首页> 正文

猪星状病毒新蛋白的初步鉴定

2020-12-02阅读(221)

猪星状病毒新蛋白的初步鉴定

论文摘要

星状病毒（Astrovirus,AstV）是单股正义的RNA病毒,主要感染哺乳类和禽类动物,同时也是一种人畜共患病病毒。猪星状病毒在猪群中感染率较高,在世界各地均有分布。星状病毒变异较快,且诸多证据表明毒株之间可以发生重组。系统发育分析和蛋白解析发现,星状病毒是一种快速进化的病毒,它通过复制选择重组交换其衣壳的部分结构域,产生细胞嗜性的扩展。显然该病毒具有跨种间传播及适应新宿主的能力,与此同时星状病毒也有许多新型的临床症状,如脑炎、痛风等相关。本研究利用生物信息学的方法,对星状病毒中两个未知蛋白的结构和功能进行预测,并基于猪星状病毒反向遗传操作系统,探究两个蛋白对病毒生物学特性的影响。1.猪星状病毒ORFX和ORFY蛋白的结构与功能预测及多克隆抗体的制备本研究通过生物信息学的方法对星状病毒的基因组进行分析,发现两个潜在的开放阅读框ORFX和ORFY,并对ORFX和ORFY编码的蛋白进行结构和功能的预测。ORFX与ORF2的5’端重叠,与ORF2的起始密码子间隔7个氨基酸;ORFY位于ORF2编码的保守区P1结构域,与ORF2的起始密码子间隔约299个氨基酸。利用蛋白质库和相关服务器对蛋白质的各级结构进行模拟与演算,了解到蛋白的理化性质、亲水性、跨膜区和二级结构域,最终建立了蛋白质的三级结构模型。根据预测的结构可以发现,ORFX中19-45aa氨基酸序列与蛋白质库中c3j9dA蛋白部分氨基酸序列的三级结构较为相似,此蛋白存在于蓝舌病病毒VP2中,根据c3j9dA蛋白推测ORFX蛋白的作用主要是作为病毒进入宿主时的pH传感器（pH sensor）。ORFY中I-62aa氨基酸序列与蛋白质库中c5nbhB蛋白羧基末端较为相似,据此可以推测ORFY蛋白可能与宿主细胞的结合相关,这或许为星状病毒的受体寻找提供了方向。为鉴定ORFX和ORFY是否能够编码病毒蛋白。对ORFX和ORFY的基因片段进行扩增,通过同源重组的方法,构建了 pET-B2M-ORFX和pET-32a-ORFY的原核表达载体。将测序正确的阳性质粒分别转化至E.coli.Rosseta和E.coli.BL21感受态细胞中,获得含重组质粒的菌株。经SDS-PAGE检测,发现两个蛋白均为包涵体蛋白。将表达的蛋白进行纯化,当蛋白浓度和纯度达到要求后即与佐剂混匀形成合适的免疫原。最后通过皮下注射的方式,免疫新西兰大白兔。每周免疫一次,免疫五次后进行心脏采血,分离出血清,获得抗ORFX和ORFY的抗体。制备的抗体经IFA检测发现两个多克隆抗体分别可以与猪星状病毒感染的细胞中表达的ORFX和ORFY蛋白发生特异性结合。说明猪星状病毒感染细胞后,开放阅读框ORFX和ORFY能够表达出预测的蛋白。2.pT7-ORFX和pT7-ORFY突变株的构建和拯救在构建的猪星状病毒pT7GX1感染性克隆基础上,通过突变PCR定点突变ORFX和ORFY的起始密码子,构建了 pT7-ORFX和pT7-ORFY两个突变克隆。同时对野生型pT7GX1和pT7-ORFX、pT7-ORFY突变克隆进行拯救,结果发现野生型pT7GX1和突变株pT7-ORFX在第五代出现了病变,而突变株pT7-ORFY却未出现病变,直到第8代才出现病变。通过IFA鉴定,在pT7-ORFX突变株中未出现ORFX蛋白的表达,在pT7-ORFY突变株中未出现ORFY蛋白的表达。据此可以推测,猪星状病毒中存在这两个蛋白,通过对病毒的RNA拷贝数进行定量检测,发现在12-24h间野生型毒株rT7GX1病毒RNA呈高效地复制,但是两个突变株12-24 h病毒RNA复制时并未有大幅度地提高,反而在24-48 h之间才出现了较高效率的复制。通过生长曲线可以发现,野生型毒株pT7GX1相比突变株pT7-ORFX和pT7-ORFY而言具有更高的病毒滴度,同样突变株pT7-ORFX的病毒滴度又高于突变株pT7-ORFY。且ORFX蛋白和ORFY蛋白在病毒复制的前中期对星状病毒RNA的复制相关,这些结果表明ORFX蛋白和ORFY蛋白对病毒的活性（viability）是非必须的,但是他们的缺失对病毒的复制有一定的影响。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 英文缩写对照表
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 星状病毒的发现
  •   1.2 星状病毒的分类
  •   1.3 星状病毒的形态结构
  •   1.4 星状病毒的基因组结构
  •   1.5 星状病毒的蛋白特征
  •   1.6 星状病毒的流行病学
  •     1.6.1 人星状病毒
  •     1.6.2 猪星状病毒
  •     1.6.3 犬星状病毒
  •     1.6.4 鸭星状病毒
  •   1.7 星状病毒的发病机制
  •   1.8 星状病毒的临床症状
  •   1.9 星状病毒的检测方法
  •     1.9.1 电子显微镜
  •     1.9.2 病毒的分离与鉴定
  •     1.9.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）
  •     1.9.4 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
  •     1.9.5 定量逆转录PCR（RT-qPCR）
  •     1.9.6 高通量测序（High-throughputsequencing,HTS）
  •   1.10 研究的目的与意义
  • 第二章 猪星状病毒ORFX和ORFY蛋白结构与功能的预测及多克隆抗体的制备
  •   2.1 结果与分析
  •     2.1.1 ORFX和ORFY蛋白质一级结构分析
  •     2.1.2 ORFX和ORFY蛋白质二级结构分析
  •     2.1.3 ORFX和ORFY蛋白质三级结构预测
  •   2.2 讨论与小结
  • 第三章 ORFX和ORFY蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
  •   3.1 材料与方法
  •     3.1.1 质粒和菌株
  •     3.1.2 材料和试剂
  •     3.1.3 实验动物
  •     3.1.4 主要仪器设备
  •     3.1.5 主要试剂配方
  •   3.2 方法
  •     3.2.1 引物设计
  •     3.2.2 基因扩增
  •     3.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测
  •     3.2.4 反应液回收
  •     3.2.5 原核表达载体的酶切与鉴定
  •     3.2.6 重组质粒的构建与鉴定
  •     3.2.7 阳性克隆小量表达与鉴定
  •     3.2.8 重组蛋白的大量表达
  •     3.2.9 包涵体蛋白的洗涤与纯化
  •     3.2.10 纯化蛋白的浓度测定
  •     3.2.11 多克隆抗体的制备
  •     3.2.12 IFA鉴定多克隆抗体的反应性
  •     3.2.13 Western blotting检测多克隆抗体与蛋白的特异性
  •   3.3 实验结果
  •     3.3.1 基因扩增结果
  •     3.3.2 重组质粒的鉴定
  •     3.3.3 小量表达鉴定
  •     3.3.4 IFA鉴定多克隆抗体反应性的结果
  •     3.3.5 WB鉴定多克隆抗体与重组蛋白的特异性
  •   3.4 讨论与分析
  • 第四章 pT7-ORFX和pT7-ORFY突变株的构建和拯救
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 病毒与细胞
  •     4.1.2 材料与试剂
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 引物设计
  •     4.2.2 基因片段克隆
  •     4.2.3 突变株拯救
  •     4.2.4 拯救毒株的鉴定
  •   4.4 实验结果
  •     4.4.1 基因定点突变克隆和测序结果
  •     4.4.2 细胞病变观察
  •     4.4.3 突变毒株的突变位点检测
  •     4.4.4 拯救病毒的生长特性
  •     4.4.5 间接免疫荧光鉴定结果
  •   4.5 讨论与分析
  • 第五章 全文结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表的学术论文
  • 附件

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 季程远

    导师: 黄伟坚

    关键词: 生物信息学,重叠基因,猪星状病毒,感染性克隆,病毒拯救

    来源: 广西大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 广西大学

    分类号: S852.651

    总页数: 89

    文件大小: 6412K

    下载量: 92

    相关论文文献

    • [1].禽星状病毒研究进展[J]. 中国家禽 2019(22)
    • [2].一株鹅星状病毒的分离鉴定[J]. 黑龙江畜牧兽医 2020(09)
    • [3].广西地区水牛群牛星状病毒分子流行病学调查[J]. 中国畜牧兽医 2020(09)
    • [4].禽星状病毒感染的流行特点[J]. 养禽与禽病防治 2018(10)
    • [5].蝙蝠星状病毒在人兽共患潜力上的研究进展[J]. 中国人兽共患病学报 2019(06)
    • [6].星状病毒鸽群分离株的全基因分析[J]. 中国动物检疫 2018(02)
    • [7].鸡星状病毒研究进展[J]. 中国家禽 2018(08)
    • [8].鹅星状病毒的分离鉴定及全基因组序列分析[J]. 畜牧兽医学报 2020(11)
    • [9].一起蛋鸡感染星状病毒的诊断[J]. 山东畜牧兽医 2020(11)
    • [10].辽西五市鸡星状病毒的检测及序列分析[J]. 锦州医科大学学报 2019(03)
    • [11].一株鸭星状病毒的分离鉴定[J]. 动物医学进展 2016(03)
    • [12].城市污水中人类星状病毒的检测及变化规律[J]. 环境科学研究 2014(06)
    • [13].猪星状病毒的分离鉴定及其致病性研究[J]. 中国畜牧兽医 2012(07)
    • [14].广西猪星状病毒分子流行病学调查[J]. 中国预防兽医学报 2012(08)
    • [15].猪嵴病毒和猪星状病毒双重RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报 2015(04)
    • [16].导致雏鹅痛风新型鹅星状病毒的分离鉴定[J]. 中国兽医学报 2018(05)
    • [17].猪星状病毒的病原学特征及检测技术研究进展[J]. 猪业科学 2015(07)
    • [18].2014年重庆地区星状病毒、札如病毒、腺病毒致儿童急性腹泻流行特点[J]. 临床儿科杂志 2016(04)
    • [19].呼和浩特市婴幼儿星状病毒性肠炎流行特征及临床分析[J]. 中国热带医学 2018(08)
    • [20].鸭星状病毒单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 中国兽医杂志 2017(04)
    • [21].川西北牦牛源牛星状病毒的检测及ORF2基因序列分析[J]. 动物医学进展 2019(10)
    • [22].猪星状病毒2型PCR检测分型方法的建立及初步应用[J]. 湖南畜牧兽医 2016(02)
    • [23].猪星状病毒ORF2基因的克隆及序列分析[J]. 中国畜牧兽医文摘 2013(09)
    • [24].成都市猫泛白细胞减少症病毒、星状病毒和肠道冠状病毒的分子流行病学调查[J]. 中国畜牧兽医 2019(05)
    • [25].一株樱桃谷种鸭胚源鸭3型星状病毒分离鉴定与序列分析[J]. 中国家禽 2018(21)
    • [26].鹅星状病毒LAMP快速检测方法的建立与应用[J]. 中国预防兽医学报 2019(11)
    • [27].鹅星状病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法的建立[J]. 江苏农业学报 2020(03)
    • [28].鹅源致病性星状病毒的分离鉴定[J]. 黑龙江畜牧兽医 2020(21)
    • [29].新型鹅星状病毒AHQJ18株的分离鉴定[J]. 江苏农业学报 2019(05)
    • [30].猪星状病毒4型SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 畜牧兽医学报 2020(02)

    标签：;  ;  ;  ;  ;  

    猪星状病毒新蛋白的初步鉴定
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕论降 版权所有 鄂ICP备12018319号-6