人RhoB基因真核表达载体的构建和表达分析

论文摘要

旨在构建带Flag标签的人RhoB基因真核表达载体并检测其表达。提取人胚肾细胞HEK-293T总RNA并反转录获得cDNA;设计引物并利用PCR技术扩增RhoB基因的ORF序列;将所扩增序列插入到带Flag标签的pCMV5真核表达载体,插入位点位于限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ之间,得到真核表达载体Flag-RhoB。酶切并测序验证该质粒的准确性。将成功构建的Flag-RhoB质粒转染乳腺癌MCF7细胞、宫颈癌HeLa细胞以及结直肠癌HCT116细胞,Western Blotting检测RhoB蛋白的表达情况;转染Mv.1.Lu细胞,免疫荧光技术检测该蛋白在细胞中的定位情况。成功扩增出RhoB基因的ORF序列;连入pCMV5中获得真核表达质粒Flag-RhoB;酶切鉴定得到590 bp大小的片段,测序结果显示连入的是RhoB基因的cDNA序列与GenBank相符。Western Blotting结果显示,该质粒可在MCF7细胞、HeLa细胞及HCT116细胞中正确表达。免疫荧光实验显示过表达的RhoB蛋白主要定位于细胞膜上,细胞质中也有分布。成功构建了带Flag标签的人RhoB基因的真核表达载体,该质粒可在细胞中顺利表达。

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文章来源

类型: 期刊论文

作者: 王梅林,牛精铃,金若其,徐莹莹,蔡晶晶,陈群力

关键词: 真核表达,免疫荧光

来源: 生物技术通报 2019年10期

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学

单位: 河南科技大学医学院

基金: 国家自然科学基金项目(31500631)

分类号: Q78

DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0213

页码: 174-179

总页数: 6

文件大小: 2682K

下载量: 143

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标签：真核表达论文;  免疫荧光论文;