猪肺炎支原体ES-2株的特性研究及猪链球2型菌荚膜多糖合成相关基因的研究

论文摘要

猪呼吸道疾病是制约世界各地集约化养猪业快速发展的重要疾病之一。其中猪肺炎支原体是引起各国养殖业中猪的地方流行性呼吸道疾病气喘病的主要病原,气喘病作为一种发病率高和致死率低的慢性呼吸道疾病,主要引起猪慢性干咳、生长缓慢和对饲料利用率降低。自上个世纪三十年代该病首次被德国科学家报道以来,猪气喘病已经给世界各地养猪业造成严重的经济损失。在实际生产中,感染猪肺炎支原体的猪更容易继发感染细菌性病原,从而给养猪业造成更大的经济损失。猪链球菌2型是一种危害极大的人兽共患病病原体,能够感染人和猪,引起肺炎和脑膜炎。在当前养猪业中,猪链球菌2型经常继发感染患有支原体肺炎的保育猪肺组织,在猪链球菌2型与猪肺炎支原体的混合感染下,使保育猪的呼吸道疾病变得复杂多变,荚膜多糖在猪链球菌2型的致病过程中扮演重要角色,其中荚膜多糖的合成需要多个基因共同参与。本研究针对猪的复杂呼吸道疾病等科学问题,开展了对猪肺炎支原体的分离和培养工作;通过第三代测序技术完成了对新分离株的全基因组测序和组装,通过比较基因组学挖掘了其特有致病相关因子及致病性猪肺炎支原体的共有基因;通过动物实验评估了新分离野生株作为疫苗对猪的免疫保护效果。针对被预测参与荚膜多糖重复糖单元合成的4个基因（cps2E、cps2G、cps2J和cps2L）,通过基因缺失及生物学特性研究,确定了其在猪链球菌2型荚膜多糖合成中的作用。主要研究结果如下:1.猪肺炎支原体ES-2株的分离培养及致病性研究本研究采用了一种多点取样连续传代的方法,并通过使用Friis培养基成功从湖北恩施黑猪肺组织中分离出猪肺炎支原体,并将其命名为猪肺炎支原体ES-2株。ES-2株在改良Friis培养基中培养至48h左右,其生长滴度最高可达到1×1010CCU/mL,在固体平板上呈“煎蛋样”形态。ES-2细胞呈圆形或卵圆形,其直径在0.2-1.6μm之间,对卡那霉素（MIC=2μg/mL）最敏感。动物实验结果显示,猪肺炎支原体ES-2株对宿主具有高致病性,引起猪肺部出现典型的支原体肺炎“肉变”,支气管上皮细胞的纤毛分叉、变短甚至脱落等病变。在通过气管感染不同剂量猪肺炎支原体ES-2株（7×106CCU、7×107CCU、7×108CCU和7×109CCU）的感染组中,其中攻毒剂量为7×107 CCU的感染组发病率最高且病变最严重。2.猪肺炎支原体ES-2株的全基因组特征及比较基因组学分析本研究通过第三代测序PacBio方法完成对ES-2株全基因组的测序与组装,通过起始位点校正绘制了ES-2株基因组完成图,利用生物信息学工具预测基因组的ORFs,并进一步利用蛋白质数据库NCBI NR和UNIPORT对ORFs进行注释,利用COG数据库对注释的蛋白进行分类,通过与VFDB数据库比对挖掘其毒力因子。通过将ES-2株全基因组与从NCBI收集的161株分离自不同宿主的支原体全基因组做进化树分析,亲缘关系显示ES-2株与已报道的另外8株猪肺炎支原体、1株猪絮状支原体和2株牛差异霉形体位于同一个分支,同猪鼻支原体的亲缘关系较近,与人肺炎支原体的亲缘关系最远。为了挖掘出致病性猪肺炎支原体的共有基因,本研究利用BlASTP比较了致病性（ES-2、168、7422和7448）和非致病性（J）猪肺炎支原体的全基因组,通过设置不同的相似度（0.75、0.80、0.85、0.90、0.95和0.99）,初步筛选出34个致病性猪肺炎支原体的共有基因。通过进一步比对分析,最终在氨基酸和核苷酸水平上,只鉴别出一个致病性猪肺炎支原体的共有基因（ES-200484）。3.猪肺炎支原体ES-2株对猪的免疫保护效果研究本研究基于猪肺炎支原体ES-2株具有生长滴度高且生长速度快的优点,将其制备成猪肺炎支原体ES-2株灭活疫苗,通过给仔猪免疫接种不同剂量的猪肺炎支原体ES-2株灭活疫苗来评估该灭活疫苗的最佳免疫保护剂量。免疫保护结果显示1.6×109CCU/头份的ES-2株免疫剂量对猪的免疫保护效果最佳,1.6×107CCU/头份和1.6×108CCU/头份的ES-2株免疫剂量能达到与商业猪肺炎支原体灭活疫苗（1.6×108CCU/头份）对猪同等的免疫保护效果。4.猪链球2型菌荚膜多糖合成相关基因的研究本研究通过同源重组方法成功将4个基因（cps2E、cps2G、cps2J和cps2L）分别从猪链球菌2型中缺失,构建了4个荚膜多糖单基因缺失株（Δcps2E、Δcps2G、Δcps2J和Δcps2L）。实验结果显示,由于基因cps2E、cps2G、cps2J或cps2L的缺失,导致猪链球菌2型表面的荚膜多糖严重缺失,而且荚膜多糖中的唾液酸含量显著下降。体外和体内实验结果显示,荚膜多糖缺失突变株Δcps2E、Δcps2G、Δcps2J或Δcps2L与宿主的相互作用发生明显变化,对小鼠动物模型的致病能力显著下降。总之,本研究证实了基因cps2E、cps2G、cps2J和cps2L参与了猪链球菌2型细胞表面荚膜多糖的合成,并且进一步的研究表明这些基因在猪链球菌2型对宿主的入侵及定殖过程中发挥重要作用。

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摘要

Abstract

缩略语表（Abbreviation）

第一章文献综述

1.1 猪肺炎支原体研究进展

1.2 猪肺炎支原体的病原学研究

1.3 猪肺炎支原体的致病机制

1.3.1 猪肺炎支原体在呼吸道的增殖

1.3.2 猪肺炎支原体与宿主的相互作用

1.3.3 猪肺炎支原体引起的临床症状和肺部病变

1.4 猪肺炎支原体的流行病学调查

1.5 预防和治疗猪肺炎支原体的感染

1.5.1 疫苗预防

1.5.2 抗生素治疗

1.6 猪肺炎支原体的诊断方法

1.7 猪肺炎支原体菌株的多样性

1.8 小结与展望

第二章 M.hyopneumoniae ES-2 株的分离培养及致病性研究

2.1 研究的目的与意义

2.2 实验材料

2.2.1 菌株来源

2.2.2 病料的来源

2.2.3 实验动物

2.2.4 主要试剂及试剂盒

2.2.5 培养基及抗生素溶液的配制

2.2.6 主要溶液及其配制

2.2.7 主要实验器材

2.2.8 引物

2.3 实验方法

2.3.1 猪肺炎支原体的分离方法（多点采样,分别培养）

2.3.2 最佳离心力的选择

2.3.3 猪肺炎支原体全基因组提取操作步骤

2.3.4 PCR产物的回收与纯化

2.3.5 猪肺炎支原体的保存和复苏

2.3.6 颜色变化单位（Colour Change Unit,CCU）的测定

2.3.7 最小抑菌浓度（MIC）

2.3.8 猪肺炎支原体ES-2 株的CCU与培养基pH的关系

2.3.9 猪肺炎支原体ES-2 株在不同培养基中的生长情况

2.3.10 观察猪肺炎支原体ES-2 株形态及测量其直径

2.3.11 猪肺炎支原体ES-2 株菌落形态

2.3.12 ELISA操作步骤

2.3.13 猪肺炎支原体ES-2 株的毒力评估实验

2.3.14 攻毒后观察临床信号

2.4 结果与分析

2.4.1 临床样品的选择及处理方法

2.4.2 M.hyopneumoniae ES-2 株的分离和鉴定

2.4.3 M.hyopneumoniae ES-2 株的形态特征

2.4.4 选择M.hyopneumoniae ES-2 株生长的最佳培养基

2.4.5 不同转接量对M.hyopneumoniae ES-2 株生长的影响

2.4.6 M.hyopneumoniae ES-2 株的生长特性与pH的对应关系

2.4.7 通过时间、pH及颜色变化定量液体培养基中的M.hyopneumoniae ES-2

2.4.8 临床常用药物对M.hyopneumoniaeES-2 株的最小抑菌浓度（MIC）

2.4.9 M.hyopneumoniae ES-2 株在固体培养基上的生长特征

2.4.10 M.hyopneumoniae ES-2 株对猪致病性的研究

2.4.11 不同感染剂量M.hyopneumoniaeES-2 株在猪肺组织中的定殖能力

7CCU的 M.hyopneumoniae ES-2 感染剂量可引起最严重的猪支原体肺炎'> 2.4.12 7×10⁷CCU的 M.hyopneumoniae ES-2 感染剂量可引起最严重的猪支原体肺炎

2.5 讨论

2.5.1 猪肺炎支原体的分离方法

2.5.2 最小抑菌浓度（MIC）

2.5.3 猪肺炎支原体ES-2 株在改良Friis培养基中具有生长速度快且生长滴度高等优点

2.5.4 猪肺炎支原体ES-2 株是一株高致病性菌株

2.6 小结

第三章 M.hyopneumoniae ES-2 株的全基因组测序及致病性相关因子的挖掘

3.1 研究的目的与意义

3.2 实验材料

3.2.1 菌株来源

3.2.2 主要实验用试剂

3.2.3 主要实验器材

3.2.4 猪肺炎支原体培养基的配制

3.2.5 主要溶液的配制

3.3 实验方法

3.3.1 猪肺炎支原体ES-2 株基因组的大量提取方法

3.3.2 猪肺炎支原体ES-2 株全基因组测序

3.3.3 猪肺炎支原体ES-2 株基因组序列组装

3.3.4 猪肺炎支原体ES-2 株基因组的注释分析

3.3.5 猪肺炎支原体ES-2 株毒力相关基因比较分析

3.3.6 猪肺炎支原体基因组共线性（结构变异）分析

3.3.7 分离自不同宿主体内的162 株支原体全基因组进化树分析

3.3.8 致病性猪肺炎支原体特有基因的筛选

3.4 结果与分析

3.4.1 M.hyopneumoniae ES-2 株全基因组的提取

3.4.2 M.hyopneumoniae ES-2 株全基因组的测序与组装

3.4.3 比较ES-2 株与已报道9株M.hyopneumoniae基因组的基本特征

3.4.4 M.hyopneumoniae全基因组相似性分析

3.4.5 通过与VFDB毒力因子数据库比较,挖掘M.hyopneumoniaeES-2株中的毒力因子

3.4.6 对不同宿主来源支原体全基因组的进化分析

3.4.7 通过比较基因组学挖掘致病性M.hyopneumoniae的特有基因

3.5 讨论

3.5.1 M.hyopneumoniae ES-2 株全基因组的基本特征

3.5.2 猪肺炎支原体的全基因组的共线性分析及对ES-2 株毒力因子的挖掘

3.5.3 支原体的遗传进化分析及挖掘致病性猪肺炎支原体的共有基因

3.6 小结

第四章 M.hyopneumoniae ES-2 株灭活疫苗免疫保护效果的评价

4.1 研究的目的与意义

4.2 实验材料

4.2.1 实验用菌株

4.2.2 实验用猪肺炎支原体疫苗

4.2.3 实验动物

4.2.4 主要试剂及试剂盒

4.2.5 培养基及抗生素溶液的配制

4.2.6 主要溶液及其配制

4.2.7 实验用器材

4.2.8 引物

4.3 实验方法

4.3.1 评估M.hyopneumoniaeES-2 株灭活疫苗对猪的免疫保护实验方案

4.3.2 M.hyopneumoniae ES-2 株灭活疫苗的制备

4.3.3 猪肺炎支原体灭活疫苗的免疫接种及攻毒实验

4.3.4 猪肺组织病变评分方法

4.3.5 猪肺炎支原体血清的收集方法

4.3.6 检测免疫后猪体内抗体水平

4.3.7 HE染色及对猪肺组织气管或支气管上皮细胞纤毛观察

4.3.8 测定攻毒后猪血清及猪肺组织气管或支气管灌洗液中的抗体水平

4.4 结果与分析

4.4.1 攻毒前,免疫接种M.hyopneumoniaeES-2 株灭活疫苗的实验动物体内抗体水平

4.4.2 感染M.hyopneumoniae ES-2 株免疫组中实验动物体温变化

4.4.3 感染M.hyopneumoniae ES-2 株前后,免疫组和非免疫组中实验动物体重变化比较

4.4.4 感染M.hyopneumoniaeES-2 株前后,免疫组和非免疫组中实验动物咳嗽变化比较

4.4.5 M.hyopneumoniae ES-2 株在免疫组和非免疫组实验动物肺部定殖能力的比较

4.4.6 通过肺部病变比较不同剂量灭活M.hyopneumoniae ES-2 抗原对猪的免疫保护效果

4.4.7 扫描电镜观察疫苗对气管或支气管上皮细胞绒毛的保护效果

4.4.8 综合评估不同剂量灭活疫苗的保护效果

4.4.9 血液和支气管灌洗液中M.hyopneumoniae抗体的产生情况

4.5 讨论

4.5.1 免疫M.hyopneumoniae ES-2 株灭活疫苗后猪体内的抗体水平

4.5.2 免疫猪感染高致病性M.hyopneumoniae ES-2 株后的临床症状

4.5.3 M.hyopneumoniae ES-2 株灭活疫苗的保护效率

4.6 小结

第五章猪链球2型菌荚膜多糖合成相关基因的研究

5.1 猪链球2 型菌的研究进展

5.1.1 猪链球2 型菌的流行病学调查

5.1.2 猪链球2 型菌的毒力因子

5.1.3 研究的目的与意义

5.2 实验材料

5.2.1 菌株、质粒、细胞及培养条件

5.2.2 主要试剂

5.2.3 培养基与抗生素的配制

5.2.4 主要缓冲溶液的配制

5.2.5 引物

5.2.6 实验动物

5.3 实验方法

5.3.1 自杀性重组质粒的构建

5.3.2 猪链球菌2 型基因缺失突变株的构建

5.3.3 突变株和野生株的体外生长特性研究

5.3.4 透射电镜观察野生株和突变株表面的CPS

5.3.5 猪链球2 型菌表面唾液酸的提取

5.3.6 RNA提取方法

5.3.7 qPCR

50)'> 5.3.8 测定突变株和野生株的半数致死量(LD₅₀)

5.3.9 突变株和野生株SC19 在小鼠体内的组织载菌量

5.3.10 对Hep-2 细胞的黏附和侵入实验

5.3.11 抗吞噬实验

5.3.12 补体激活实验

5.4 结果与分析

5.4.1 ?cps2E、?cps2L、?cps2J和?cps2G突变株的构建及鉴定

5.4.2 通过qPCR检测基因的缺失是否影响其他基因的转录水平

5.4.3 基因cps2E,cps2L,cps2J或 cps2G的缺失对其生长的影响

5.4.4 基因cps2E,cps2L,cps2J和 cps2G的缺失对S.suis2 表面荚膜多糖的影响

50'> 5.4.5 测定突变株和野生株（半数致死量）LD₅₀

5.4.6 比较突变株和野生株SC19 在小鼠体内的定殖能力

5.4.7 突变株和野生株对Hep-2 细胞黏附和侵入能力比较

5.4.8 突变株和野生株抗细胞吞噬能力的比较

5.4.9 比较补体C3b在突变株和野生株表面的沉积情况

5.5 讨论

5.5.1 四个cps基因分别缺失改变了S.suis2 SC19表面CPS结构

5.5.2 S.suis2 表面CPS缺失导致其毒力显著下降

5.6 小结

结论

参考文献

附录

发表文章

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 张焱焱

导师: 陈焕春

关键词: 猪肺炎支原体,比较基因组学,免疫保护,猪链球菌型,荚膜多糖,基因缺失

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华中农业大学

基金: 国家重点研发计划课题,病原菌代谢调控机制研究(2017YFD0500202),2017.07-2020.12,国家973计划课题,病原菌表面多糖的结构与功能(2012CB518803),2012.01-2016.08

分类号: S852.6

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000015

总页数: 175

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猪肺炎支原体ES-2株的特性研究及猪链球2型菌荚膜多糖合成相关基因的研究

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