沈斌[1]2004年在《木瓜蛋白酶的柔性固定化研究》文中研究表明传统共价结合法固定化酶的优势在于酶与载体结合牢固,不易发生酶脱落,可以长时间连续使用,所以成为目前研究最活跃的固定化方法之一。但共价结合法固定化酶的最大弱点在于酶活回收率低,其主要原因之一可能是:在共价偶联固定化的过程中,酶蛋白与载体表面之间所产生的碰撞力使酶蛋白的正常(天然)构象不能得以维持,所以,如果能从分子水平考虑改善载体表界面的特性,则有望提高固定化酶的性能。基于林思聪就生物材料表面性质、结构与其抗凝血性之间的关系提出的“维持正常构象”假说及 Bayer 在多肽合成技术的综述中阐述的柔性链的作用机理,本文提出了酶的“柔性固定化”模型,并通过柔性固定化载体的设计、制备及应用来证明柔性固定化模型的可行性。在第一部分中,本文概括了国内外酶固定化技术发展及应用状况,总结了传统的酶固定化方法、原则及优缺点。其中共价结合法是目前研究最为活跃的固定化方法之一,但该方法所得到的固定化酶活回收率偏低,本文在总结前人采用的刚性固定化及手臂固定化方法的基础上,提出了酶的“柔性固定化”模型。此模型的主旨是在酶蛋白与载体分子之间接入一段柔顺、亲水的大分子链(即柔性链),以使固定化载体分子表面的刚性及疏水性得到改善,并具有柔顺,亲水的性质。这样可以减少在酶固定化过程中因刚性碰撞造成的酶活损失,同时又可最大限度地保留酶游离态的均相催化活性。从而解决共价结合法固定化酶活力回收率偏低的问题。在第二部分中,本文考虑到淀粉分子具有柔顺、亲水以及良好的生物相容性的特性,故通过对其氧化活化制得含有多醛基的双醛淀粉柔性链。在双醛淀粉的制备过程中,本文改进了常规的非均相体系,采用一种拟均相体系法,并研究了此体系的作用机理。实验结果表明,在拟均相体系中制备双醛淀粉,可以在低温下(0℃)、近中性 pH(4.4)、用少量的氧化剂,获得更高的氧化反应速度,同时避免了副反应,产品性能得到改善。在第叁部分中,本文分别用双醛淀粉柔性链,戊二醛手臂链对多种载体(胺化聚苯乙烯微球、羧基化聚苯乙烯微球及壳聚糖载体)进行反应,制得各种柔性 Ⅰ
陈忻, 张俊敏, 孙恢礼, 杜健海, 袁毅桦[2]2010年在《柔性固定化木瓜蛋白酶的制备及在酶解波纹巴非蛤中的应用》文中研究表明在壳聚糖膜的表面接上分子链较长的双醛淀粉作为柔性固定化酶的载体,将木瓜蛋白酶固定在该载体上制成柔性固定化木瓜蛋白酶,并应用于酶解波纹巴非蛤制备小分子肽。通过考察温度、pH值、加酶量和固定化时间等条件对柔性固定化木瓜蛋白酶的酶活、酶活回收率的影响,确定最优固定化条件。结果表明:双醛淀粉用量0.8mg/g壳聚糖、柔性固定化酶温度25℃、柔性固定化酶时间20h、加酶量40mg/g壳聚糖、pH8.0条件下所得的固定化酶酶活最高,酶活回收率63.35%。将该柔性固定化酶在酶解温度40℃、pH7.0、加酶量1.0%、酶解时间4h条件下制备波纹巴非蛤小分子肽,产率为3.4055%。
刘晓宁, 魏荣卿, 沈斌[3]2004年在《木瓜蛋白酶的柔性固定化研究》文中研究表明以双醛淀粉为柔性接枝链,对不同载体表面进行修饰后对木瓜蛋白酶进行柔性固定化,通过对固定化条件的优化,得出:用此柔性载体固定木瓜蛋白酶所得到的固定化酶活力回收率达约相当于手臂固定化的2～3倍。结果说明,双醛淀粉作为接枝链具有维持酶蛋白构象的柔性作用,采用这种“柔性固定化”模型可以改善传统共价结合固定法及手臂固定化酶活力回收率不高的缺陷。另外对柔性固定化酶的稳定性考察发现其稳定性远好于游离酶。
朱建星[4]2004年在《Mannich反应法合成新型胺基树脂及其应用研究》文中研究指明聚苯乙烯型胺基树脂性能优良,广泛用于生化分离、污水处理、支载催化试剂、酶的固定化以及制备螯合树脂等领域。但是用氯甲基化法制备的聚苯乙烯型阴离子交换树脂其反应原料氯甲醚及二氯甲醚有强烈的致癌作用,且氯甲基化反应存在多取代和二次交联的问题。为此,本文以乙酰化聚苯乙烯微球为原料经 Mannich 反应制备了一种新型结构胺基树脂(聚苯乙烯-二乙胺及四乙烯五胺,PS-EDA 及 PS-TEPA),该树脂可替代氯甲基树脂制备的阴离子交换树脂及酶固定化胺基载体,因此,避免了氯甲基树脂生产中的弊端。文中讨论了反应温度和时间、物料比、加料方式、介质中的水量等因素的影响。以最佳反应条件:无水乙醇介质,胺、醛、盐酸和乙酰基的摩尔比为 10:10:3.3:1,反应温度为 100℃,反应时间为 12 小时,制备的胺基树脂氮含量可达 19.2%(13.7mmol/g),且热稳定性好。机理研究显示乙酰基发生α-多取代反应。为改善传统的共价结合法固定化酶活力回收率偏低的问题,在提出“柔性固定化酶”模型的基础上,本文用 PS-EDA 和 PS-TEPA 载体与双醛淀粉(DAS)柔性链偶联固定化木瓜蛋白酶,获得的酶活力回收率优于手臂固定化酶。结果表明:先将 DAS 柔性链偶联于胺基担载量在 1.0~2.0mmol /g 的胺基载体上,控制DAS 的醛基适度过量于胺基,所得到的柔性载体对酶固定化,其酶活力回收率可达 40~50%,比手臂固定化酶高出 2~3 倍;所得的柔性固定化酶在室温下储存半衰期为 26～32 天;且经 70～80℃育温后仍有 80~90%的相对活力;经有机试剂浸泡后,柔性固定化酶的活力仍保留有 50%以上。由 PS-EDA 和 PS-TEPA 胺基树脂分别进一步制备获得了氨基羧酸型螯合树脂 AC1和 AC2,羧基担载量分别达 2.3 mmol/g 和 3.7mmol/g。由 PS-TEPA 胺基树脂还合成了氨基膦酸型螯合树脂(AP 树脂),研究中发现,采用水介质不能得到目的产物,采用无水乙醇介质,以-NH2:CH2O:H3PO3:HCl(mole)=1:10:10:4 的物料比例取得的增重率最高,膦酸基担载量为 1.6 mmol/g。采用静态吸附法,考察了合成的螯合树脂对金属离子的螯合性能,结果表明:在叁种螯合树脂中,AP 树脂对 Cu2+、Ni2+的螯合容量最高,分别达到 1.1mmol/g、 I
蒋雯[5]2003年在《胺基柔性载体固定木瓜蛋白酶的研究》文中研究表明本文在传统的酶固定化模型基础上提出了酶的柔性固定化模型：在固定化载体上，接上一些有足够长度的且是亲水的分子链(“柔性链”)， 以制备“柔性载体，而后再将酶与该柔性载体进行共价结合。该模型的特点就在于可以避免固定化过程中酶与载体的刚性碰撞，以维持酶的构象，提高固定化酶的活性和稳定性。实验中，我们主要研究了柔性固定化模型中胺类柔性载体的制备，以及用所制备的胺类柔性载体对木瓜蛋白酶进行的柔性固定化。 首先，本文概括了国内外酶固定化技术发展状况，总结了传统的酶固定化方法、原则及相关载体性能。并在此基础上，提出了柔性固定化模型及本课题的研究目的和意义。 其次，本文以傅克反应制备的氯乙酰聚苯乙烯微球作为原料树脂，研究了该原料树脂与不同分子量的胺制备胺类柔性载体(胺基树脂)的反应。具体讨论了不同实验条件，如分散时间、分散溶剂、反应时间、反应温度、原料树脂的取代度和粒径以及催化剂等对胺基树脂增重率的影响，并通过红外光谱以及元素分析对其进行了表征。实验结果表明：用DMF作溶剂分散原料树脂的效果优于其他溶剂；分散时间至少需要8.5h；胺化反应的最佳温度为80℃；四乙烯五胺的用量超过4ml，增重率可达最大；由粒径小、取代度低的原料树脂制备的胺基树脂，其增重率更为接近理论增重率。通过以上条件的优化，可以获得增重率为21.8％，N％=8.7％，担载量为6.2mmol／g-NH2的胺基树脂。此外，由残留氯含量的测定，我们还发现，原料树脂的氯不仅与伯胺还与仲胺反应。 第叁，本文初步研究了胺类柔性载体对木瓜蛋白酶的固定化。实验显示，在采用方法—用戊二醛直接进行固定化时，戊二醛的最适浓度为0.4％(体积百分比)；在采用方法二即用醛基柔性载体对木瓜蛋白酶进行固定时，它的效果要优于方法一。 最后，本文在总结前文的基础上，对今后的柔性固定化模型研究工作提出了一些建议和构想。
刘晓宁, 沈斌, 魏荣卿, 韦萍, 周华[6]2004年在《木瓜蛋白酶的的柔性固定化研究》文中提出共价结合法固定化的酶,酶与载体间的结合较牢固,不易脱落,可以长时间连续使用,所有共价固定已经成为当前最活跃的固定化方法之一。但这种固定化酶的方法也存在问题:固定化酶的酶活回收率低。其主要原因可能有叁点:一、在固定化过程中酶分子与载体的刚性碰撞,使活性降低;二、固定化的载体一般为疏水性物质,会导致酶蛋白构象发生折迭、失活;叁、酶与载体骨架相距太近,影响固定化酶的活性。为克服这些问题,人们对酶的固定化进行了深入的研究。
贾倩[7]2013年在《新型柔性树脂载体的合成及对木瓜蛋白酶的固定化研究》文中研究指明固定化酶不仅能保持游离酶高效、专一、温和的催化反应特性,还具有稳定性高、易分离回收、可重复使用、工艺简便、操作连续可控等优点,成为生物技术研究中最活跃的领域之一。而现有的酶固定化技术存在一定的不足,因此,合理选择和设计性能优良的固定化载体和简单有效的固定化方法对固定化酶的应用具有重要意义。本论文在综述了国内外传统酶固定化方法和固定化载体研究进展的基础上,总结出共价结合法是目前研究最为活跃的固定化方法之一,但该方法所得到的固定化酶活回收率偏低,本文在前人研究基础上采用酶的柔性共价结合固定法。这样可以减少酶在固定化过程中因刚性碰撞造成的酶活损失,同时又可最大限度地保留酶游离态的均相催化活性。从而解决共价结合法固定化酶活力回收率偏低的问题。因此本文选择具有比表面积大、稳定性高、机械强度高、表面含大量活泼氰基(C≡N)的大孔交联聚丙烯腈树脂微球(RAN)为研究对象,通过化学改性的方法,分别接枝具有亲水性的四乙烯五胺(TEPA)和氨基葡萄糖(GA)功能基,合成两种新型柔性树脂载体：PAN-TEPA和PAN-GA,用于木瓜蛋白酶的柔性固定化研究。本课题对柔性树脂载体的合成条件、酶固定化过程中的主要影响因素以及固定化酶和游离酶的一些酶学性质进行了研究,并得到了较好的结果,主要研究内容如下：1.以聚丙烯腈树脂微球为母体,四乙烯五胺和氨基葡萄糖作为柔性功能基,通过化学改性的方法,合成了两种具有不同功能基的新型柔性树脂载体(PAN-TEPA和PAN-GA)。探讨了反应溶剂、反应温度、反应物质量比和反应时间对树脂增重率的影响,确定了合成反应的最佳工艺条件。应用元素分析(EA)、红外光谱(FT-IR)、热重(TGA)等分析手段,对合成树脂结构进行了表征。推断柔性树脂载体的合成路径为柔性功能基中的氨基通过与聚丙烯腈微球中的氰基发生亲核加成反应而接枝到聚丙烯腈母体上,该反应原子利用率高,较好的体现了绿色化学的特征。2.以合成的两种新型柔性树脂(PAN-TEPA和PAN-GA)为载体,木瓜蛋白酶为模拟生物蛋白分子,进行固定化工艺条件的探索。通过单因素试验,研究了载体活化条件、固定化pH、给酶量、固定化温度以及固定化时间对木瓜蛋白酶固定化效果的影响。在单因素基础上,采用响应面分析法(RSM)对酶固定化工艺条件进行了进一步的优化,得到固定化酶制备的最佳工艺。PAN-TEPA载体：固定化pH6.7,加酶量1.0mg/10.0mg,固定化温度31℃；PAN-GA载体：固定化pH7.3,加酶量1.47mg/10.0mg,固定化温度31℃。在最佳优化条件下,PAN-TEPA、PAN-GA固定化酶活力分别为4.745U/mg和5.855U/mg,酶蛋白固载量分别为56.7mg/g和72.9mg/g,酶活力回收率达到了71.3%和80.6%。说明PAN-TEPA、PAN-GA作为酶的固定化载体具有潜在的应用价值。3.以酪蛋白为催化反应底物,通过游离酶和固定化酶的酶学性质实验,考察了木瓜蛋白酶经载体固定化后对酶催化活性的影响,为实际应用提供一些理论依据。结果表明：两种载体(PAN-TEPA和PAN-GA)固定化木瓜蛋白酶后,酶最适反应温度由50℃提高到60℃,且固定化酶在50℃～80℃范围内都保持了较高的酶活力。游离酶和固定化酶的最适pH值分别为6.5和7,且酶活最适pH范围从pH6-7延伸为pH5-9,增加了酶催化反应pH的波动范围。固定化酶的动力学米氏常数Km值有所减小,说明木瓜蛋白酶经载体固定化后对底物酪蛋白的亲和力增加。酶在固定化后的失活半衰期t1/2显着延长,从4.9d(游离酶)延长到28.4d (PAN-TEPA):和26.7d (PAN-GA).固定化酶的热稳定性、贮藏稳定性和对有机溶剂的耐受性都明显高于游离酶。固定化酶还具有重复使用稳定性,在循环使用8次后,仍能保持60%以上的活性。本课题采用的新型柔性树脂载体和固定化方法为木瓜蛋白酶提供了一种友好的微环境,能够较好的保持酶蛋白分子的生物活性及催化活性,具有一定的应用价值。
魏荣卿, 沈斌, 刘晓宁, 汪海萍, 王宇星[8]2005年在《壳聚糖载体柔性固定化木瓜蛋白酶》文中提出采用酶柔性固定化模型,以壳聚糖为载体,双醛淀粉为柔性链,对木瓜蛋白酶进行柔性固定化. 通过对固定化条件的优化,得出选用壳聚糖、双醛淀粉制得的柔性载体(Chitosan-DAS50)在酶用量为14.4 mg/g(酶/干球)、pH 8的条件下,固定木瓜蛋白酶18 h,所得的固定化酶活力回收率达72%,相当于采用壳聚糖-戊二醛(Chitosan-GA)手臂载体的3倍. 结果表明,酶的柔性固定化模型可以改善传统共价结合法固定化及手臂固定化酶活力回收率不高的缺陷.
汪海萍[9]2004年在《羧基化聚苯乙烯的制备和应用研究》文中指出聚合物作为试剂发展到现在,通过研究聚合物载体化反应进行有机合成已成为有机化学和功能高分子化学的一个重要的课题。聚苯乙烯作为聚合物载体的一种已为人们广泛的应用,论文选用自制的聚苯乙烯与二乙烯基苯共聚的、粒径单分散的微球作为聚合物载体,通过傅克酰基化反应在该聚苯乙烯微球上接上羧基基团制备聚合物试剂,并把该羧基化聚苯乙烯应用于固定化酶、正电子放射断层显像技术(PET)以及离子交换分离领域。在第一章中,本文概述了聚合物试剂的优点,制备方法,聚合物试剂的载体的性能、选用原则、分类和聚合物试剂的应用。在第二章中,本文用邻苯二甲酸酐作为酰基化试剂,运用傅克酰基化反应在粒径均一的聚苯乙烯微球上进行功能化得到羧基树脂,这种方法简单易行,制成的羧基树脂不同于其它由功能化单体聚合的羧基树脂,其羧基功能基团主要分布在微球的表面。在羧基树脂制备中,本文优化了反应的条件,即反应时间,反应温度等等,并着重讨论了混合溶剂中硝基苯对反应的影响。用所选优化条件,在担载量为0～2.88mmol/g范围内,可以由不同的邻苯二甲酸酐的量来控制获得预期担载量的羧基树脂。在第叁章中,本文对第二章制备的羧基化聚苯乙烯进行了叁方面的应用研究。1)测定了树脂的交换容量,pH滴定曲线,确定该树脂为典型的弱酸型阳离子交换树脂,且担载量越高的树脂其交换容量越高;2)研究了PET药物(脱氧胸腺嘧啶核苷,简称dT)的高分子化及优化了反应条件,在优化条件下羧基可完全被dT酯化,并可同时被环化;本文还通过氧化乙酰基聚苯乙烯制备了另一种羧基化聚苯乙烯,并研究了氧化反应的条件,根据氧化反应分步进行的原理,用分段的温度进行反应使氧化反应达到最优化。同时把这种氧化羧基树脂应用于PET药物(dT)的高分子化;3)基于“柔性固定化模型”的理论,用羧基化聚苯乙烯作为载体经与柔性链接枝后柔性固定化木瓜蛋白酶。研究结果发现,由本文制备的柔性载体进行酶的固定化,所得酶活力回收率是氨基手臂载体的2倍。
曾力希[10]2006年在《新型磁性高分子多孔复合微球的制备及在固定化酶上的应用研究》文中指出固定化酶可以提高酶的稳定性并增加酶的使用次数以及易于产物和底物分离等优点而被广泛地深入研究。目前固定化酶技术的核心问题集中在载体材料的制备与选择以及提高固定化酶的性质等方面。生物活性高分子磁性材料是高分子科学与生命科学之间相互渗透产生的一个重要边缘领域,其作为固定化酶载体有许多独特的优越性。 本文以亲水性甲基丙烯酸环氧丙酯为单体,二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂,在致孔剂存在下通过改进悬浮聚合法将经过表面改性的Fe_3O_4磁性纳米粒子包埋其中,合成了一种高亲水性、粒度均匀、分散性好、表面富含功能环氧基的磁性高分子多孔复合微球。以木瓜蛋白酶为模式酶,用共价结合法进行固定化酶研究。探讨了木瓜蛋白酶的最佳固定化条件,并在优化条件下制备出了高活性、性能好的固定化酶且其催化活性与游离酶相比不受显着影响。以酪蛋白为底物,研究了固定化酶的酶学性质和动力学参数。结果表明:固定化酶最适反应温度80℃,最适反应pH值为7.5,K_m值4.25mg/mL,酶活回收为55.2%。固定化酶在热稳定性、pH稳定性和操作稳定性上较游离酶均得到了较大幅度的提高。进一步将这种磁性高分子多孔复合微球胺化后修饰上柔顺、亲水的双醛淀粉链(DAS)再与酶结合制得固定化酶,结果发现单位固定化酶量略有减少,酶活回收率提高,米氏常数(K_m)较游离酶减少,酶对底物的亲和力提高。 通过研究,这种新型磁性高分子多孔复合微球能作为优良的固定化酶载体,同时表明这种磁性微球在固定化酶等相关的生物医学领域中将有着广阔的应用前景。
参考文献：
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[2]. 柔性固定化木瓜蛋白酶的制备及在酶解波纹巴非蛤中的应用[J]. 陈忻, 张俊敏, 孙恢礼, 杜健海, 袁毅桦. 食品科学. 2010
[3]. 木瓜蛋白酶的柔性固定化研究[C]. 刘晓宁, 魏荣卿, 沈斌. 2004年全国生物技术学术研讨会论文集. 2004
[4]. Mannich反应法合成新型胺基树脂及其应用研究[D]. 朱建星. 南京工业大学. 2004
[5]. 胺基柔性载体固定木瓜蛋白酶的研究[D]. 蒋雯. 南京工业大学. 2003
[6]. 木瓜蛋白酶的的柔性固定化研究[C]. 刘晓宁, 沈斌, 魏荣卿, 韦萍, 周华. 第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下). 2004
[7]. 新型柔性树脂载体的合成及对木瓜蛋白酶的固定化研究[D]. 贾倩. 浙江工商大学. 2013
[8]. 壳聚糖载体柔性固定化木瓜蛋白酶[J]. 魏荣卿, 沈斌, 刘晓宁, 汪海萍, 王宇星. 过程工程学报. 2005
[9]. 羧基化聚苯乙烯的制备和应用研究[D]. 汪海萍. 南京工业大学. 2004
[10]. 新型磁性高分子多孔复合微球的制备及在固定化酶上的应用研究[D]. 曾力希. 湖南师范大学. 2006