蜱传班阳病毒感染及复制机制研究

论文摘要

蜱传病毒是一大类具有丰富遗传多样性的病毒群体,包括多种具有感染致病性的病毒病原。2009年,在我国中东部地区发现和报道了发热伴血小板减少综合征病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV）感染人导致严重疾病的疫情流行。至2016年,SFTSV在我国已经感染超过7000病例,平均致死率为5.3%。此后不久,在美国报道了由腹地病毒（Heartland virus,HRTV）2例感染人致死病例,并从病人血清中分离到病毒;至今为止,在美国已导致超过30人感染,4人死亡。2014年,从我国新疆分离到一种新病毒:古尔图病毒（Guertu virus,GTV）,尽管目前尚无感染人致病的报道,但血清学调查与动物感染致病性提示GTV是一种潜在的致病原。SFTSV、GTV和HRTV都以蜱虫为媒介,亲缘关系接近,均属于布尼亚病毒目（Bunyavirales）白纤病毒科（Phenuiviridae）班阳病毒属（Banyangvirus）。本研究以班阳病毒属为研究对象,通过构建反向遗传操作体系,初步探索班阳病毒属的感染与复制机制,从病毒特性与蛋白质功能角度解析SFTSV、GTV和HRTV间的亲缘相关性;开展以核蛋白（Nucleoprotein,NP）为靶标的抗病毒药物药效检测,进一步解析班阳病毒的感染复制机制;开展SFTSV的致病案例调查分析,揭示SFTSV可能的感染风险。本研究搭建起了班阳病毒属的反向遗传操作技术基础体系,为未来开展以此为基础的病毒感染复制与转录机制的深入研究奠定了重要的技术手段。第一章文献综述。本章首先简介了SFTSV、GTV及HRTV三种病毒的基本生物学特征,包括这三种病毒的流行病学、致病机理、分子生物学等特征。然后,本章介绍了布尼亚病毒目反向遗传学研究进展,并讨论了布尼亚病毒目抗病毒药物的研发进展。本章最后介绍了本论文研究的内容和意义。第二章GTV反向遗传学系统的构建。本章研究建立了GTV反向遗传学系统。首先本研究基于已构建的分别含有T7聚合酶和RNA聚合酶I控制的基因组片段cDNA序列的感染性分子克隆,并构建稳定表达GTV NP和RdRp蛋白的表达质粒,共转染到靶细胞中,4-5天后,共转染培养细胞上清转接Vero细胞,巢式PCR可检测到GTV L、M、S基因的表达;免疫荧光均可检测到GTV NP蛋白的表达,表明重组病毒拯救成功。这些结果表明本实验成功建立了GTV的反向遗传操作系统。反向遗传学系统的建立可以为病毒基因组功能、分子致病机理、新型疫苗、新型RNA病毒载体等方面的研究提供平台。第三章班阳病毒属复制机制相关性分析。本章研究描述了在同源或异源病毒的NP和RdRp蛋白存在下检测到的GTV、SFTSV和HRTV M段的微基因组活性。这些病毒均为三节段负链RNA病毒,如果两个或更多密切相关的病毒共同感染同一宿主或载体细胞,这些亲本病毒中的任何一个的RNA片段都可能并入子代病毒中以产生重组病毒。但是目前人们对蜱传病毒的重组能力知之甚少,本研究将这三种病毒的微基因组系统结合起来,评估病毒N和L蛋白识别、转录和复制异源病毒M段微基因组的能力。结果表明,几种利用异源病毒的NP和RdRp蛋白的组合导致了M段的微基因组活性,证明了M段UTRs是相关病毒NP和RdRp蛋白转录和复制的功能性启动子。综上所述,这些病毒的共同感染可能导致产生可存活的重组子代。因此,本研究有助于阐明在实验条件下基因组重组在这些新兴病原体进化中所发挥的作用。第四章班阳病毒抗病毒药物药效检测。本章针对NP蛋白空间结构设计小分子抑制剂,筛选出具有抗病毒活性的药物。NP蛋白是病毒和感染细胞中最丰富的病毒蛋白。它包裹病毒基因组RNA（vRNA）,形成核糖核蛋白复合物（Ribonucleoprotein complex,RNP）,此外NP蛋白还在RNA转录和复制以及病毒粒子组装中起到积极作用。SFTSV NP蛋白是一种由六个单体组装而成的六聚体结构。六聚体的寡聚化是由相邻单体间氨基和羧基末端手臂相互识别而介导形成的。NP蛋白与病毒vRNA结合位点（RNA binding groove）位于六聚体中央空腔处。根据NP蛋白结构与特性,我们设计了一些抗病毒药物。AMG837可与羧基手臂相互识别,竞争性抑制NP蛋白单体与单体之间的结合,而CY1能识别RNA结合位点,竞争性的抑制NP蛋白与病毒vRNA的结合,从而抑制病毒的转录复制过程。本章为筛选出有效抗病毒活性的潜在药物奠定了基础。第五章首例由新疆感染经实验室确诊的SFTS案例。一名来自海南的常驻居民在新疆维吾尔自治区旅行时被蜱虫咬伤,返回海南后出现发热等发病症状。通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,RT-PCR）方法在患者血清中检测到了SFTSV的RNA,同时检测到血清中抗SFTSV阳性抗体,且血清具有SFTSV的中和作用。我们从患者的急性期血清中分离到一株新的SFTSV毒株,完成了病毒的全基因组测序,进一步分析了该毒株的病毒学特性和遗传进化关系。此外,我们在2017年从新疆维吾尔自治区采集的蜱虫中也检测到SFTSV阳性RNA,提示SFTSV的地域分布比我们此前所认知的范围更广。因此,本研究确诊了一例在新疆维吾尔自治区感染导致的SFTS病例,表明新疆维吾尔自治区存在由蜱虫叮咬导致感染SFTSV的风险性。这也是首例海南的输入性SFTS案例,表明了人类迁移对病毒性疾病扩散的重要作用,也提示海南省在应对来自不同地区和国家的输入性病例时将面临更多挑战。第六章讨论与展望。对本论文的研究内容进行了总结和讨论。本论文构建了GTV反向遗传学系统,验证了在同源或异源病毒的NP和RdRp蛋白存在下病毒的微基因组活性,同时筛选出针对NP蛋白结构的潜在抗病毒药物,为今后研究该病毒基因组功能、感染及复制机制、疫苗制备等方面的提供平台。

论文目录

摘要

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第1章引言

1.1 蜱传班阳病毒背景介绍

1.1.1 发热伴血小板减少综合症病毒（SFTSV）

1.1.2 古尔图病毒（GTV）

1.1.3 腹地病毒（HRTV）

1.2 反向遗传学系统

1.2.1 反向遗传学的概念

1.2.2 反向遗传学的主要操作方法

1.2.3 布尼亚病毒的反向遗传学研究进展

1.3 布尼亚病毒抗病毒药物研究进展

1.4 本论文的研究内容及意义

第2章反向遗传学系统的构建

2.1 材料与方法

2.1.1 细胞与病毒

2.1.2 RNA提取和逆转录PCR

2.1.4 质粒的构建

2.1.5 微小基因组分析

2.1.6 活病毒拯救

2.1.7 免疫荧光分析（Immunofluorescence assays,IFA）

2.2 实验结果

2.2.1 3′RACE和5′RACE

2.2.2 GTV3 个基因组片段及pRF42m、pRF42h、T7 质粒的线性化

2.2.3 微小基因组分析

2.2.4 活病毒拯救

2.3 讨论

第3章班阳病毒属复制机制相关性分析

3.1 材料与方法

3.1.1 细胞与病毒

3.1.2 质粒的构建

3.1.3 微基因组分析

3.1.4 统计学分析

3.2 实验结果

3.2.1 GTV S、M和 L微基因组分析

3.2.2 同一病毒的功能性蛋白利用异源病毒M片段微基因组的活性评估

3.2.3 不同病毒的功能性蛋白利用异源病毒M片段微基因组的活性评估

3.3 讨论

第4章班阳病毒抗病毒药物药效检测

4.1 材料与方法

4.1.1 细胞与病毒

4.1.2 抗病毒药物

4.1.3 细胞活性实验

4.1.4 药物处理

4.1.5 Western-blot（WB）分析

4.1.6 实时定量PCR

4.1.7 病毒滴度检测

4.1.8 免疫荧光和图像采集

4.2 实验结果

4.2.1 细胞活性检测结果

4.2.2 抗病毒药物检测

4.3 讨论

第5章首例由新疆感染经实验室确诊的SFTS案例

5.1 材料与方法

5.1.1 患者血清样本检测

5.1.2 病毒分离与鉴定

5.1.3 XJUAR蜱虫SFTSV RNA的检测

5.2 实验结果

5.2.1 案例报告及临床诊断结果

5.2.2 实验室检测结果

5.2.3 XJUAR SFTSV流行病学调查

5.3 讨论

第6章结论和讨论

参考文献

致谢

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 朱莉颖

导师: 王华林,邓菲

关键词: 反向遗传学,最小复制子,抗病毒药物,分离与鉴定

来源: 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)

分类号: R373

总页数: 84

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