携带blaCTXM和1型整合子的IncFⅡ型质粒介导大肠埃希氏菌多重耐药性传播机制研究

论文摘要

大肠埃希氏菌（Escherichia coli,E.coli）是养殖环境中最常见的条件致病菌,可引起畜禽不同程度的感染。抗生素作为治疗用药和生长促进剂被广泛用于养殖业,使得细菌逐渐产生耐药性,甚至出现全耐药菌,更为严重的是这些细菌的耐药基因可以通过食物链,环境等途径在人与动物之间互相转播,造成严重的耐药基因污染,对养殖业和人类健康造成巨大的威胁。自超广谱β-内酰胺类抗生素大量使用以来,越来越多的细菌对其产生耐药性。超广谱β-内酰胺酶（ESBL）具有很强的酶活性,能水解头孢菌素,青霉素及单环β内酰胺抗生素氨曲南。能产ESBL的基因有很多,blaaCTXM其中最主要的基因型之一。本研究旨在探究畜禽养殖环境中大肠埃希菌的耐药状况及主要耐药基因,并对多药耐药菌的质粒进行精细基因结构分析。前期我们在畜禽养殖场中的粪便、尿液、土壤及周围水环境等样品中采集了大量菌株,分纯保种后进行16S菌种鉴定。最终得到大肠埃希氏菌206株,奇异变形杆菌48株,普罗威登斯菌32株。采用K-B法检测大肠埃希氏菌的耐药表型,结果表明养殖环境中的大肠埃希氏菌对四环素和头孢唑啉的耐药性较高,对替加环素和多粘菌素的耐药率最低。用建立的多重PCR检测技术检测耐药菌的耐药基因型,结果表明所有耐药菌株中共检测到6种超广谱β-内酰胺酶耐药基因,检出率从高到低依次为blaTEM、blaCTX-M、blaSHV、blaOAX-1、blaKPC和blaNDM。在耐喹诺酮类药物菌中检测到3种对应的耐药基因,检出率从高到低分别是qnrD、qnrB、和qnrA。在耐大环内酯类药物菌中检测到对应4种耐药基因,检出率从高到低分别为mphE,mphA,ermA和mphB。我们最终选定两株多药耐药菌进行深入研究:大肠埃希氏菌1709008和1710032,这两株菌都分离自养殖场猪粪便样品,耐药谱广,除了对替加环素和多粘菌素以外对其他抗生素几乎几乎都具有耐药性。通过改良Carba NP法检测菌株的产酶类型,利用VITEK 2检测技术检测菌株对抗生素的敏感性,利用接合转移实验验证细菌耐药性是否具有传播性并得到相应的接合子。用Qiangen质粒提取试剂盒从接合子中提取质粒DNA,构建mate-pair文库,利用二代测序技术进行测序。结果表明菌株1709008能产A型碳青霉烯酶,1710032能产B型碳青霉烯酶。接合转移实验表明这两株菌的耐药性具有移动性,得到的接合子对青霉素类,头孢菌素类和单环β-内酰胺类抗生素具有耐药性。对二代测序后的数据进行拼接分别得到两个多耐药质粒p1709008-CTXM和p1710032-CTXM。这两个耐药质粒都属于IncFⅡ型质粒含有负责编码复制起始蛋白的repA2-6-1-4结构。p1709008-CTXM和p1710032-CTXM都含有blaCTXM基因,且都由移动元件ISEcp1-blaCTX-M55-orf477介导其移动。ISEcp1不仅能使该结构发生整体移动,而且能够提供了强启动子促进blaCTX-M-55的表达。除此之外,这两个质粒都含有1型整合子In54提供耐药甲氧氨苄耐药基因dfrA17,磺胺类耐药基因sul1。大环内酯类耐药基因mph 由移动元件IS26-mph（A）-mrx-mphR（A）-IS6100 unit带入。四环素耐药基因tetA由转座子Tn1721提供。总的来说这两个质粒都具有复杂的嵌合体结构,不仅有负责质粒稳定性的骨架区组成,负责质粒水平转移的接合转移区,还具有含有大量耐药基因和移动元件的外源插入区。该研究证实畜禽养殖场细菌耐药性跟质粒有关,并且这种耐药性能够通过质粒的水平转移在细菌之间相互传递。

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ABSTRACT

第1章前言

1.1 养殖场环境中抗生素的使用

1.2 多耐药菌的危害

1.3 大肠埃希氏菌

1.4 细菌耐药性研究进展

1.5 产超广谱B-内酰胺酶耐药基因

1.6 介导耐药基因转移的移动元件

1.7 细菌耐药性检测方法

1.7.1 传统培养法

1.7.2 PCR检测

1.8 测序和比较基因组学

1.9 研究内容和意义

1.9.1 研究内容

1.9.2 研究意义

第2章养殖环境中大肠埃希氏菌的多重耐药传递性研究

2.1 材料

2.1.1 菌株来源

2.1.2 仪器与设备

2.1.3 试剂与培养基

2.2 方法

2.2.1 大肠埃希氏菌的分离与鉴定

2.2.2 K-B测定大肠埃希氏菌的耐药表型

2.2.3 改良CARBA NP法检测细菌产酶活性

2.2.4 耐药基因筛查

2.2.5 细菌耐药性传递实验

2.3 结果

2.3.1 大肠埃希氏菌的分离与鉴定结果

2.3.2 大肠埃希氏菌的耐药表型构成

2.3.3 三重PCR方法可靠性评价结果

2.3.4 耐药基因型筛查结果

2.3.5 碳青霉烯活性测定

2.3.6 接合转移实验结果

2.4 讨论

第3章多重耐药质粒的测序与基因组学分析

3.1 材料

3.1.1 菌株来源

3.1.2 仪器与设备

3.1.3 试剂与培养基

3.2 方法

3.2.1 基因组提取

3.2.2 基因组测序

3.2.3 质粒序列分析

3.3 结果

3.3.1 质粒P1709008-CTXM和P1710032-CTXM测序和精细注释

3.3.2 纳入分析质粒概况

3.3.3 质粒P1709008-CTXM和P1710032-CTXM的骨架区

3.3.4 P1709008-CTXM多药耐药区MDR-1分析

3.3.5 P1709008-CTXM多药耐药区MDR-2和P1710032-CTXM多药耐药MDR分析

3.4 本章小结

第4章总结与展望

4.1 总结

4.2 展望

参考文献

硕士期间发表论文

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 沈杨

导师: 韩剑众,曲道峰

关键词: 大肠埃希氏菌,多重耐药,型整合子,质粒

来源: 浙江工商大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 浙江工商大学

分类号: S852.61

总页数: 88

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