高庆华[1]2003年在《牛卵母细胞对卵泡颗粒细胞增生和分化影响的研究》文中研究表明建立合适的牛卵泡颗粒细胞无血清培养体系是研究牛卵泡发育过程中颗粒细胞与卵母细胞相互作用的重要手段。以McCoy's5a为基础培养液添加硒、转铁蛋白、雄烯二酮、谷氨酰胺，对牛卵巢上大(直径＞8mm)、中(4mm＜直径＞8mm)、小(直径＜4mm)健康卵泡的颗粒细胞进行无血清培养，研究添加不同浓度的促卵泡激素(FSH)和胰岛素(Insulin)对颗粒细胞增生、分化和激素分泌的影响。结果：在FSH存在时，小卵泡颗粒细胞的雌激素合成能力随培养时间的增加而增加(r=0.81，P＜0.01)，在培养144h时，其雌二醇(E_2)合成能力接近达到大卵泡E_2的合成能力；来自大、中卵泡的颗粒细胞在144h培养的全程一直能够保持E_2合成能力。FSH可以诱导颗粒细胞增生及E_2合成能力，颗粒细胞的E_2合成能力与生理浓度的FSH呈剂量依赖方式。Insulin对大、中、小卵泡颗粒细胞增生和E_2分泌有促进作用。血清包被培养孔可以促进颗粒细胞增生和贴壁，但却会明显降低颗粒细胞E_2的合成能力。来自大、中、小卵泡颗粒细胞48、96、144h的培养后，E_2与P的产量比例保持相对稳定。McCoy's5a无血清长期培养中，颗粒细胞的增生并不明显。该培养系统能够防止颗粒细胞的黄体化，保持颗粒细胞的E_2合成能力及其对FSH的反应性，它可以作为研究颗粒细胞增生、分化关键性调控因子的重要工具。 为认识卵母细胞与颗粒细胞之间的通讯，确定卵母细胞与卵泡颗粒细胞体外培养时的形态学及激素分泌的变化，利用建立的牛卵泡颗粒细胞的无血清培养系统，通过对牛卵泡颗粒细胞与卵母细胞共培养，对体外培养颗粒细胞形态学观察与培养液激素测定。颗粒细胞原代培养在最初的48h能够保持其与在体内相同的特性，在FSH存在条件下，卵母细胞对大、小卵泡组的颗粒细胞有一定的影响，统计学差异不显着，而中卵泡组，卵母细胞对颗粒细胞芳香化酶活性和P合成能力胞有显着的影响(P＜0.05)，DO组在对颗粒细胞芳香化酶活性(P＜0.01)和P合成能力上(P＜0.01)的影响明显弱于COC组，卵母细胞可能分泌抗黄体化因子，这些因子可能主要通过卵丘细胞介导发挥其旁分泌调节作用。实验表明，壁层颗粒细胞的芳香化酶活性和P合成能力均低于同一卵泡卵丘颗粒细胞的(P＜0.01)，距卵母细胞远的颗粒细胞分化程度低，而增生能力强，贴近基底膜的颗粒细胞具有较明显的干细胞特性。
易康乐[2]2008年在《Figla和BDNF对猪和牛卵母细胞及早期胚胎生长发育的影响》文中提出本研究系统评述了目前哺乳动物卵泡和卵母细胞发生分子调控机制的研究进展,探讨了生殖系a因子(Figla)和脑源性神经生长因子(BDNF)在猪和牛卵母细胞和胚胎的表达情况,进一步优化了猪和牛早期胚胎的体外培养体系。研究中首次克隆获得牛生殖系a因子全长cDNA序列585bp,编码194个氨基酸的成熟蛋白,其功能保守区与小鼠、人和类人猿等哺乳动物的同源性达到了90%以上;优化了SYBR Green I实时荧光定量PCR技术,使之能对牛和猪卵母细胞和早期胚胎中相关基因的表达进行较为准确的检测分析,从而使对微量材料进行大量的基因表达分析成为现实;首次证实了Figla和BDNF在猪和牛的卵母细胞和早期胚胎中均有表达,且BDNF在牛体细胞核移植囊胚中的表达量要显着低于体外受精和孤雌激活的囊胚;以现有培养体系为基础,添加BDNF可促进猪和牛体外培养的早期胚胎的发育。而添加神经生长因子(NGF)可促进牛体外培养的早期胚胎的发育。
冯贵雪[3]2006年在《卵母细胞体外成熟及人胚胎玻璃化冷冻的研究》文中进行了进一步梳理1．探讨了不同大小水牛卵泡卵母细胞体外成熟过程中的减数分裂进程及其胚胎发育潜能。结果发现，不同大小水牛卵泡卵母细胞成熟速度存在明显差异，卵泡的体积越大，卵母细胞的体外成熟速度越快；2～6mm卵泡卵母细胞体外成熟后具有较高的胚胎发育潜能。2．探讨了表皮生长因子(EGF)浓度(0，10ng／ml，25ng／ml，50ng／ml，100ng／ml)对水牛卵母细胞体外成熟的影响。EGF对水牛卵丘细胞的扩展没有影响，但不同浓度的EGF均显着提高水牛卵母细胞的第一极体(PB1)排出率和孤雌激活后的囊胚孵化率，其中以25ng／ml的EGF效果最好。3．探讨了MEM维生素的浓度(0，0.2％，0.5％，1％，1.5％)对水牛卵母细胞体外成熟的影响。添加0.2％和0.5％的MEM维生素对水牛卵丘细胞的扩展没有影响，但显着提高卵母细胞孤雌激活后的囊胚发育率、囊胚孵化率和囊胚细胞数；然而，当浓度升高到1.0％或1.5％时，明显抑制卵丘的扩展和降低PB1的排出率。4．研究了人绒毛膜促性腺激素(HCG)浓度(0.75 IU／ml，2.5 IU／ml，5 IU／ml，7.5IU／ml)对水牛卵母细胞体外成熟的影响。HCG显着促进水牛卵丘细胞的扩展和PB1的排出，但对水牛卵细胞孤雌激活后的胚胎及囊胚细胞数没有影响。5．探讨了水牛和人无卵丘卵母细胞体外成熟的可行性。结果发现，未扩展卵丘细胞包围法和扩展卵丘细胞团支撑法可促进卵丘细胞与卵母细胞间的间隙连接重建，进而促进无卵丘水牛卵母细胞的体外成熟；与单层卵丘细胞共培养并不能促进无卵丘水牛卵母细胞的体外成熟；卵巢组织包围培养不能模拟体内卵巢的环境，且卵巢组织可能分泌抑制卵母细胞胞质成熟的因子；扩展卵丘细胞团支撑法能明显促进人无卵丘卵母细胞减数分裂的恢复，其成熟培养的无卵丘人卵母细胞显微受精后能发育成为正常囊胚；卵泡液有利于人卵丘细胞团叁维结构的维持。6．探讨了玻璃化冷冻保存人4-8细胞胚胎的可行性及其临床应用价值。结果发现，胚胎承载器具和冷冻样品体积对人4-8细胞胚胎的玻璃化冷冻保存效果有显着影晌，冷冻样品的体积越小，其胚胎冷冻保存的效果越好，玻璃毛细管(GMP)的玻璃化冷冻保存效果优于拉细开口塑料细管，是一种可用于临床的人4-8细胞胚胎高效冷冻方法。7．探讨了胚胎培养结合玻璃化冷冻技术挽救人低评分胚胎的可行性。结果发现，第叁天(D3)早期低评分胚胎不宜进行冷冻保存，但经过体外培养后部分胚胎能够形成囊胚，且这些囊胚可以玻璃化冷冻保存，解冻移植后能够获得健康婴儿。
刘利杰[4]2008年在《山羊卵母细胞减数分裂机制的初步研究》文中研究说明对于雌性哺乳动物而言,减数分裂是一个漫长的过程;卵原细胞进入减数分裂后,一直被阻断在第一次减数分裂前期的双线期,直到排卵之前,来自于发情期脑垂体分泌促黄体素的刺激下减数分裂重新恢复。本实验通过在卵母细胞体外成熟过程中添加不同浓度的卵丘细胞或其外围壁层颗粒细胞进行共培养,对山羊卵母细胞成熟过程中卵泡颗粒细胞对卵母细胞减数分裂抑制作用及作用机制进行了探索;钙离子信号对卵母细胞减数分裂周期发挥重要的调节作用,然而钙离子信号在山羊卵母细胞成熟过程中是否作为起始信号重新启动减数分裂及生发泡破裂后起到了什么作用并不是非常清楚。本试验通过在成熟液中分别添加一定量的L-型钙离子通道阻断剂、CaM对抗剂和CaMKⅡ抑制剂,对钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKII)在山羊卵母细胞减数分裂成熟过程中的作用进行了研究。试验研究结果表明:1.成熟液中添加105个/mL和106个/mL卵丘细胞或外围壁层颗粒细胞的卵母细胞体外成熟率与对照组相比差异不显着(P>0.05),但添加5×10~6个/mL(41.2%)和107个/mL(24.6%)卵丘细胞或外围壁层颗粒细胞组的成熟率显着降低(P<0.05)。添加5×10~6个/mL和107个/mL卵丘细胞组和颗粒细胞组卵丘不能正常扩展,核相观察,卵母细胞停留在GV期。在山羊卵母细胞体外成熟过程中,添加一定浓度的卵丘细胞及其外层的颗粒细胞可以抑制卵母细胞的减数分裂。2.添加Rp-cAMP(Rp-cyclic adenosine monophosphothioate)膜渗透性cAMP对抗剂,诱导了107个/mL的卵丘细胞组(71.6%)和外围壁层颗粒细胞组(71.3%)的卵母细胞体外成熟率与对照组(72.0%)差异不显着(P>0.05)。而添加一定浓度的Rp-cAMP可有效拮抗卵丘或颗粒细胞对卵母细胞成熟的抑制作用。卵丘细胞及其外层的颗粒细胞可能通过提高卵母细胞胞质内的cAMP的水平,从而维持卵母细胞的减数分裂状态。3.L-型钙离子通道阻断剂Nifedipine、CaM对抗剂W7和CaMKⅡ抑制剂KN-93能够抑制山羊卵母细胞的成熟,并使卵母细胞停留在减数分裂周期的生发泡(GV)期,同时培养后的COCs卵丘不发生扩展。钙离子信号通路在山羊卵母细胞成熟过程中发挥着重要作用。作为钙离子信号的主要调节因子,CaM和CaMKⅡ在启动山羊卵母细胞减数分裂重新恢复过程中起着至关重要的作用。4.在卵母细胞发生生发泡破裂(GVBD)后,经KN-93和W7处理,第一极体的排出受到抑制,停留在减数分裂周期的第一次减数分裂前期或中期,而经Nifedipine处理后,第一极体正常排出。CaM和CaMKⅡ在启动山羊卵母细胞发生GVBD后对第一极体的排出起着至关重要的作用。
孙健[5]2009年在《PMSG对性成熟前小鼠卵泡发育的影响及牛卵母细胞体外培养技术研究》文中研究表明本研究以20～21日龄性成熟前雌性昆明小鼠及武汉当地黄牛卵巢为试验材料,利用常规研究方法,分别进行了5个相对独立的试验,就PMSG对性成熟前小鼠卵巢及卵泡发育的影响、PMSG对牛卵母细胞体外成熟的影响以及利用PMSG进行牛卵母细胞体外培养所涉及的卵母细胞采集方法、培养方法、石蜡油净化方法、成熟培养液的保存方法等关键技术进行了系统研究。1、PMSG对性成熟前小鼠卵巢及卵泡发育的影响研究每只性成熟前小鼠皮下注射2 IU、4 IU、6 IU、10 IU、15 IU、20 IU PMSG,研究其对小鼠卵巢和卵泡发育的影响。结果发现,随着PMSG剂量增加,各处理组小鼠卵巢重量也逐步增加,以20 IU处理组卵巢增重最大,达0.0169 g/枚;各处理组间生长卵泡数量差异不显着(P>0.05);4 IU、6 IU、15 IU、20 IU处理组小鼠卵巢中有腔卵泡数量较多,各组间差异不显着(P>0.05);有腔卵泡占生长卵泡比例以20 IU和15 I U处理组最高,显着高于其它各处理组(P<0.05)。综合分析表明,用PMSG对性成熟前小鼠进行处理时,其合适剂量范围为4 IU/只～15 IU/只。2、PMSG对牛卵母细胞体外成熟的影响将从牛卵巢中获得的卵母细胞随机分为5组,分别用PMSG浓度为0IU/mL、5IU/mL、10 IU/mL、15 IU/mL、20 IU/mL的培养液进行微滴培养,结果卵母细胞成熟率随PMSG含量的增加呈现先升高后下降的变化趋势,其中10 IU组卵母细胞成熟率最高,达65.03%,显着高于其它各处理组(P<0.05);15 IU组和20 IU组卵母细胞的成熟率分别为57.13%和58.50%,组间差异不显着(P>0.05);5 IU组成熟率为45.27%,显着低于10 IU组、15IU组和20 IU组(P<0.05);未添加PMSG的对照组卵母细胞成熟率仅为34.63%,显着低于其它各组(P<0.05)。PMSG添加量以10 IU/mL为宜。3、手工抽吸法和机械抽吸法对牛卵母细胞体外成熟的影响以每个牛卵巢卵母细胞收集时间、卵母细胞回收数量和比例、卵母细胞体外成熟率等为指标,比较了手工抽吸法和机械抽吸法对卵母细胞收集效率和成熟率的影响。结果发现在相同条件下,机械抽吸法和手工抽吸法平均每个卵巢可得卵母细胞数、每个卵巢卵母细胞的平均采集时间、A、B级卵母细胞比例分别为8.71枚和5.56枚、0.81min和1.17min、75.73%和72.25%,差异均显着(P<0.05);卵母细胞成熟率分别62.31%和64.21%,差异不显着(P>0.05)。上述结果表明,机械抽吸法完全可以替代手工抽吸法采集牛卵巢中的卵母细胞。4、常规微滴法和套皿法及微滴法中石蜡油质量对牛卵母细胞体外成熟的影响分别用新鲜石蜡油、回收石蜡油和污染石蜡油覆盖液滴培养卵母细胞,叁种方法卵母细胞的成熟率分别为60.04%、58.65%和0。前两组之间差异不显着(P>0.05),均显着高于最后一组,表明采用本试验所改进的石蜡油回收净化方法处理的石蜡油,完全可用于牛卵母细胞的体外培养;用套皿培养法、单皿加石蜡油培养法和单皿未加石蜡油培养法培养卵母细胞,卵母细胞成熟率分别为65.46%、61.30%和0,套皿法高于其它二个组,但前两组间差异不显着(P>0.05),表明套皿法是一种不依赖于石蜡油的有效的培养方法,完全可以用于牛卵母细胞的体外成熟培养。5、冷冻保存成熟培养液对卵母细胞体外成熟的影响分别用经冷冻处理保存的卵母细胞成熟液和新鲜成熟液培养牛卵母细胞,与新鲜成熟液相比,冷冻处理成熟液培养卵母细胞时的成熟率为56.54%,略低于使用新鲜成熟液培养卵母细胞成熟率(59.29%),但两者差异不显着(P>0.05),表明冷冻处理可用于成熟液的长期保存。
耿利英[6]2008年在《脂质体介导抑制素基因转染对牛卵泡细胞及胚胎发育的影响及机制研究》文中研究说明本研究应用细胞培养、质粒提取、脂质体转染、RT-PCR(反转录PCR)、TUNEL(脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法)、RIA(放射免疫测定)和流式细胞分类等技术,利用本实验室构建的卵泡抑制素α亚基片段基因重组质粒即pEGISI,转染不同大小的牛卵泡颗粒细胞及卵母细胞,研究pEGISI在颗粒细胞、卵母细胞中的表达以及对颗粒细胞激素分泌、细胞增殖和细胞凋亡以及对卵母细胞成熟、体外受精和胚胎发育的影响,以探讨卵泡抑制素对卵泡发育的局部调节作用及作用机制。主要内容如下:1.pEGISI转染对卵泡颗粒细胞增殖、凋亡、激素分泌及共培养的卵母细胞和胚胎发育的影响为了了解抑制素基因转染卵泡的颗粒细胞后基因表达对颗粒细胞增殖、凋亡和激素分泌,以及转染的颗粒细胞同卵母细胞共培养对卵母细胞成熟、体外受精和胚胎发育的影响。本试验利用pEGISI质粒转染来源于牛中腔(直径,＞4mm-8mm)、小腔(直径,1mm-4mm)颗粒细胞,转染后48 h、96 h分别检测颗粒细胞的增殖、凋亡及雌激素和孕酮的分泌量,并检测共培养后的卵母细胞的发育情况。结果显示,脂质体介导的pEGISI转染颗粒细胞后,来自中腔卵泡的颗粒细胞增殖率(88.8±2.1%;平均值±标准差)显着低于对照组(100%)和转染pEGFP组(97.5±2.1%),对小腔卵泡颗粒细胞的增殖在各组之间无显着差异。pEGISI转染颗粒细胞后显着加剧了颗粒细胞的凋亡。转染颗粒细胞48 h后雌激素分泌量均增加,而孕酮分泌量下降。转染后的中腔卵泡颗粒细胞与卵母细胞共培养,降低了卵母细胞的成熟率(61.5±6.8%vs.71.2±5.7%,P＜0.05),但对体外受精和胚胎发育没有影响。这些结果表明,pEGISI在颗粒细胞中的超表达对颗粒细胞的增殖、凋亡和卵母细胞成熟有着重要的调节作用,其作用因颗粒细胞发育时期不同而异。2.pEGISI转染卵母细胞对其成熟及胚胎发育的影响为了了解抑制素基因对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响,本试验利用pEGISI质粒直接转染卵母细胞,然后检测抑制素基因在卵母细胞中的表达,以及转染的卵母细胞成熟率和体外受精后胚胎发育情况,结果显示:(1)脂质体介导的抑制素片段转染能够成功地通过透明带进入卵母细胞,并且能够高效表达。(2)转染本身对卵母细胞成熟及体外受精能力没有伤害。(3)高效表达的抑制素片段对卵母细胞的成熟,体外受精以及胚胎发育没有影响。3.pEGISI转染卵母细胞复合体对其成熟及胚胎发育的影响为了进一步了解抑制素基因对卵母细胞复合体成熟及胚胎发育的影响。本试验用pEGISI质粒转染牛卵母细胞复合体,检测pEGISI在卵母细胞复合体中的超表达、卵丘细胞扩散、凋亡和激素分泌、以及卵母细胞复合体成熟、体外受精和胚胎发育的情况。结果显示:质粒pEGISI转染牛卵丘卵母细胞复合体,对中、小卵泡的卵丘细胞扩散有抑制作用,对中腔卵泡卵丘细胞的抑制作用尤为显着(69.8±2.7%,p＜0.05)。质粒pEGISI转染加剧了中、小卵泡卵丘细胞的凋亡,对中腔卵泡卵丘细胞的凋亡作用尤为显着(14.5±0.5%,p＜0.01)。此外,质粒pEGISI转染牛卵丘卵母细胞复合体后,促进了雌激素的分泌。转染后的牛中腔卵泡卵母细胞复合体成熟培养后,卵母细胞的成熟率降低(57.9±8.4%,p＜0.05),但对体外受精率和胚胎发育没有不良影响。
雍艳红[7]2003年在《牦牛妊娠期卵泡和黄体的组织形态学研究》文中研究表明本实验共选用妊娠20～180天的牦牛45头，运用组织学技术和电镜技术首次对妊娠期卵泡和黄体的组织结构进行了研究。实验结果表明： 1．牦牛卵母细胞和其它哺乳动物的卵母细胞一样，具有皮质颗粒。当卵母细胞被单层立方卵泡细胞包围时，开始出现微绒毛；被2～4层的卵泡细胞包围时开始出现皮质颗粒、透明带。在卵母细胞的发育过程中，透明带增厚；微绒毛由粗短变为细长，密度增加；皮质颗粒、线粒体、滑面内质网等细胞器的数目不断增加，并逐渐移行到质膜下；在移行的过程中，皮质颗粒成团存在。当卵母细胞接近成熟时，皮质颗粒呈线形分布于质膜下，线粒体、滑面内质网又移向胞质中央。卵母细胞借助微绒毛穿过透明带与卵泡细胞胞质突起相联系。 2．牦牛在妊娠的20～70天时，黄体细胞体积较小，组织中血管相当丰富；在妊娠的70～180天，黄体细胞的体积较大，许多毛细血管中含有细胞碎片。厚壁小动脉非常多。从妊娠20天到妊娠180天，黄体细胞早期的退行性变化表现为：胞质与胞膜之间出现环状空隙，这种形态的细胞数目逐渐增多；退行性变化进一步发展，表现为：细胞体积增大，形态多样，呈圆形、卵圆形或多角形，胞质浓染，呈强嗜酸性；胞核固缩或崩解。妊娠期黄体细胞的超微结构的特征性变化主要表现在脂滴和滑面内质网的分布变化。在妊娠20～70天时，脂滴相当多，在妊娠70～180天，脂滴逐渐减少；而滑面内质网的数量在妊娠的20～180天渐进性增加，呈典型的环层板状结构。黄体组织中既有窗孔型毛细血管，又有连续型毛细血管。黄体细胞间以缝隙连接和紧密连接相联系。发生退化的黄体细胞胞核固缩、崩解，核膜皱折，胞质中各种细胞器已发生变性，脂滴聚集，滑面内质网减少或消失，粗面内质网增加；线粒体退化；高尔基复合体膨胀；溶酶体增加，且其界膜消失。
王晓丽[8]2007年在《水牛卵母细胞体外成熟与凋亡的初步研究》文中研究指明为进一步完善水牛卵母细胞体外成熟培养体系，对水牛卵母细胞体外成熟的影响因素，卵母细胞体外成熟和受精过程中的皮质颗粒变化规律，以及体外成熟过程中卵母细胞和颗粒细胞的凋亡情况进行了系统研究。分别以第一极体的排放和皮质颗粒(cortical granules，CGs)单层分布于质膜下作为水牛卵母细胞核、质成熟的指标对表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子(IGF-I)对水牛卵母细胞体外成熟的影响进行了研究。结果发现，(1)在成熟基础液中添加10、20、30 ng/mL EGF对水牛卵母细胞的成熟率无明显影响，但EGF浓度升高到50 ng/mL时，水牛卵母细胞第一极体排出率显着提高(55.4％vs 32.3％，P＜0.05)，当EGF浓度升高到100ng／mL时，卵母细胞的成熟率下降；CGs的分布随着EGF浓度的升高逐步由中间分布向皮层分布转变，EGF浓度为50 ng/mL时皮层分布的卵母细胞比例最高，当EGF浓度升高到100 ng/mL时，CGs又向中间分布转变。(2)在成熟液中添加10 ng/mL的IGF-I对水牛卵母细胞体外成熟无显着影响(P＞0.05)；但添加30 ng/rnL的IGF-I能显着提高水牛卵母细胞体外成熟率(P＜0.05)，CGs的分布随着IGF-I浓度的升高逐步由中间分布向皮层分布转变，IGF-I浓度为30 ng/mL时，皮层分布的卵母细胞比例最高，随着IGF-I浓度的进一步升高(50、100 ng/mE)，CGs又向中间分布转变。(3)成熟基础液中添加20 ng／mL EGF+30 ng/mL IGF-I的卵母细胞体外成熟率显着高于添加20 ng/mL EGF组和对照组(P＜0.05)。以上结果表明，适宜浓度的EGF和IGF-I对水牛卵母细胞体外成熟具有促进作用，且两者具有协同作用。研究了水牛多卵细胞在体外成熟及体外受精过程中的CGs变化规律。用FITC-LCA标记不同体外成熟时间、体外受精时间的水牛卵母细胞的CGs，然后用激光共聚焦显微镜检测其分布情况。结果发现，CGS在水牛卵母细胞体外成熟培养前，70.1％卵母细胞的CGs呈现中间分布，体外成熟16h后，CGs呈皮层分布的卵母细胞比例增多，达到22.1％。培养24 h后，CGs皮层分布的卵母细胞达到59.8％，分布形式由完全聚合向完全分散逐步转变。对不同体外成熟时间的卵母细胞进行体外受精时发现，体外成熟12 h的卵母细胞仅在受精后3 h有12.9％的CGs外排。成熟20 h的卵母细胞在受精后1.5 h有48.5％的CGs外排，成熟24 h的卵母细胞受精后1.5 h的CGs外排率可达到97.1％，3 h后达100％。同时也对化学激活后水牛卵母细胞的CGs分布情况进行了测定，发现化学激活也可以引起CGs的排放，体外成熟12 h的卵母细胞仅在激活后3 h有10.0％的CGs外排。成熟20 h的卵母细胞激活后0.5 h没有CGs外排，激活后1.5 h CGs外排仅达到33.3％，明显低于受精。体外成熟24 h的卵母细胞在激活后1.5 h CGs外排率可达到96.7％。以上结果表明，随着成熟时间的延长，CG的分布由中间分布逐渐向皮层分布转变，受精和激活后的CG排放速度与卵子本身的成熟度有着直接的关系，且化学激活引起的CGs排放速度比体外受精迟缓。研究了EGF和IGF-I对水牛卵母细胞成熟培养过程中凋亡的影响。结果发现，(1)在成熟基础液中添加不同浓度的EGF(10、20、30、50、100ng／mL)都可以降低卵母细胞的凋亡率；添加20 ng／mL EGF的卵母细胞凋亡率为10.9％，显着低于对照组(29.4％，P＜0.05)；随着EGF浓度的提高，卵母细胞的凋亡率随之下降，当EGF浓度添加至50 ng/mL时，卵母细胞凋亡率达到6.2％，显着低于对照组和10 ng／mL组(P＜0.05)，与其它实验组无显着差异(P＞0.05)。(2)在成熟基础液中添加10，30，50和100 ng/mL的IGF-I，卵母细胞凋亡率(8.2％，7.6％，10.6％和15.4％)均显着低于对照组(36.4％，P＜0.05)，其中100 ng／mL组的卵母细胞凋亡率显着高于10ng／mL组和30 ng／mL组(P＜0.05)，其余各组间差异不显着(P＞0.05)。(3)添加20 ng／mL EGF+30 ng/mL IGF-I组体外成熟卵母细胞的凋亡率低于添加30 ng／mL的IGF-I组和添加20 ng/mL EGF组以及对照组(P＜0.05)。(4)在添加有20 ng／mL EGF+30 ng／mL IGF-I的成熟液中成熟培养12 h、20 h和24 h的的卵母细胞成熟率分别为7.8％、50.9％和61.4％，卵母细胞凋亡率分别为1.7％、4.4％和4.7％，成熟差异显着(P＜0.05)，而凋亡率差异不显着(P＞0.05)。以上结果表明，适宜浓度的EGF和IGF-I可抑制水牛卵母细胞体外成熟过程中的凋亡发生，且两者具有协同作用。探讨了卵母细胞发育潜能与卵丘颗粒细胞凋亡之间的关系。结果发现，随着卵母细胞成熟时间的延长，凋亡率升高；此外，随着卵母细胞评分和发育潜能的降低，颗粒细胞凋亡率逐渐升高。由此表明卵母细胞发育潜能与卵丘颗粒细胞凋亡密切相关，通过测定颗粒细胞的凋亡率可预测未成熟卵母细胞的发育潜能。
高志花[9]2003年在《牛腔前卵泡体外无血清培养及超微结构研究》文中进行了进一步梳理本研究建立了一种简便快速的牛腔前卵泡机械分离方法，探讨了卵巢大小及发育状况与腔前卵泡采集数量的关系。初步确立了牛腔前卵泡体外培养过程中的超微结构评定标准。通过研究McCOY’s 5a培养液(含3mM L-谷氨酰胺、0.1％BSA、29ng／mL睾酮、2.5ng／mL转铁蛋白、100ng／mL胰岛素和4ng／mL硒)中有、无血清对腔前卵泡体外发育的影响，确立了牛腔前卵泡的无血清培养体系，在该体系中研究了促性腺激素(FSH、LH)、牛卵泡液(BFF)对腔前卵泡的体外生长及激素分泌的影响，以及体外培养过程中超微结构变化。结果如下： 1．建立了皮肤移植刀切割、剪碎、过滤直接检卵的腔前卵泡简易机械分离技术，平均每卵巢采卵数为46.9±18.2个，卵泡回收效率可达99.5个／h，采集腔前卵泡绝大部分是直径为60～150μm的次级卵泡。 2．腔前卵泡的采集数量与牛卵巢大小成正相关关系(r=0.4475)，而有、无黄体腔前卵泡的采集数量无明显差异；卵巢上不同大小的可见卵泡数量分布也与腔前卵泡的采集量有关。卵巢上可见卵泡(大、中、小)分布均衡者无论是否有黄体存在，均可获得较多的腔前卵泡。而卵巢表面脂肪化、血体化、弥散性片状黄体及幼稚卵巢等则分离很少或几乎分离不到腔前卵泡。根据卵巢发育状况在分离前进行预选择，可显着提高腔前卵泡的回收效率。 3．通过研究基础培养液中不添加血清(FCS)及添加不同比例FCS对腔前卵泡体外发育和激素分泌的影响，结果显示：在本研究系统添加血清对腔前卵泡体外生长无促进作用，对腔前卵泡的体外发育、存活及激素分泌也影响不大。腔前卵泡在无血清条件下可持续生长、分泌E_2，超微结构研究也表明腔前卵泡在该体系中发育正常。该体系可作为进一步研究激素和生长因子等对卵泡早期发育调控作用的一个良好的研究模型。 4．卵泡活力评定结果表明：台盼蓝染色和相差显微镜观察检测卵泡活力有一定的误检率，超微结构检测能够客观、真实地反映腔前卵泡健康状况，可作为评定腔前卵泡培养系统优劣的一个可靠手段。在实际应用中。相差显微镜观察与超微结构评定结合使用，可发挥良好的效果。 5．培养液中单独添加LH对腔前卵泡生长无促进作用。添加50、100ng／ml FSH组腔前卵泡及其卵母细胞培养不同时间的直径增长值都较对照组有所提高。当培养液中有 10nghl LH存在时，两种促性腺激素协同刺激卵泡生长的作用更加明显。添加 10ng／ml LH＋50nghl FSH对腔前卵泡体外生长及存活具有显着的促进作用。6．体外培养腔前卵泡时，添加一定比例BFF有提高卵泡发育率和存活率的作用。在促性腺激素存在下，培养液中加入10％＊F于可显着刺激卵泡的体外生长、发育和存活：体外培养12d腔前卵泡的直径增长值为 33．7士4．8 u m，显着高于其它组门％BFF组：23对土3．8 u m，20％BFF组：20．4上3．4 u m）及对照组（25．6士4．3 u m）．7在基础无血清培养液条件下卵泡不论大小在整个培养过程中均可测到一定量的EZ，且大卵泡分泌比较多，O＞100 p 2卵泡在培养第6d EZ分泌量最高（3．sl士1．62 pg／ml）；慢性腺激素、叮s及＊w都有刺激腔前卵泡分泌己的作用。巾＞1皿pm卵泡在体外培养6d时10Dglffil LH＋100wtlFSH组、10O血清组及 10％牛卵泡液组已分泌分别为 5．76士0．2 us加1，4石2士0．87 pg／inl和 26．72土8．23 pghl。在 10llghlLH＋100ng／ffilFSH存在下，10％BFF组培养6d时的E。分泌达最大值N8．96土11．54pg／inl入表明培养液中添加一定比例牛卵泡液（BFP）可显着刺激体外培养腔前卵泡EZ的分泌，促性腺激素存在下更加强了卵泡液对E。分泌的刺激作用。8．透射电镜下，简易机械法分离得到的腔前卵泡有卜 层颗粒细胞，卵泡基膜完整，外无卵泡膜，其颗粒细胞及卵母细胞超微结构与卵巢皮质片中的腔前卵泡一致。培养过程中超微结构的变化与体内发育腔前卵泡类似。培养 6d时观察到颗粒细胞增殖现象，培养 15d时，个别卵泡的内膜细胞开始形成。超微结构研究结果表明本培养体系适于小腔前卵泡的体外培养。
陈江凌[10]2008年在《牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的研究》文中研究表明本研究利用屠宰牛的卵巢,先用抽吸法收集卵巢表面直径为2～8mm卵泡液,然后,用切割法获取卵巢表面直径2mm以下的小腔卵泡卵母细胞。对获得的A、B级小腔卵泡卵母细胞进行体外成熟培养、体外受精培养和受精卵的体外培养的研究。实验结果如下:1.本研究探讨了牛卵巢保存温度以及育成牛和经产牛卵巢对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:卵巢保存温度在31～37℃时,可用卵母细胞数和成熟的小腔卵泡卵母细胞数均较多;经产牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟效果好于育成牛。2.比较不同的激素组合(FSH/LH、FSH/hCG和hCG/PMSG)对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:对照组1牛小腔卵泡卵母细胞的成熟率最低(6.52%),且与第2、3、4相比均差异显着(P<0.05);第3组卵母细胞的成熟率最高(23.00%),但与第2、4两组牛小腔卵泡卵母细胞的成熟率间差异不显着(P>0.05)。3.在成熟培养液中分别添加0%、5%、15%和20%的FCS。结果表明:在成熟培养液中添加适量的FCS显着促进牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟(P<0.05),其中添加15% (v/v)的FCS组的牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟率最高,添加10%(v/v)的FCS组次之,但两者间差异不显着(P>0.05)。4.添加0.05、0.1μmol/mL的β-巯基乙醇均能促进牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟(P>0.05),但添加0.2μmol/mL的β-巯基乙醇组显着抑制牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟率(P<0.05),以0.1μmol/mL的β-巯基乙醇组牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟率最高。5.比较不同的直径的卵泡液对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:与对照组1相比,第2组在培养液中添加直径≤2 mm的卵泡卵泡液,卵母细胞的成熟率降低,但二者差异不显着(P>0.05);第3组在培养液中添加直径2～6mm的卵泡卵泡液显着促进牛小腔卵泡卵母细胞的成熟(P<0.05),卵母细胞的成熟率最高。6.比较在体外成熟培养液中分别添加不同浓度的LIF和(或)胰岛素对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:在体外成熟培养液中同时添加LIF和胰岛素的I-8组牛小腔卵泡卵母细胞的体外成熟率最高(35.78%),而单独添加胰岛素的I-6组牛小腔卵泡卵母细胞的体外成熟率最低(22.12%);I-8组与I-6组间牛小腔卵泡卵母细胞的成熟率差异显着(P<0.05),但与对照组I-1以及其它各组间成熟率均差异不显着(P>0.05)。7.比较了上浮法和Percoll密度梯度离心法两种精子离心方法对卵泡卵母细胞体外受精的影响,结果表明:Percoll密度梯度离心法预处理的精子卵泡卵母细胞的卵裂率(19.17%)高于上浮法(17.48%),但两者间没有显着的差异(P>0.05)。8.与对照组相比,和输卵管上皮细胞单层共培养系统的卵泡卵母细胞的卵裂率虽然高一些,但二者间卵裂率没有显着的差异(P>0.05)。
参考文献：
[1]. 牛卵母细胞对卵泡颗粒细胞增生和分化影响的研究[D]. 高庆华. 中国人民解放军军需大学. 2003
[2]. Figla和BDNF对猪和牛卵母细胞及早期胚胎生长发育的影响[D]. 易康乐. 吉林大学. 2008
[3]. 卵母细胞体外成熟及人胚胎玻璃化冷冻的研究[D]. 冯贵雪. 广西大学. 2006
[4]. 山羊卵母细胞减数分裂机制的初步研究[D]. 刘利杰. 西北农林科技大学. 2008
[5]. PMSG对性成熟前小鼠卵泡发育的影响及牛卵母细胞体外培养技术研究[D]. 孙健. 西北农林科技大学. 2009
[6]. 脂质体介导抑制素基因转染对牛卵泡细胞及胚胎发育的影响及机制研究[D]. 耿利英. 华中农业大学. 2008
[7]. 牦牛妊娠期卵泡和黄体的组织形态学研究[D]. 雍艳红. 甘肃农业大学. 2003
[8]. 水牛卵母细胞体外成熟与凋亡的初步研究[D]. 王晓丽. 广西大学. 2007
[9]. 牛腔前卵泡体外无血清培养及超微结构研究[D]. 高志花. 中国人民解放军军需大学. 2003
[10]. 牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的研究[D]. 陈江凌. 河南农业大学. 2008
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