季海锋[1]2003年在《LPS持续刺激对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响及其机理初探》文中研究指明持续的严重感染是临床常见的病症。例如创伤、烧伤、休克等所致的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)通常伴有持续严重的内毒素血症，引起爆发性炎症反应，导致低血压、局部组织缺血和器官功能衰竭，如处理不及时则常导致病人死亡。这类病人具有明显特异性免疫功能低下的特征，这也是感染难以控制的原因之一，但其与持续严重内毒素血症的关系及具体机制尚不清楚。 内毒素(endotoxin)是存在于革兰氏阴性细菌胞壁外膜中的一种生物活性成分，在革兰氏阴性细菌感染的发病机制中起十分重要的作用，其主要毒性成分是脂多糖(lipopolysaccharide LPS)。LPS可以作用于抗原提呈细胞(antigen presenting cells APCs)，例如树突状细胞(dendritic cells，DCs)、单核巨噬细胞等，促使它们合成和分泌多种细胞因子和炎症介质，从而使机体产生多种病变，乃至感染性休克。 DC是目前已知的功能最强的专职抗原提呈细胞，具有刺激初始T细胞增殖的独特功能。DC按来源可分为髓样DC(myeloid DC)和淋巴样DC(lymphoid DC)，分别由骨髓CD34~+干细胞、外周血单核细胞以及淋巴细胞等在粒—巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage clony-stimulating factor，GM-CSF)的诱导下分化而来。出于容易诱导和扩增的原因，目前对于DC的研究主要集中在髓样DC，我们亦是以髓样DC为研究对象。成熟的DC表达高水平的Ⅱ类主要组织相容性复合体(MHC-Ⅱ)、共刺激分子(CD80、CD86)以及某些粘附分子等。成熟的DC还可将抗原提呈给T细胞，从而活化T细胞，启动免疫应答。基于DC的重要功能和在机体特异性免疫中居于的关键地位，我们设想持续严重感染时的LPS刺激可能会影响DC的分化发育和功能的成熟，从而影响机体的特异性免疫功能。 我们用本室已建立的方法分离小鼠骨髓细胞，用GM-CSF诱导其中CD34~+的干细胞分化成不成熟的BMDC。在此过程中用LPS持续刺激作为试验组， 第二军医大学硕士学位论文以模拟体内持续严重感染时LPS长期存在对DC成熟状态的影响；同时在培养过程中不加 LPS作为阴性对照，在培养的最后二天加入LPS作为一次性单次刺激的对照。培养7天后进行下述实验：①观察细胞形态的差异；②流式细胞仪检测细胞表型和细胞摄取抗原的能力：③＊＊ISA检测细胞产生的细胞因子；④混合淋巴细胞培养检测细胞提呈抗原的能力：⑤H。e。他o3258检测细胞凋亡水平：③用Western－blot检测信号转导分子的表达水平。结果如下： 一、LPS的持续刺激对DC表型和功能的影响。 大量研究证实，用一定剂量的LPS短期刺激不成熟的DC，可以诱导DC成熟。成熟DC表现为细胞突起增多，变长，胞浆中吞噬小泡减少，而溶酶体丰富，核呈分叶状；MHC－11、CD86、CD80、CD等表面分子表达升高；摄取抗原的能力较弱，刺激同种异基因淋巴细胞增殖能力增强。我们的研究发现，在用＊M－＊SF诱导骨髓干细胞向＊C分化的早期即持续予以1卜咖1＊PS刺激，可以影响DC形态、表型和功能的成熟，DC呈现不成熟状态：胞膜皱稻和突起少且钝；表达MHC－11、CD86、CD80、CDllC较成熟DC明显降低；摄取抗原（FITC标记的卵清蛋白）的能力较强；刺激同种异基因小鼠 T细胞增殖的能力明显较弱；向同基因T细胞提呈抗原并刺激其增殖的能力也较弱。我们又进一步检测了LPS持续刺激对DC分泌细胞因子的影响，结果发现LPS持续刺激的DC产生TNFa，n1 印70）明显较LPS单次刺激组少。以上结果提示，LPS持续刺激可维持DC处于不成熟状态。 二、LPS抑制DC成熟的机制。 我们又进一步探讨了持续LPS刺激维持DC于不成熟状态的可能机理。我们首先考虑是否由于成熟DC大量死亡仅保留不成熟DC。用Hoechst33258检测发现，LPS短期刺激发育晚期的DC，会导致DC细胞核出现大量荧光，而受LPS持续刺激的DC胞核仅出现少量荧光。因而提示，LPS持续刺激DC井不会导致DC大量死亡。 在信号转导方面，目前认为LPS是通过DC细胞膜上Toll样受体4（hR4）发挥作用的。TLR4可直接或间接地激活细胞内MAPK、PKC以及NF．h等多种信号转导通路，来调节细胞分化、生长、凋亡等作用。大量研究证实，LPS短期刺激不成熟DC，可以活化W－IcB。活化的NF－h家族成员进入细胞核， 4 第二军医大学硕士学位论文结合在某些基因操纵子的NF．oh基序上，从而启动相关基因转录，促使DC成熟。我们则从其余两条信号转导途径入手，用Western—Blot方法检测了PKCa、pl、pZ、5、S、n和＜亚型以及MAPK途径的ERKI、ERKZ和p38MAPK的表达，发现仅 PKC个在 LPS持续刺激的 DC中表达降低，而未能检出其余各分子的明显变化。提示，LPS持续刺激 DC导致的 DC成熟受抑制与 PKC十有关。 综上所述，本实验研究了在LPS持续刺激下，DC的表型和功能的变化，发现LPS持续刺激分化发育中的DC，会抑制DC的成熟和抗原提呈功能的发挥。而这种?
陈杰[2]2004年在《CpG-ODN持续刺激对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响及其机理初探》文中研究说明树突状细胞(dendritic cells，DC)是目前已知的功能最强的专职可以递呈细胞，具有激活初始T细胞增殖的独特功能，是特异性免疫应答的启动因素。其成熟状态是决定获得性免疫的启动和类型的关键因素，任何影响DC成熟的因素都直接影响免疫应答的启动和类型。 CpG-ODN(CpG-oligodexynucleotides)是来自细菌、病毒等等病原体基因组的非甲基化核苷酸序列，它和LPS等PAMPs一样具有明确的诱导DC成熟和较强的激活获得性免疫的功能。CpG-ODN主要通过Toll样受体9(TLR9)发挥刺激细胞的作用，而LPS主要通过TLR4发挥作用。本实验室最近的研究表明LPS持续刺激也能明显抑制DC的成熟及其免疫激活功能。由于LPS和其他感染因子之间存在交叉耐受现象，我们设想CpG-ODN和具他TLR配子一样可能具有类似的作用。因此，我们观察了CpG-ODN持续刺激对DC成熟及功能的影响，并探讨了CpG-ODN持续刺激维持DC不成熟的可能的信号转导机制。 我们用本室已建立的方法分离小鼠骨髓细胞，用GM-CSF诱导骨髓细胞向骨髓来源的树突状细胞(BMDC)增殖分化和成熟。在此过程中用CpG-ODN持续刺激作为试验组，以模拟体内持续严重感染时CpG-ODN长期存在对DC成熟状态的影响；在培养过程中不加CpG-ODN作为阴性对照，在培养的最后36小时加入CpG-ODN作为一次性单次刺激BMDC成熟的对照。培养7天后进行下述实验：①观察细胞形态的差异；②流式细胞仪检测细胞表型和细胞摄取抗原的能力；⑧ELISA检测细胞产生的细胞因子；④混合淋巴细胞培养检测细胞提呈抗原的能力；⑤Rhodamine123流式细胞仪凋亡检测；⑥细胞周期检测；⑦用Western-blot检测信号转导分子的表达水平。结果如下： (?)、CpG-ODN的持续刺激对DC表型和功能的影响。 大量研究证实，用一定剂量的CpG-ODN短期刺激体外培养的DC，可以诱导DC成熟。成熟DC光镜下表现为细胞突起增多，变长，贴壁疏松；MHCⅡ、CD86、CD40第二军医大学硕士学位论文等表面分子表达升高;摄取抗原的能力减弱，刺激同种异基因淋巴细胞增殖能力增强。我们的研究发现在用GM一CSF诱导骨髓细胞向BMDC分化的早期即持续予以2林g角llCpG一ODN刺激，可以抑制BMOC分化、增殖，在cpG一oDN持续刺激组中，BMne的数量明显减少((75士8.066)沐104/ml vs单次刺激组(226士一5.664)x ro」/ml和未刺激组(157士8.951462)Xro难/ml)，而巨噬细胞样细胞比例增加;助odaminel23检测细胞线粒体膜电位证明各组均无明显的细胞凋亡;提示BMDC数量减少并不是由于细胞凋亡引起。我们进一步用流式细胞仪初步检测了细胞周期，结果显示cpG一oDN持续刺激组中GZ期细胞明显增多，提示C声一ODN持续刺激可能延长了GZ期。CpG一oDN持续刺激可影响BMDc的形态、表型和功能的成熟，BMDc呈现不成熟状态:胞膜皱褶和突起少且钝;表达MHC 11、CD86、CD40较成熟BMDC明显降低;摄取抗原(FITC标记的卵清蛋白)的能力较强;刺激同种异基因小鼠T细胞增殖的能力明显较弱;向同基因T细胞提呈抗原并刺激其增殖的能力也较弱。我们又进一步检测了CpG一oDN持续刺激对BMDC分泌细胞因子的影响，结果发现CpG一ODN持续刺激的BMDC产生IL一1 Zp7o明显较CpG一ODN禅次刺激组减少。以!:结果提示，CpG一oDN持续刺激可抑制BMDc的分化、增殖，并维持BMDc处于不成熟状态。 一、cpG一oDN抑制DC成熟的机制。 目前认为:在TLR的信号转导中，活化的TLR其胞内段的TIR可招募MyD88，MyD88依次磷酸化IRAK4、IRAKI，形成IRAK一TRAF6复合物，最终激活NF一KB、P38MAPKs和.lun，导致DC共刺激分子的上调和细胞因子包括IL一12p70的分泌。但是DC对共刺激分J二表达、细胞因子分泌的调节不仅是多水平而且是多方面的。最近研究表明，包括PI3K、PKC、小G蛋白等多条信息转导途径参与了TLR信号的调控，通过正、负反馈的调节，精致地控制了DC的成熟和细胞因子的表达。我们通过westem一Blot方法检测了PKC的各亚型在cpG一ODN持续刺激和单次刺激的BMDc中的表达及磷酸化情况，初步探讨PKC在TLR信号调节BMDC分化、增殖和成熟过程中的信号转导。结果发现在PKC的表达方面，仅PKC日I、H在单次刺激的BMDC中增加，在持续刺激的Dc中有所降低，未发现其他各型包括。、6、。、月、明显变化，PKC日表达的减少可能是抑制BMDC分化的原因之一。对PKC在表达磷酸化情况检测发现磷酸化的PKe a zp和pan(包括a、pl、pxl、丫、6、。、屯、e)无明显变化，然而PKC犷的磷酸化水平在持续刺激的BMDC显着降低，由于磷酸化的PKC￡在LPS第止军医大学硕士学位论文刺激DC分泌IL一12P70起关键作用。PKC￡调节DC分泌IL-12的为TLR4和TLRg信号途径所共有。有趣的是，我们发现‘pKC6(Thrsos)在CpG一oDN持续刺激的De中磷酸化程度显着高于未刺激组和单刺激组，PKC6(Ser643)则无差别。由一J二PKC6广泛参与造血千细胞的分化调控和细胞增殖的负调节，TLR信号可激活P13K，而PI3K又可组成性地激活PKe6(Thrsos)。因此，我们推测TLR信号可能通过Px3K的活化而激活PKC6(Thr505)，从而发挥对分化、增殖的调控作用。此外，我们发现P38和JNK在持续刺激的BMDC中表达下降。PKC是否是
参考文献：
[1]. LPS持续刺激对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响及其机理初探[D]. 季海锋. 第二军医大学. 2003
[2]. CpG-ODN持续刺激对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响及其机理初探[D]. 陈杰. 第二军医大学. 2004