鸭疫里默氏杆菌gldL基因缺失株的构建及培养上清中免疫原性蛋白的鉴定

论文摘要

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipesifer,RA）是主要侵害鸭、鹅、火鸡等多种禽类的一种接触性传染病。本病在世界各地广泛分布,具有较高的发病率和死亡率,是当前严重危害养鸭业的主要传染病之一。随着对细菌毒力因子的深入研究,细菌分泌系统在细菌致病性相关研究中发挥着重要作用。近年来,随着Ⅸ分泌系统（T9SS）,又称为Por分泌系统在拟杆菌门成员中的发现,在GenBank上已公布的全基因组序列的鸭疫里默氏杆菌基因组中均存在完整的T9SS核心组分,研究该分泌系统在细菌与宿主的相互作用以及细菌的致病过程中的作用就尤为值得关注。本研究构建获得鸭疫里默氏杆菌Yb2株Ⅸ型分泌系统核心组分gldL的基因缺失株以及gldL-gldN基因双缺失株,并对缺失株进行了生物学特性分析。此外采用2-D蛋白质组合Westerm Blot等方法对Yb2株培养上清中具有免疫原性的蛋白进行了鉴定。1.鸭疫里默氏杆菌Yb2株gldL和gldL-gldN基因缺失株的构建及其生物学特性研究本研究通过扩增gldL基因左、右同源臂连入自杀质粒313,通过结合转导的方法导入鸭疫里默氏杆菌野生株Yb2,构建获得gldL基因缺失突变株Yb2△gldL;通过结合转导的方法导入鸭疫里默氏杆菌Yb2△gldN基因缺失突变株,构建获得gldL-gldN基因双缺失突变株Yb2△gldL-gldN。然后将野生株Yb2的gldL基因ORF与构建的大肠杆菌-鸭疫里默氏杆菌穿梭表达质粒pRES1相连接,通过接合转导的方法将重组质粒pRES1-gldL导入缺失株Yb2△gldL中,获得回复株cYb2△gldL。生物学特性分析的结果表明,与野生株Yb2相比,缺失株Yb2△gldL、Yb2△gldL-gldN和回复株cYb2△gldL的生长曲线无显著性差异;另外通过蛋白酶水解试验表明:缺失株Yb2△gldL和Yb2△gldL-gldN在含有脱脂乳的TSA平板上培养24h后无蛋白酶水解能力,通过雏鸭致病性分析以动物实验LD50的测定结果显示:缺失株Yb2△gldL、Yb2△gldL-gldN与野生株Yb2相比对雏鸭的LD50分别升高了 48、110倍左右;通过肝脏、脑、血液细菌载量的测定结果显示:缺失株Yb2△gldL、Yb2△gldL-gldN和回复株cYb2△gldL感染雏鸭体内肝脏、脑的细菌载量均比野生株Yb2显著性降低,表明缺失株Yb2△gldL、Yb2△gldL-gldN对组织的侵袭力下降。因此,以上结果证实gldL和gldL-gldN基因的缺失使Ⅸ型分泌系统的功能受损,从而使鸭疫里默氏杆菌对雏鸭的致病性降低。2.鸭疫里默氏杆菌Yb2株培养上清中免疫原性蛋白的鉴定采用TCA沉淀法在Yb2株上清液中加入10%的TCA,在酸性条件下从培养上清中鉴定到了 12种鸭疫里默氏杆菌Yb2株培养上清中具有免疫原性的蛋白。原核表达了 3种具有免疫原性的蛋白P1、P2和P3,经免疫雏鸭后攻毒试验,结果表明:P1蛋白对雏鸭抵御鸭疫里默氏杆菌感染具有一定的免疫保护性。为本研究鸭疫里默氏菌病新型疫苗的研制打下了基础。

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符号说明

文献综述

1 鸭疫里默氏杆菌的研究进展

1.1 概述

1.2 国内分离株的血清型

1.3 防治及临床诊断方法

1.4 相关毒力因子

2 细菌分泌系统

2.1 Ⅰ-Ⅸ分泌系统的研究进展

2.2 Ⅸ分泌系统的研究进展

3 蛋白质组学

3.1 蛋白质组学概述

3.2 蛋白质组学的研究

3.3 蛋白质组学在细菌学中的应用研究

3.4 蛋白质组学的展望

4 研究目的及意义

研究一: 鸭疫里默氏杆菌gldL基因缺失株的构建及其生物学特性分析

1 试验材料

1.1 菌株及其培养方法

1.2 主要载体与工具酶

1.3 主要培养基及试剂的配制

1.4 主要仪器

1.5 实验动物

2 方法

2.1 菌株的复壮

2.2 氯化钙法感受态细胞的制备

2.3 鸭疫里默氏杆菌基因组的提取

2.4 gldL基因缺失株的构建

2.5 Yb2△gldL缺失株回复株的构建

2.6 gldL和gldL-gldN基因突变株生物学特性研究

2.7 gldL和gldL-gldN基因缺失突变株致病性分析

3 结果与分析

3.1 gldL基因缺失株的构建

3.2 缺失株Yb2△gldL回复株的构建

3.3 gldL和gldL-gldN基因突变株生物学特性研究

3.4 gldL和gldL-gldN基因突变株的致病性分析

4 讨论

研究二: 鸭疫里默氏杆菌Yb2株培养上清中免疫原性蛋白的鉴定

1 材料方法

1.1 菌株和培养条件

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器及软件

1.4 缓冲液及试剂配制

1.5 SDS-PAGE浓缩、分离胶的配制

2 方法

2.1 菌株的复壮与培养

2.2 鸭疫里默氏杆菌分泌蛋白的提取

2.3 鸭疫里默氏杆菌分泌蛋白的样品的定量

2.4 Yb2株分泌蛋白进行Western Blot和SDS-PAGE电泳

2.5 双向（2-D）凝胶电泳

2.6 免疫印迹

2.7 胶内酶解

2.8 质谱分析

2.9 Yb2株P1、P2和P3蛋白的原核表达和纯化

2.10 蛋白的免疫原性分析

3 结果与分析

3.1 Yb2株培养上清中蛋白定量结果

3.2 Yb2株分泌蛋白Western Blot和SDS-PAGE电泳结果

3.3 Yb2株培养上清中蛋白的2-D电泳结果

3.4 免疫印迹结果

3.5 蛋白点的鉴定

3.6 Yb2株P1、P2和P3蛋白的原核表达和纯化的分析

3.7 免疫原性蛋白的免疫保护率测定

4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈妍

导师: 徐建生,胡青海

关键词: 鸭疫里默氏杆菌,基因缺失,分泌系统,培养上清

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 国家自然科学基金Ⅸ型分泌系统在鸭疫里默氏杆菌致病过程中的作用项目编号为:31772770

分类号: S852.61

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000422

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鸭疫里默氏杆菌gldL基因缺失株的构建及培养上清中免疫原性蛋白的鉴定

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