰冷的75%乙醇洗一次,离心室温干燥,用含RNase(50μg/ml)的双蒸水10μl充分溶解沉淀。用M13F(-40): 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3' Rev: 5'-GAGTTAGCTCACTCATTAGGC-3' primer测序。(6)重组质粒的转染DC细胞用RPMI1640培养基加10%小牛血清37℃,5% CO2培养。用100 ml培养瓶,当贴壁细胞达到80%-90%融合,用无血清培养基洗叁遍,将脂质体15μl加无菌水85μl室温放置10分钟,重组质粒18μg用无菌水加至总体积100μl室温放置10分钟,两者混合室温放置10分钟后加入细胞无血清培养液中,用pEGFP质粒与psilencer1.0-U6-CD40-siRNA按1:20的比例以慢病毒为载体共转染,以标记阳性转染的细胞;空质粒对照用psilencer1.0-U6质粒,另外一组只用脂质体加入培养细胞内;于转染后24-72小时,加G418(新霉素)进行稳定转染阳性克隆筛选,筛选21天后收集细胞,做Western blot分析。3.Western blot测定RNAi干涉后CD40基因在DC中的表达情况裂解RNAi干涉后的DC,用常规Western blot方法检测CD40表达情况。4.单向混合淋巴细胞反应(MLR)采用3HTdR掺入法。刺激物为RNAi干涉后的DC;反应物为Lewis大鼠的脾细胞。最后用自动液闪计数仪测定每分钟脉冲数值。5.通过ELISA的方法检测大鼠淋巴细胞分泌细胞因子的情况。6.统计学分析所得数据以均数±标准差表示,用SPSS软件包(10.0版)进行统计学处理,多组资料均数比较采用F检验,若差异有显着性,则进一步进行q检验。结果:1.成功从大鼠骨髓细胞中体外诱导培养出树突状细胞。2.通过感染含有RNAi序列的慢病毒可以抑制树突状细胞中CD40的表达。3.RNAi沉默后树突状细胞体外活化脾细胞的能力减弱。4.RNAi干涉后的DC活化的淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ的量显著减少结论:应用RNAi技术沉默DC上的CD40,切断第二信号传递使T细胞沉默,不被激活,达到抑制急性免疫排斥反应。
王炜[6]2005年在《RNAi阻断B7/CD28共刺激通路在小鼠心脏移植中的抗排斥反应作用》文中指出本课题应用RNAi技术修饰骨髓来源树突状细胞,通过抑制其CD80、CD86表达以阻断B7/CD28协同刺激通路,从中探讨诱导T淋巴细胞无能的机理;研究经RNAi敲减CD80、CD86后的供体来源树突状细胞在异体心脏移植中对移植物的保护作用及其抗排斥机制。比较具有免疫抑制作用的青藤碱单药与RNAi敲减DC治疗在小鼠异位心脏移植中的抗排斥作用。 第一部分 小鼠异位心脏移植模型的建立 目的 建立稳定的小鼠异位心脏移植模型。方法 采用显微外科技术将供心升主动脉、肺动脉分别与受体腹主动脉、下腔静脉行端侧吻合。实验中对Corry术式加以改进,即取供心时先集束结扎除升主动脉、肺动脉以外心脏所有血管再剪断升主动脉、肺动脉;切取供心后经升主动脉直接灌注冠脉系统;以结扎线替代血管夹阻断受体血管,扩大血管吻合操作空间。结果 定向实验阶段手术成功率85.7%,供体手术时间5.51±1.10min,受体手术时间56.91±5.23min,其中动脉吻合16.64±1.52min,静脉吻合8.79±1.49 min,供心缺血时间36.63±3.25 min。结论 失血性休克是受体死亡的重要原因,其中包括术中大出血和动脉吻合口出血。与其它小鼠实体器官移植模型相比,小鼠异位心脏移植手术操作较为简单,经短期练习即可熟练掌握,是器官移
于利[7]2010年在《全反式维甲酸诱导同种心脏移植耐受》文中研究表明目的全反式维甲酸(At-RA)是维生素A的代谢产物,它具有抑制炎症、调节免疫和诱导细胞分化等作用。而炎症和免疫因素是器官移植排斥反应的主要致病原因。因此,本研究在小鼠异位心脏移植模型上探讨At-RA对器官移植排斥反应的作用。方法本研究以C57BL/6小鼠为受体,BALB/c或C3H/He小鼠为供体建立了小鼠腹腔心脏移植模型。在急性排斥反应模型,从心脏移植前1天开始受体小鼠每天经口给予At-RA (3 mg·kg-1)或玉米油0.2ml,观察移植物存活时间。移植术后第7天,摘取供心行组织病理学、免疫组化和western blot检查。并摘取受体小鼠脾脏,分别用混合淋巴细胞反应、western blot和流式细胞术进行细胞增殖反应、细胞因子和免疫细胞的检测。在慢性排斥反应模型,对照组小鼠术后第1,3,5天腹腔注射CD154单克隆抗体MR1(10mg·kg-1),实验组小鼠在对照组的基础上从移植前1天开始每天经口给予At-RA (3mg·kg-1),连续给予60天,观察移植物存活时间。移植术后第100天,摘取供心行组织病理学、免疫组化和PCR检查。然后我们从经At-RA干预的移植物长期存活的受体小鼠分离CDllc+树突状细胞(DC),并将其过继转移到刚接受心脏移植的受体小鼠体内,观察移植物存活时间。移植术后第7天,收集受体小鼠的脾细胞,用流式细胞术进行免疫细胞的检测。结果在急性排斥反应模型,At-RA组的移植物存活时间比对照组显着延长(95.17±12.40天vs.9.67±0.62天,P<0.05),移植物排斥反应分级评分显着降低。与对照组相比,At-RA组受体小鼠的脾细胞对供体(BALB/c)脾细胞的增殖反应较低,但对第叁方(C3H/He)来源的脾细胞的增殖反应无差别。At-RA组受体小鼠的脾脏CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞(Treg)的比例显着高于对照组,而CD4+IL-17+ Th17细胞的比例显着低于对照组。At-RA组心脏移植物Foxp3的表达显着高于对照组。At-RA组受体小鼠的脾脏和心脏移植物TGF-β蛋白的表达显著高于对照组,而IL-6蛋白的表达显着低于对照组。At-RA组受体小鼠的脾脏CDllc+ DC表面CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表达较对照组显着降低。在慢性移植模型,At-RA组移植物的管腔阻塞率、内膜与中膜面积之比、移植物纤维化区域、CD4和CD8阳性细胞浸润以及IFN-γ和IL-10 mRNA表达较对照组均明显降低。CDllc+ DC过继转移显着延长了BALB/c来源的供心的存活时间,而没有延长C3H／He来源的供心的存活时间。并且CDllc+ DC过继转移小鼠的脾细胞的Treg细胞比例较对照组升高,但Th17细胞的比例降低。结论At-RA通过直接的和DC介导的对Treg和Th17细胞的调节作用延长了心脏移植物的存活时间,减轻了心脏移植物血管病变。本研究为临床应用At-RA治疗心脏移植物排斥反应提供了理论基础和实验依据。
邱涛[8]2013年在《沉默RelB的树突状细胞诱导移植免疫耐受》文中进行了进一步梳理研究背景实体器官移植是治疗终末期器官衰竭最有效的治疗方式,随着免疫抑制剂的发展,肾移植的5年存活率已得到显着改善,肝脏移植的远期疗效也取得长足进步。但现行的免疫抑制剂仍存在众多副作用,包括促使感染性疾病的发生,以及诱发移植后糖尿病,高血压,高血脂等,这些因素都影响患者生存质量,同时阻碍了受者、移植物的长期存活,而诱导免疫耐受是器官移植后最理想的一种存在方式。诱导对移植物的特异性耐受后可以减少抗排斥药的使用,避免各种毒副作用,延长受者,移植物的长期存活。目前树突状细胞(DC)是一类最具有潜力的运用于诱导免疫耐受的细胞,最初DC被认为是体内最强的抗原提呈细胞,诱导免疫应答,称之为反应性DC,新近又发现DC也可以诱导T细胞低反应性,这种DC被称作为调节性DC,但体内DC数量较少,且以反应性DC为主,如何体内外诱导耐受性DC的扩增,分化成为移植免疫耐受研究的热点。上世纪90年代以后利用细胞因子体外扩增DC的技术逐步成熟,从而为利用DC进行输注治疗提供了基础。研究目的采用小干扰RNA技术,体外制备RelB shRNA慢病毒,同时体外培养扩增小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC), RelBshRNA慢病毒转染DC诱导耐受性树突状细胞的产生,对转染后的耐受性DC的表型,凋亡,分泌细胞因子,以及耐受性DC诱导T细胞反应性研究,以及诱导T细胞低反应性的机制研究。利用RelB shRNA制备耐受性树突状细胞移植前输注预防心脏移植排斥反应。研究方法1、RelBshRNA转染DC后DC生物学形态,功能的改变利用慢病毒载体系统构建RelB shRNA慢病毒载体,制备纯化慢病毒颗粒。实验分组：未成熟组(imDC组),将获得的BMDC持续培养,避免LPS等外源性刺激；成熟DC组(mDC组),将获得的BMDC进行培养,在第7天用LPS刺激成熟；干扰载体对照组(LucR siRNA DC组),将获得的BMDC进行培养,于第5天感染干扰对照载体LucR-siRNA慢病毒,至第7天经LPS刺激成熟；RelB shRNA转染DC组(RelB shRNA DC组),将获得的BMDC继续培养,于第5天感染Re1BshRNA'慢病毒颗粒,至第7天,经LPS刺激成熟。慢病毒感染DC的MOI为50,在MOI为50时,经荧光显微镜和流式细胞仪检测感染阳性率达到92%以上。LPS刺激成熟的浓度为50ng/ml。RT-PCR和Western-blot检测转染后DC中RelB的表达；利用流式细胞仪检测DC凋亡率以及DC表型分子MHC-2, CD80, CD86, CD83的表达；ELISA检测转染后的DC分泌的细胞因子IL-10, IL-12, TGF-β1; ELISA检测转染后的DC胞核NF-KB各亚基的DNA结合活性。2、RelB shRNA转染DC后诱导T细胞低反应性研究利用RelB shRNA慢病毒转染DC获得耐受性树突状细胞。RelB shRNA-DC同同种抗原特异性T细胞(BABL/C来源)进行混合淋巴细胞反应(第1次MLR),将第1次MLR获得的T细胞同相同特异性抗原以及第叁方抗原来源(C3H来源)的DC进行第2次MLR, MTT法检测两次MLR后T细胞增殖能力,ELISA检测第1次MLR后分泌的细胞因子IL-2,IFN-γ,IL-10和IL-4水平；流式细胞仪检测反应后T细胞凋亡率以及T细胞分化为CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比率。3、RelB shRNA-DC移植前输注预防心脏移植急性排斥反应建立小鼠腹部心脏移植模型,实验分为4组,每组10只小鼠,未输注组：受体BABL/c小鼠心脏移植前后无任何特殊处理；不成熟组：受体BABL/c小、鼠心脏移植前7d经尾静脉输注培养7d但未作其他处理的DC(体外不成熟DC)；空载体组：受体BABL/c小鼠心脏移植前7d经尾静脉输注供体C57BL/6小鼠来源的空载体转染DC; RelB shRNA组：受体BABL/c小鼠心脏移植前7d经尾静脉输注供体C57BL/6小鼠来源的RelB shRNA转染DC。观察移植后小鼠心脏存活时间；移植后7天各组各取2只小鼠,切除移植物,行HE染色检测排斥反应程度。结果1、相比于imDC组,mDC组,LucR siRNA DC组,RelB shRNA DC组低表达RelB mRNA和RelB蛋白；RelB shRNA DC组的凋亡率同其余叁组无差异；MB shRNA可下调DC表型分子MHC-2, CD80, CD86, CD83的表达；转染后的DC低表达IL-12,高表达IL-10, TGF-β1表达无差异；RelB shRNA抑制了核内RelB的DNA结合活性,但不影响p50、p52、RelA (p65)、c-Rel的DNA结合活性。2、mDC组和LucR siRNA DC组有较强的刺激同种T细胞增殖能力,imDC组和RelB shRNA DC组DC刺激同种T细胞增殖能力明显减弱；RelB shRNA转染DC能诱导同种T细胞抗原特异性低反应性,但对第叁方抗原无特异性地反应性。MLR后T细胞分泌低水平的IL-2,IFN-γ,分泌高水平的IL-10和IL-4；RelB shRNA-DC诱导T细胞凋亡率增加；诱导T细胞向CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞分化增加。3、小鼠心脏移植模型中,预先输注供体来源的RelB shRNA-DC可延长移植物存活时间,降低排斥反应发生程度。结论1、利用RelB shRNA慢病毒体外转染树突状细胞使MHC-2, CD80, CD86, CD83呈低表达,分泌抑制性细胞因子,而不影响DC存活以及其它功能。2、RelBshRNA慢病毒转染DC获得的耐受性DC诱导T细胞特异性低反应性,主要机制是诱导T细胞凋亡,诱导T细胞向调节性T细胞分化,分泌的细胞因子由Thl型向Th2型转变。3、在心脏移植模型中,移植前输注RelB shRNA-DC可预防移植物急性排斥反应,降低排斥反应程度,延长小鼠存活期。
刘玉杉[9]2001年在《一种生物型免疫抑制剂——可溶性肿瘤坏死因子α受体I基因治疗移植的实验研究》文中认为急慢性排斥反应是影响器官移植近远期效果的最主要原因，根本的解决出路之一是寻找诱导抗原特异性耐受或实现抗原特异性抑制的治疗方法和策略。器官移植物的基因治疗和基因修饰的耐受性树突状细胞(dendritic cell，DC)诱导免疫耐受的相关进展为临床器官移植提供了极具潜力的治疗方法。尝试应用免疫抑制性调节分子基因修饰移植器官进行局部免疫调控或基因修饰树突状细胞诱导免疫耐受已成为移植研究领域的主攻方向之一。 树突状细胞(DC)是功能最强大的专职抗原提呈细胞，DC提呈抗原方式的免疫性或耐受性决定了DC既可以启动免疫反应也可以诱导中枢性或外周性免疫耐受。成熟或活化的DC可以启动正向免疫反应，未成熟DC或DC前体则显示了耐受性。通过免疫抑制分子的基因修饰能够使DC潜在的耐受原性得以放大，候选基因包括vIL-10、TGF-β、CTLA4-Ig、FBL-3、IFN-γdR和FasL等。 肿瘤坏死因子-α(turnor necrosis factor-α，TNF-α)是多能的前炎症细胞因子，由激活的单核细胞和巨嗜细胞，活化的T淋巴细胞和树突状细胞所产生，具有广泛的生物学活性。TNF-α是介导同种免疫应答反应的关键因子，在急、慢性同种排斥反应的各个阶段均有TNF-α的合成和释放，介导排斥反应的发生发展。TNF-α的生物活性是由细胞膜上的两种结构相关但功能完全不同的受体介导，分别为TNFR-I(55KD，p55-)和TNFR-Ⅱ(75KD，p75-)。近来的研究显示TNF／p55TNF-R通路在TNF-α介导的同种排斥反应过程中具有重要作用；TNF-α具有促进DC前体发育成熟及活化DC的活性，阻断TNF-α的作用可抑制DC成熟与活化。因此，应用TNF-α的拮抗剂有可能预防和治疗排斥反应，TNF-α拮抗分子的基因有可能是修饰耐受性DC的又一个潜在的候选基因。 p55-和p75-TNFR受体均可水解形成可溶性TNF受体(soluble tumor necrosis factorreceptor,sTNFr)，相应的称为sTNFr-p55和sTNFr-p75。sTNFr具有中和和拮抗TNF-α的作用，是体内自然存在的TNF-α拮抗剂。据认为sTNFr是继可溶性IL-2受体之后又一个具有潜在临床应用价值的分子。 本研究利用小鼠血管化的心脏异位移植模型和基因转移技术，通过编码sTNFr-p55：Fc融合蛋白基因的腺病毒载体转染移植器官及DC前体，观察sTNFr-p55作为TNF-α拮抗剂的表达抑制器官移植排斥反应的效果及在体内、外产生耐受性DC的作用，探讨sTNFr-p55抗排斥效果及其基因修饰DC诱导免疫耐受的体内外机制。 第Ⅰ部分：改进的小鼠异位心脏移植模型(cuff法)建立与评价。 小鼠心脏移植模型是进行移植免疫学的理想动物模型。目前有腹部吻合法、颈部吻合法和颈部Cuff法叁种制作方法。本方法是在颈部cuff法的基础上加以改进的。将供者心脏连同肺部整块切除后，置于冰乳酸林格氏液中修整。内径0.6mm的cuff在修整时安装于供心的左肺动脉，内径0.4mm的cuff在术中安装于受者颈内动脉。术后排斥反应的判定通过直接触摸法和心电图法联合判断。本手术方法成功率可高达96％,平均手术时间40-50分钟。直接触摸法和心电图法联合判断准确率很高。BALB／C和C57BL／6小鼠是纯系的同种小鼠，具有不同的主要组织相容性抗原(MHC-Ⅰ、Ⅱ)，可进行同种排斥反应的免疫学研究。根据对BALB／C和C57BL／10小鼠互为供、受者进行移植的结果表明，在排斥发生时间上不同的鼠株移植组合存在差异(p＜0.05)，BALB／c小鼠的同种应答强度较C57BL／6小鼠为弱。本方法简单，可在短时完成多组实验手术，易于控制试验条件，排斥判定准确。一升生小型允友一刊爿一可沫位砷地怀死网子。央体！在困治疗的旧扳粪必研允 傅士企丈fllat＃：N）r＠MB：uwmFf＃ tSTNFrJ gM＃＄＄g DC MBbis＃RMk———————— DC处于不同分化发育阶段具有不同的提呈抗原方式。成熟DC高表达MHCJ 分子、CD80或 CD86及 CD40，具有强大的提呈抗原能力，可激活 nche T细胞，而未成熟 DC因表面分子的低表达，在提呈抗原时不能提供适宜的双信号刺激，可导致T细胞的无能或凋亡。许多因子包括GM－CSF、IL4、TGF－p及TNF－a等可影响骨髓细胞来源的DC的发育进程。研究发现人骨髓来源的CD34”单核细胞前体在GM－CSF的作用下发育为DC前体后，需TNFu的作用才能进一步发育成熟；阻断hF．a的作用可抑制DC成熟与活化。为了深入了解 hF－C对 DC分化成熟和活化的作用，我们将编码 SThFrp55＊C融合蛋白基因的腺病毒载体转染未成熟DC，通过阻断yF．a的作用，观察体外接受LPS、可溶性抗原及同种抗原的刺激对基因修饰的DC的成熟和活化的影响，探讨体外产生的耐受性DC在体内诱导免疫耐受的效果及机制。 用GM－CSF＋IL4的方法体外扩增C57BU6小鼠骨髓来源的DC，于第5天将STNFrp55基因的腺病毒转染未成熟DC，设Ad．LacZ修饰的DC及正常DC为对照组。观察有无LPS刺激对DC的表型、细胞因子（IL－12）分泌的影响；检测基因修饰后DC抗原递呈能力的改变；将基因修饰的DC与新鲜分离BALB／C小鼠的CD4＋T细胞作72小时MLR后，检测基因修饰的DC对同种CD4＼细胞的刺激能力，对培养上清中hl或ThZ细胞因子分泌水平进行了ELISA检测；观察基因修饰的DC
参考文献：
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